חסימת זרימת הלימפה על ידי תפירת כלי לימפה אפילנט בעכברים
14 במאי 2020
פרוטוקול לחסום את זרימת הלימפה על ידי תפירה כירורגית של כלי לימפה שונים מוצג.
שיטה זו מפריעה לזרימת הלימפה עם נזק מינימלי לתאי אנדותל הלימפה, ועם שליטה מדויקת בתזמון המצור, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כיצד זרימת הלימפה משפיעה על הונוסטזיס ותגובות חיסוניות בצומת הלימפה. עוזר להדגים את ההליך יהיה ג'ינגנה שו, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להכין מנגנון הזרקה, לחתוך כ 30 ס"מ של צינורות פוליאתילן.
חבר את קצה המחט A לקצה אחד של הצינור. בזהירות לנתק מחט אחרת, ולחבר את הצד השבור לקצה השני של צינורות פוליאתילן. ואז לצרף מחט A למזרק שחפת מיליליטר אחד.
מיד לפני השימוש, להכין 10:1 קטמין-xylazine תערובת מלוחים. לאחר הרדמה של העכבר על ידי הזרקת 250 מיקרוליטרים של תערובת קטמין/קסילאזין תוך-אפית, להבטיח הרדמה מלאה עם קמצוץ בוהן. לגלח את הפרווה סביב הרגליים עם קוצץ שיער, ולאחר מכן להחיל קרם depilatory סביב הרגל.
לאחר חמש דקות, לנגב את הפרווה שיורית ואת קרם depilatory באמצעות רקמה לחה, ולאחר מכן לנקות את הרגל עם מים סטריליים. יש לרסס 70% אתנול סביב הרגל כדי לעקר את אזור ההפעלה. מניחים את העכבר בתקרת נוטה, ולהשתמש בקלטת כירורגית כדי לחשוף את אזור הניתוח ברגל ימין.
מוזרקים תוך-תאית חמישה מיקרוליטרים של צבע כחול 1%Evans, או תשעה סנטימטרים של הנוזל מצנרת ההזרקה צינורות לתוך כרית הרגל הימנית של העכבר. לעסות בעדינות את כף הרגל כדי לעזור לנוזל להיכנס כלי הלימפה. תחת מיקרוסקופ לנתח, לאתר אתר חתך חמישה מילימטרים מהקצה התחתון של אופוסה popliteal.
באמצעות זוג מספריים, לעשות חתך קטן כחמישה מילימטרים אורך. לאחר מכן השתמש מלקעות פעולה בסדר כדי למתוח את החתך ולחשוף את כלי הלימפה איסוף. זהה את שני כלי הלימפה afferent המוביל בלוטות הלימפה popliteal.
באמצעות מחזיק מחט, בזהירות להכניס את מחט התפר בין כלי הלימפה afferent ואת העורק saphenous. משוך בעדינות את המחט סביב כלי הלימפה. בזהירות למשוך את חוט התפר, משאיר כשני סנטימטרים של חוט התפר מאחור.
השתמש במחזיק המחט כדי לעזור לקשור קשר של מנתח. לעסות בעדינות את כרית כף הרגל כדי להבטיח שום צבע כחול אוונס עובר את אתר התפר, ולאחר מכן לחתוך את החוט עודף עם מספריים. תפר את כלי הלימפה אדישים אחרים, ולאחר מכן לסגור את החתך בעור עם אותו תפר ששימש עבור כלי הלימפה.
לשליטה מזויפת, להזריק תוך אדרה חמישה microliters של 1% צבע כחול אוונס כרית רגל שמאל, לעסות את כרית הרגל. פתח את העור עם חתך, ולאחר מכן לסגור את הפצע מבלי לתתבוע את הכלי. בעת ניטור העכבר לאחר הניתוח, הרגל הימנית צריכה להראות בצקת, עם צבע כחול אוונס מתפשט לירך, בעוד רגל הבקרה תראה צבע כחול אוונס מוגבל כרית הרגל.
מיד לאחר הניתוח, להזריק תוך אדרה 10 microliters של 2%FITC הן כרית רגל ימין והן בצד שמאל. שעתיים, שש ו-12 שעות לאחר הזרקת FITC, אוספים את בלוטות הלימפה הפופליטיות מהפוסה של עכברים שעברו המתת לחץ. בזהירות להסיר את רקמת שומן perinodal סביב pLNs.
להטמיע את pLNs בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עם אזור סינוס medullary פונה לצד של עובש קריו. השתמש קריוטום להכין חלקים קפואים 20 מיקרון. כדי לקבוע את התפלגות FITC ב- pLNs, צלמו את קטעי ההקפאה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
תמונות קונפוקל שנתפסו שעתיים, שש, ו 12 שעות לאחר הזרקת FITC להראות מופחת באופן משמעותי הצטברות FITC בבלוטות הלימפה popliteal לאחר תופר את כלי הלימפה afferent. FITC שיורית ב- pLNs הצטברה באופן מועדף בסינוסים הלימפה. תמונות confocal של רקמת שומן perinodal להראות כאשר כלי הלימפה נחסמים על ידי תפור, FITC נכנס לרקמה כאשר בלוטות הלימפה סינוסים, אבל זה לא מופץ ביעילות לאורך בלוטות הלימפה.
