Name: התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למד שיטה מותאמת להתמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של עכבר במבחנה. הפרוטוקול מספק יעילות גבוהה ועלות נמוכה למחקר נוירוביולוגיה ותהליכי נוירוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31501099) ואת בגיל העמידה וצעיר של מחלקת החינוך של מחוז חוביי, סין (לא. רבעון 20191104). כמו כן, אנו מודים לפרופסור וונשנג דנג מאוניברסיטת ווהאן למדע וטכנולוגיה על שסיפק את קווי תאי הגזע העובריים של העכבר A2lox.

1. תרבות תאי גזע עובריים של עכבר
<ol><li>הכינו 0.1% מנות או צלחות של תרביות תאים מצופות ג'לטין.<ol>
<li>הוסיפו 2 מ"ל של ג'לטין מעוקר 0.1% (0.1% w/v במים) למנות תרבית תאים 60 מ"מ. רוק בעדינות כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות תרבות התא.</li>
		<li>שים את הכלים לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר ציפוי במשך 1 שעה.</li>
		<li>הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים. הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאי גזע עובריים של עכבר (A2lox ו-129) תרבות<ol>
<li>דגירה mESCs (A2lox ו 129) תאים ב 0.1% ג'לטין מצופה 60 מ"מ כלי תרבות התא במדיום צמיחה mESC ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO2 חממה, בהתאמה. מדיום הצמיחה mESC מורכב 85% נוקאאוט DMEM/F12, 15% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 nM CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו 0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK). התראה: β-מרקפטותנול הוא דליק ויש לו רעילות שאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולחבוש מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.</li>
		<li>שנה את מדיום הצמיחה mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו 129.</li>
		<li>כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין למנה. בעדינות רוק במשך 30 s כדי להבטיח אפילו כיסוי של טריפסין על כל התאים.</li>
		<li>השאר את התאים במשך כ 1 דקות כדי לנסותize ולאחר מכן להסיר את טריפסין באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה mESC למנה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפוך את השעיית תא יחיד.</li>
		<li>לספור את הצפיפות של התאים בהשעיה במדויק ככל האפשר באמצעות hemocytometer.</li>
		<li>חלק את התאים ל- 7 קבוצות ו לגרום לבידול באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בידול מ- MESCs ל- NPCs (שלב I)
<ol><li>מכינים 0.1% צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין או כיסויים.<ol>
<li>לפני השימוש, להכין 0.1% ג'לטין מצופה 6-well צלחות או coverslips כמו בשלב 1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 1 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל באר 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.</li>
		<li>דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 אינקובטור עבור 6 שעות כדי לאפשר התקשרות.</li>
		<li>לאחר ההחזקה, להוציא את התאים מן האינקובטור, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.</li>
		<li>מוסיפים 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I(טבלה 1)לכל באר ומחזירים את התאים לאינקובטור.</li>
		<li>השאירו את התאים לבידול במשך 8 ימים. החלף את מדיום הבידול הבסיסי אני כל יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 2 (טבלה 1)<ol>
<li>הוסף 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 °C (79 °F) באינקובטור 5% CO2.</li>
		<li>לאחר יומיים, להעביר אגרגטים תא לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend הגופים העובריים. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים.</li>
		<li>בדקו את היווצרות הגופים העובריים מתחת למיקרוסקופ (איור 2A).</li>
		<li>לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3. זרעים על 50 גופים עובריים ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.</li>
		<li>הכינו מלאי RA כל-טרנס של 1 מ"מ (ב-DMSO) וחסנו הרחק מהאור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחר אריזת משנה. הערה: RA אינו יציב, ויש להקדיש תשומת לב כדי להרחיק אותו מאור ולצמצם מגע אוויר במהלך הכנת מלאי RA.</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.</li>
		<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 4 ימים.</li>
		<li>לשנות את כל 2 מ"ל של בינוני בידול בסיסי I (עם 1 μM RA) כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (טבלה 1)<ol>
<li>צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I. להשאיר במשך 2 ימים להיווצרות גוף עוברי ב 37 °C (69 °F) באינקובטור 5% CO2.</li>
		<li>בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ (איור 2B).</li>
		<li>להעביר צבירות תאים לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend אותם.</li>
		<li>זרעים על 50 גופים עובריים לתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.</li>
		<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 6 ימים. שנה את כל מדיום הבידול הבסיסי I (עם 1 מיקרומטר RA) כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 4 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לאחר הקובץ המצורף, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 4 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר (ריכוז העבודה הוא 1 מיקרומטר) כדי לגרום לבידול עוד 4 ימים.</li>
