התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

התמיינות עצבית ממבחני עכבר היא מודל מצוין להמחשת מנגנוני המפתח המעורבים בנוירוגנזה. אנו מדגימים שיטה אופטימלית לנוירוגנזה עוברית באמצעות אסטרטגיית סינון טורו של החברה. לטכניקה זו יתרונות של יעילות גבוהה, עלות נמוכה ותפעול קל, והיא מתאימה לפופולריות בקרב מעבדות.

זהו כלי רב עוצמה למחקר במדעי המוח. כדי לבצע התמיינות באמצעות פרוטוקול ראשון, זרעו 20,000 תאי גזע עובריים של עכבר בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר של צלחת שש בארות מצופה ג'לטין 0.1%. לאחר חיבור התאים, שטפו את התאים בשני מיליליטר PBS והוסיפו שני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר, ואז החזירו את התאים לחממה.

אפשר לתאים להתמיין במשך שמונה ימים, והחלף את המדיום כל יומיים. כדי לבצע את הפרוטוקול השני, הוסף 1.5 מיליון תאי גזע עובריים של עכבר לתוך צלחת חיידקים לא דביקה ב-10 מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי. לאחר יומיים העבירו את אגרגטי התאים לצינורות צנטריפוגות של 15 מיליליטר ותנו להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.

הסר את הסופרנטנט והוסף 10 מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי טרי כדי להשעות מחדש את הגופים העובריים. לאחר מכן שתלו אותם מחדש בכלי חדש שאינו דביק ודגרו אותם למשך יומיים נוספים. אוספים וזורעים כ -50 גופים עובריים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על צלחת שש בארות מצופה ג'לטין.

להשראת חומצה רטינואית, הוסף שני מיקרוליטר של מלאי RA לכל באר לריכוז סופי של מיקרומולר אחד. מחזירים את הצלחת לחממה וממיינים את התאים למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע התמיינות באמצעות פרוטוקול שלישי, חזור על פרוטוקול 2 אך אפשר רק יומיים להיווצרות גוף עוברי ושישה ימים לזירוז RA.

בקרת איכות של היווצרות גופים עובריים צריכה להתבצע באמצעות מיקרוסקופיה. רק בעלי ליבות בהירות יכולים להבדיל בהצלחה בתהליך שלאחר מכן. לפרוטוקול הרביעי, זרעו 20,000 תאי גזע עובריים של עכברים לבאר לתוך הצלחות המצופות בג'לטין ועקבו אחר הפרוטוקול הראשון.

לאחר שאפשרו לתאים להתמיין במשך ארבעה ימים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של כל מלאי הטרנס RA לכל באר ודגרו על הצלחת למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע פרוטוקול 5, חזור על פרוטוקול 4 אך התחל בזירוז RA לאחר יומיים בלבד של התמיינות. בפרוטוקול השישי, שתלו 1.5 מיליון תאי גזע בצלחת חיידקים לא דביקה ב-10 מיליליטר של N2B27 בינוני 2 ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי.

לאחר יומיים, אספו אגרגטים של תאים כפי שתואר קודם לכן והשעו מחדש את הגופים העובריים עם 10 מיליליטר של N2B27 בינוני טרי. שתלו אותם מחדש בכלי חיידקים חדש שאינו דביק ואפשרו התמיינות למשך יומיים נוספים. ביום הרביעי, אספו וזרעו כ -50 גופים עובריים לבאר על שש צלחות באר מצופות ג'לטין עם שני מיליליטר של N2B27 בינוני שתיים.

הוסף שני מיקרוליטרים של כל מלאי הטרנס RA לכל באר וגרם להתמיינות למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לבצע את הפרוטוקול השביעי, זרעו כ-20,000 תאים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על הלוחות המצופים בג'לטין. לאחר חיבור התא ושתי שטיפות עם PBS, הוסף שני מיליליטר של N2B7 בינוני, שניים לכל באר ואפשר לתאים להתמיין במשך שמונה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר ביצוע התמיינות שלב ראשון באמצעות פרוטוקול שלוש, זרע כ-500,000 נגזרות של תאי גזע עובריים של עכברים בשני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי לכל באר על הלוחות המצופים בג'לטין 0.1%. חלקו באופן אקראי את הנגזרות לשלוש קבוצות על מנת לבדוק פרוטוקולי התמיינות תלת-פאזיים שני. דגרו את הצלחת למשך שש שעות, ואז שטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS והוסיפו שני מיליליטר של מדיום התמיינות בסיסי N2B27 בינוני אחד או N2B27 בינוני שניים לכל באר, תלוי בפרוטוקול.

הכניסו את הלהבים לחממה ואפשרו לתאים להתמיין למשך 10 ימים נוספים, והחליפו את המדיום המתאים כל יומיים. שבעה פרוטוקולים נבדקו כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי להתמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים בתאי קדם כלליים או NPCs. הפרוטוקולים נבדקו הן על מנעולי A2lox והן על 129 תאים ומצב ההתמיינות של כל קבוצה נוטר באמצעות מיקרוסקופ אור.

רוב נגזרות A2lox ו-129 הראו מורפולוגיות מוערמות היטב ודמויות נויריט תחת פרוטוקול 3 המצביע על היווצרות NPCs. עם זאת, תאים שהתמיינו באמצעות פרוטוקול 2 נראו אפופטוטיים, מה שעשוי לנבוע ממחסור בחומרים מזינים בתוך הגוף העוברי. כדי לאשר עוד יותר את היווצרותם של NPCs, זוהו תאים חיוביים לנסטין באמצעות מבחן אימונופלואורסצנטי.

פרוטוקול 3 הביא לכך שהאחוז הגבוה ביותר של תאים חיוביים לנסטין הגיע ל-78 ו-69% בנגזרות A2lox ו-129 בהתאמה. שלושה פרוטוקולים נבדקו להתמיינות של NPCs לנוירונים. נקבע כי פרוטוקול 3 גורם בצורה היעילה ביותר להתמיינות.

לרוב נגזרות A2lox ו-129 בשלב השני של פרוטוקול 3 היו מבנים דמויי נוירונים ממושכים עם נויריטים ברורים והרחבות גוף התא. בדיקות אימונופלואורסצנטיות אישרו עוד יותר את יצירת הנוירונים עם אחוז התאים החיוביים של בטא טובולין עד 68 ו-59% בנגזרות A2lox ו-129 בהתאמה באמצעות פרוטוקול שלוש. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לוודא שבדיקות העכבר בריאות ולא מובחנות לפני ההתמיינות.

בנוסף, יש לבצע בקרת איכות קפדנית לאחר היווצרות בגופי קידוח ולפני התמיינות שלב שני. טכניקה זו מספקת מודל סטנדרטי לחוקרי נוירוביולוגיה וביולוגיה התפתחותית וצפויה להיות כלי רב עוצמה להמחשת המנגנונים העיקריים המעורבים בנוירוגנזה.