כאשר מנסים שיטה זו, חשוב לזכור כי החדרת מחט התפר בין כלי הדם לבין כלי הלימפה היא קריטית. כישלון של צעד זה עלול לשבור את כלי הדם. לאחר ביצוע שיטה זו, ניתן לחסן עכברים עם זיהום או גירוי חיסוני אחר כדי ללמוד כיצד זרימת הלימפה מווסתת את ההגנה החיסונית.
הפונקציה של זרימת הלימפה אינה מובנת היטב. שיטה זו יכולה לשמש לחקר נדידת תאים בצומת הלימפה בהעדר זרימת הלימפה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לחסימת זרימת לימפה באמצעות תפרים כירורגיים של כלי לימפה אפרנטיים. השיטה מאפשרת נזק מינימלי לתאי אנדותל לימפטיים ובקרה מדויקת על עיתוי החסימה, ובכך היא מקלה על חקר השפעת זרימת הלימפה על ההומאוסטזיס ותגובות חיסוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי העצבים
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של כלי הדם
רקע
- כלי הלימפה ממלאים תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות.
- הבנת זרימת הלימפה חיונית לחקר ההומאוסטזיס.
- שיטות נוכחיות עלולות לגרום לנזק לתאי אנדותל לימפטיים.
- בקרת זרימה מדויקת של הלימפה נחוצה לצורך דיוק ניסויי.
מטרת המחקר
- להציג פרוטוקול כירורגי לחסימת זרימת לימפה.
- לחקור את השפעות זרימת הלימפה על תגובות חיסוניות.
- למזער נזקים למבנים לימפטיים במהלך הניסוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תפירה כירורגית של כלי לימפה אפרנטיים.
- הכנת מכשיר הזרקה באמצעות צינורות פוליאתילן.
- חיבור מזרקים ומחטים להזרקה מדויקת.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי סטודנט לתואר מתקדם.
תוצאות עיקריות
- השיטה חוסמת ביעילות את זרימת הלימפה.
- נצפה נזק מינימלי לתאי אנדותל לימפטיים.
- הושגה בקרה מדויקת על תזמון החסימה.
- ההליך מאפשר מחקר מפורט של התפקוד הלימפטי.
מסקנות
- הפרוטוקול הניתוחי מהווה כלי בעל ערך למחקר לימפטי.
- הבנת זרימת הלימפה יכולה להרחיב את הידע על תגובות חיסוניות.
- ניתן להתאים שיטה זו למערכים ניסיוניים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חסימת זרימת הלימפה באמצעות תפירה כירורגית של כלי לימפה אפרנטיים מאפשרת בחינה מדויקת של התפקוד הלימפטי בהומיאוסטזיס חיסוני ובהובלת אנטיגנים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) בפיתוח תרופות אימונו-מודולטוריות על ידי בידוד מנגנונים תלויי לימפה. היא מספקת כלי להפחתת סיכונים מנגנוניים עבור מודלים פרה-קליניים המעריכים מודולציה של המיקרו-סביבה בבלוטת הלימפה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות תלויות-לימפה במסלולי בקרה חיסוניים.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקת השערות לגבי השפעת זרימת הלימפה על ביטוי כימוקינים ותפקוד של ורידולי אנדותל גבוהים (high endothelial venules).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות חסמה לימפתית מתוקפות להערכת השפעות של תרכובות על תעבורת אנטיגנים המתווכת על ידי הלימפה.
- ערך תפעולי: אספקת תזמון חסימה הניתן לשחזור עבור תנאי בדיקה סטנדרטיים בסריקת תפקוד לימפתי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול של מיקרו-סביבת קשרי הלימפה הרלוונטי למחלה במחקרי דלקת ותגובה חיסונית.
- ערך תפעולי: מאפשר המשכיות משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שמירה על שלמות המבנה הלימפטי במהלך ההתערבות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני של תרופיהות למודולציה של הלימפה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בחקירה מכניסטית של זרימת לימפה בתנועת תאי חיסון ובהומאוסטזיס של קשרי הלימפה (LN).
- סריקה: מאפשר הערכה כמותית של הצטברות אנטיגן FITC כמדד תפקודי ליעילות החסימה הלימפתית.
- אנליטיקה: מקל על כימות של התפלגות אנטיגן בקשרי לימפה וברקמה פרי-נודלית באמצעות דימוי קונפוקלי.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין תפקוד לימפטי לבין תוצאות תגובה חיסונית במודלים פרה-קליניים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה כירורגית לשימוש חוזר לצורך ויסות זרימת לימפה על פני מספר תיקופי מטרות הקשורות למערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות לימפטיות-חיסוניות על ידי מתן שליטה זמנית מדויקת בחסימה.
- ערך תפעולי: ממזער נזק לתאי אנדותל, ובכך שומר על חיות הרקמה לצורך ניטור חיסוני ארוך טווח.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בפיתוח אימונומודולטורים על ידי הבהרת מנגנוני פעולה תלויי-לימפה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס תלות בזרימה הלימפתית לצורך הגנה חיסונית.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה בזיהוי כלי דם ובטכניקת תפירה.
- דורש מיקרוסקופ דיסקציה ומכשור מדויק לצורך גישה לכלי לימפה אפרנטיים.
- מחייב ניטור פוסט-אופרטיבי סטנדרטי לבדיקת בצקת ודיפוזיה של צבע כתיקוף פונקציונלי.
- כולל שיקולי התאמה בין זני עכברים ושונות בכלי הלימפה.
- מוגבל למחקרי חסימה אקוטיים בשל אפשרות לremodeling לימפטי מפצה לאורך זמן.