		<li>בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 5 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).</li>
		<li>עבור אינדוקציה RA הבאים, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של μM 1. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לגרום לבידול עוד 6 ימים.</li>
		<li>בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 6 (טבלה 1)<ol>
<li>צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של N2B27 בינוני II (טבלה 1) כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים.</li>
		<li>ביוםהשני, לאסוף את צבירות התא כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3 ולהזרים מחדש את הגופים העובריים באמצעות 10 מ"ל של N2B27 בינוני II טרי.</li>
		<li>לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F). בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ.</li>
		<li>ביום הרביעי, לאסוף גופות עובריות. זרעים על 50 גופים עובריים לכל באר על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם 2 מ"ל של N2B27 בינוני II.</li>
		<li>הוסף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר ולגרום בידול עוד 4 ימים. החלף את המדיום כולו (N2B27 בינוני II עם 1 μM RA) כל יומיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 7 (טבלה 1)<ol>
<li>זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.</li>
		<li>לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של N2B27 בינוני II לכל באר ולאפשר בידול במשך 8 ימים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 חממה.</li>
		<li>שנה את כל המדיום II של N2B27 כל יומיים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. התבוננות במורפולוגיה של התא
<ol><li>בדוק את מצב הבידול של 7 הקבוצות שהוזכרו לעיל מדי יום תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך.</li>
	<li>בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים של כל קבוצה ב- D8.</li>
</ol>4. כתמי כשל חיסוני
<ol><li>הכנה לדוגמה: זרעי mESCs על 0.1% כריכות מצופות ג'לטין ולאפשר בידול במשך 8 ימים באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו בשלב 2.</li>
	<li>לשטוף: ביום8, לקחת את הדגימות מן האינקובטור ולהסיר את מדיום הבידול על ידי שאיפה. יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת ב-1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.</li>
	<li>קיבוע: להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל מדגם ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף: לאחר קיבעון, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>חדירה: להוסיף 1 מ"ל של 0.2% TritonX-100 ב PBS לכל מדגם ולהשאיר במשך 8 דקות ב RT.</li>
	<li>לשטוף: לאחר חדירה, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>חסימה: הוסף 1 מ"ל של סרום עזים 10% ב- PBS לכל מדגם ודגירה ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני<ol>
<li>לדלל את הנוגדן אנטי נסטין ביחס של 1:100 באמצעות 5% סרום עזים ב PBS.</li>
		<li>החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף: להסיר את הנוגדן ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני<ol>
<li>לדלל את אלקסה פלואור 488-שכותרתו עז נגד עכבר IgG ביחס של 1:500 באמצעות 5% סרום עזים ב- PBS.</li>
		<li>החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה בחושך במשך 2 שעות ב RT. הערה: לאחר החלת נוגדן משני פלואורסצנטי, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף: להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.</li>
	<li>כתמים גרעיניים והרכבה<ol>
<li>הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה DAPI על המיקרו-מפולת הנקייה.</li>
		<li>בזהירות להוציא את הדגימות מן הצלחות ומניחים את המדגם על גבי המדיום הרכבה DAPI עם התא עם הפנים כלפי מטה. השאירו בחושך במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>הסר מדיום הרכבה עודף של DAPI עם נייר סופג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית<ol>
<li>מניחים את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות את האות עבור DAPI ואלכסה פלואור 488 באמצעות מסננים נאותים.</li>
		<li>בחר באופן שווה ואקראי 10-15 שדות חזותיים שונים עבור כל דגימה והקלט את התמונות במצלמת CCD.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. בידול מ- NPCs לנוירונים (שלב II)
<ol><li>הכן נגזרות mESC תחת בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (8 ימים, טבלה 1) כמפורט בשלב 2.4, בעל יעילות הבידול הגבוהה ביותר (ראה איור 3). הערה: לאחר שלב I בידול, בקרת איכות צריכה להתבצע באמצעות תצפית מורפולוגיה התא ו immunofluorescence הבדיקה שהוזכרו לעיל, כדי להבטיח NPCs בריא ותשואה גבוהה.</li>
	<li>זרעים על 5 x 105 נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. חלק באופן אקראי את נגזרות mESC ל- 3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.</li>
	<li>מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות. לשטוף אותם פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני I, N2B27 בינוני I ו N2B27 בינוני II(טבלה 2),בהתאמה, לכל באר של הקבוצות לעיל.</li>
	<li>מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ולאפשר להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.</li>
	<li>בדוק את מצב הבידול ותעד את השינויים המורפולוגיים כאמור בשלב 3.</li>
	<li>ביום 18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin השלישי חיובי) ולקבוע את יעילות הבידול של 3 פרוטוקולים באמצעות בשלב 4.</li>
</ol>

<ol><li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons%3A+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li>
<li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genomic+Medicine%2C+Biomarkers%2C+and+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li>
<li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li>
<li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+%28NGF%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li>
<li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li>
<li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li>
<li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li>
<li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells%3A+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li>
<li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li>
<li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57(2009).</li>
<li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li>
<li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%3A+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li>
<li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953(2017).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li>
<li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li>
<li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li>
<li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).</li>
<li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את ההבחנה מ NPCs לתוך נוירונים. כדי להבטיח הצלחה, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר למספר שלבים קריטיים.
ראשית, המצב הבריא של גופים עובריים הוא המפתח לכל תהליך הבידול. היווצרות גוף עוברי תלת מי...

תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים1. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית4, באמצעות מולקולות קטנות5, באמצעות microenvironment מטריצה 3D6, ואת טכניקת תרבות משותפת7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.
כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד נסטין [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-&בטא;-טובולין III המיוצר בארנב</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T2200</td><td>המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C והגנה מפני</td></tr><tr><td>תוסף B-27 קל (50X),</td><td>Gibco</td><td></td> ללא סרום <td>17504044 מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, ולהגן מפני אור</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני אור</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td> <td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>אולימפוס</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>ג'יבקו</td><td>CM0635B</td><td>מאוחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>ג'יבקו</td><td>35050061</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>מאגר דילול נוגדנים ראשוני צביעת אימונול</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>מאוחסן ב-4 מעלות; </td></tr><tr><td>החלפת סרום C KnockOut</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית</td></tr> של <tr><td>גורם מעכב לוקמיה</td><td>סיגמא</td><td>L5283</td><td>אנושי המאוחסן ב-20 מעלות; </td></tr><tr><td>מדיום הרכבה C עם DAPI - מימי, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני</td></tr><tr><td>תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM</td> קלה <td>Gibco</td><td>11140076</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; </td></tr><tr><td>תוסף C N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולהגן מפני</td></tr><tr><td>אור סרום עיזים רגיל</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Neurobasal בינוני</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>צלחת חיידקים לא דביקה</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td> <td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>מאוחסנת בטמפרטורה של -80 מעלות; C ולהגן מפני</td></tr><tr><td>תאי גזע עובריים של עכבר מזן 129</td> קל <td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>מתוחזק במערכת תרבית ללא מזין</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (ללא DMSO)</td> <td>ZENOAQ</td><td>גזע Cellbanker ללא DMSO</td><td>מאוחסן ב-20 מעלות; ג, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין 0.25% (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C ולהגן מפני אור</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>6 - צלחת באר</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 60 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

היווצרות גוף עוברי של יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים פועלת בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I). כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי המקדם בצורה הטובה ביותר את הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I), 7 פרוטוקולים נבדקו הן על A2lox ו 129 mESCs (טבלה 1) ואת מצב הבידול של כל קבוצה היה במעקב באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שמוצג באיור 3A, רוב נגזרות A2lox ו-129 תחת טיפול "היווצרות גוף עוברי בן יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים" (שלב I-protocol 3) הראו מורפולוגיות מוערמ...

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

התמיינות עצבית ממבחני עכבר היא מודל מצוין להמחשת מנגנוני המפתח המעורבים בנוירוגנזה. אנו מדגימים שיטה אופטימלית לנוירוגנזה עוברית באמצעות אסטרטגיית סינון טורו של החברה. לטכניקה זו יתרונות של יעילות גבוהה, עלות נמוכה ותפעול קל, והיא מתאימה לפופולריות בקרב מעבדות.זהו כלי רב עוצמה למחקר במדעי המוח. כדי לבצע התמיינות באמצעות פרוטוקול ראשון, זרעו 20,000 תאי גזע עובריים של עכבר בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר של צלחת שש בארות מצופה ג'לטין 0.1%. לאחר חיבור התאים, שטפו את התאים בשני מיליליטר PBS והוסיפו שני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר, ואז החזירו את התאים לחממה.אפשר לתאים להתמיין במשך שמונה ימים, והחלף את המדיום כל יומיים. כדי לבצע את הפרוטוקול השני, הוסף 1.5 מיליון תאי גזע עובריים של עכבר לתוך צלחת חיידקים לא דביקה ב-10 מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי. לאחר יומיים העבירו את אגרגטי התאים לצינורות צנטריפוגות של 15 מיליליטר ותנו להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.הסר את הסופרנטנט והוסף 10 מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי טרי כדי להשעות מחדש את הגופים העובריים. לאחר מכן שתלו אותם מחדש בכלי חדש שאינו דביק ודגרו אותם למשך יומיים נוספים. אוספים וזורעים כ -50 גופים עובריים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על צלחת שש בארות מצופה ג'לטין.להשראת חומצה רטינואית, הוסף שני מיקרוליטר של מלאי RA לכל באר לריכוז סופי של מיקרומולר אחד. מחזירים את הצלחת לחממה וממיינים את התאים למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע התמיינות באמצעות פרוטוקול שלישי, חזור על פרוטוקול 2 אך אפשר רק יומיים להיווצרות גוף עוברי ושישה ימים לזירוז RA.בקרת איכות של היווצרות גופים עובריים צריכה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה. רק בעלי ליבות בהירות יכולים להבדיל בהצלחה בתהליך שלאחר מכן. לפרוטוקול הרביעי, זרעו 20,000 תאי גזע עובריים של עכברים לבאר לתוך הצלחות המצופות בג'לטין ועקבו אחר הפרוטוקול הראשון.לאחר שאפשרו לתאים להתמיין במשך ארבעה ימים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של כל מלאי הטרנס RA לכל באר ודגרו על הצלחת למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע פרוטוקול 5, חזור על פרוטוקול 4 אך התחל בזירוז RA לאחר יומיים בלבד של התמיינות. בפרוטוקול השישי, שתלו 1.5 מיליון תאי גזע בצלחת חיידקים לא דביקה ב-10 מיליליטר של N2B27 בינוני 2 ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי.לאחר יומיים, אספו אגרגטים של תאים כפי שתואר קודם לכן והשעו מחדש את הגופים העובריים עם 10 מיליליטר של N2B27 בינוני טרי. שתלו אותם מחדש בכלי חיידקים חדש שאינו דביק ואפשרו התמיינות למשך יומיים נוספים. ביום הרביעי, אספו וזרעו כ -50 גופים עובריים לבאר על שש צלחות באר מצופות ג'לטין עם שני מיליליטר של N2B27 בינוני שתיים.הוסף שני מיקרוליטרים של כל מלאי הטרנס RA לכל באר וגרם להתמיינות למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע את הפרוטוקול השביעי, זרעו כ-20,000 תאים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על הלוחות המצופים בג'לטין. לאחר חיבור התא ושתי שטיפות עם PBS, הוסף שני מיליליטר של N2B7 בינוני, שניים לכל באר ואפשר לתאים להתמיין במשך שמונה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר ביצוע התמיינות שלב ראשון באמצעות פרוטוקול שלוש, זרע כ-500,000 נגזרות של תאי גזע עובריים של עכברים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על הלוחות המצופים בג'לטין 0.1%. חלקו באופן אקראי את הנגזרות לשלוש קבוצות על מנת לבדוק פרוטוקולי התמיינות תלת-פאזיים שני. דגרו את הצלחת למשך שש שעות, ואז שטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS והוסיפו שני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי N2B27 בינוני אחד או N2B27 בינוני שניים לכל באר, תלוי בפרוטוקול.הכניסו את הלהבים לחממה ואפשרו לתאים להתמיין למשך 10 ימים נוספים, והחליפו את המדיום המתאים כל יומיים. שבעה פרוטוקולים נבדקו כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי להתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים בתאי קדם כלליים או NPCs. הפרוטוקולים נבדקו הן על מנעולי A2lox והן על 129 תאים ומצב ההתמיינות של כל קבוצה נוטר באמצעות מיקרוסקופ אור.רוב נגזרות A2lox ו-129 הראו מורפולוגיות מוערמות היטב ודמויות נויריט תחת פרוטוקול 3 המצביע על היווצרות NPCs. עם זאת, תאים שהתמיינו באמצעות פרוטוקול 2 נראו אפופטוטיים, מה שעשוי לנבוע ממחסור בחומרים מזינים בתוך הגוף העוברי. כדי לאשר עוד יותר את היווצרותם של NPCs, זוהו תאים חיוביים לנסטין באמצעות מבחן אימונופלואורסצנטי.פרוטוקול 3 הביא לכך שהאחוז הגבוה ביותר של תאים חיוביים לנסטין הגיע ל-78 ו-69% בנגזרות A2lox ו-129 בהתאמה. שלושה פרוטוקולים נבדקו להתמיינות של NPCs לנוירונים. נקבע כי פרוטוקול 3 גורם בצורה היעילה ביותר להתמיינות.לרוב נגזרות A2lox ו-129 בשלב השני של פרוטוקול 3 היו מבנים דמויי נוירונים ממושכים עם נויריטים ברורים והרחבות גוף התא. בדיקות אימונופלואורסצנטיות אישרו עוד יותר את יצירת הנוירונים עם אחוז התאים החיוביים של בטא טובולין עד 68 ו-59% בנגזרות A2lox ו-129 בהתאמה באמצעות פרוטוקול שלוש. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לוודא שבדיקות העכבר בריאות ולא מובחנות לפני ההתמיינות.בנוסף, יש לבצע בקרת איכות קפדנית לאחר היווצרות בגופי קידוח ולפני התמיינות שלב שני. טכניקה זו מספקת מודל סטנדרטי לחוקרי נוירוביולוגיה וביולוגיה התפתחותית וצפויה להיות כלי רב עוצמה להמחשת המנגנונים העיקריים המעורבים בנוירוגנזה.

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

הסרטון הציג שיטה לתרבית תאים למיון תאי אב עצביים לנוירונים. על ידי דגירה של תאים בתווך עשיר בחומרים מזינים בתוספת גורמי גדילה, תאי האב התבגרו לנוירונים עם אקסונים ודנדריטים מפותחים. חומר מייצב הבטיח את קיום התא והגן מפני נזקי חמצון לאורך כל תהליך ההתמיינות.

התמיינות של תאי אב עצביים לתאי עצב

סרטון זה מדגים טכניקה להתמיינות תאי גזע עובריים לאוכלוסייה מרושתת של נוירונים עם סינפסות מתפקדות. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהתמיינות תאי גזע עובריים לנוירונים, השראת היווצרות רשת עצבית והעשרת התרבית עם נוירונים מרושתים.

התמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לאוכלוסיית נוירונים מרושתת

מתואר פרוטוקול מותאם אישית להבדיל תאי ES של עכברים לאוכלוסיות מוגדרות של נוירונים טהורים ביותר המציגים סינפסות מתפקדות והתנהגות רשת מתעוררת. ניתוח אלקטרופיזיולוגי מדגים את אובדן ההעברה הסינפטית בעקבות חשיפה לסרוטיפים של נוירוטוקסין בוטולינום /A-/G ורעלן עצבי טטנוס.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

למד שיטה מותאמת להתמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של עכבר במבחנה. הפרוטוקול מספק יעילות גבוהה ועלות נמוכה למחקר נוירוביולוגיה ותהליכי נוירוגנזה.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

גלה סרטונים נוספים