Name: הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו להעריך מצב רדוקס תת-תאי באמצעות בדיקה פלואורסצנטית רגישה לחמצון. שיטה זו מאפשרת כימות לא פולשני של מצב החמצון בתאים שלמים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המבנה ו רקומביננטי אדנווירוס להבעת ציטוסול ספציפי מסוים בתאים נוצרו במעבדה של פול ט. שואקר, PhD, פרייברג בית הספר לרפואה, אוניברסיטת נורת'ווסטרן, ו ViraQuest Inc., בהתאמה. מחקר זה היה נתמך על ידי המרכז ללימודי תגובה מארחת לטיפול בסרטן המענק P20GM109005 דרך המכון הלאומי NIH של מרכזים למדעי הרפואה הכללית של מצוינות מחקר ביו-רפואי (COBRE כולשי), המכון הלאומי של מערכות מדעי הרפואה הכללית פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה תוכנית ההכשרה מענק T32 GM106999, קרן UAMS/ הזרם cy, ליבת מתקן הליבה היה נתמך בחלקו על ידי המרכז לפתוגנזה ומארח תגובות דלקתיות להעניק P20GM103625 באמצעות הקצעם COBRE. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. ATA נתמכת על ידי מועצת המחקר המדעית והטכנולוגית של טורקיה (TUBITAK) 2214-מלגה.

הערה: פרוטוקול זה הותאם במיוחד ל-70%-80% בתאים מד א-231-MB. עבור קווי תאים אחרים, יש למטב מחדש את מספר התאים וריבוי הזיהומים (מוי).
1. הכנת תאים (יום 1)
<ol><li>שמור מד א-MB-231 קו תא ב 75 ס"מ2 מבחנות עם 10 מ ל של מדיום שונה של הנשר של Dulbecco (dmem) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (fbs) ב 37 ° c ב 5% CO2 מחולל אווירה. הערה: DMEM בתוספת של 10% FBS, 37 ° c, ו-5% CO2 מחולל אווירה משמשים עבור כל הקבצים המצורפים והטיפול incubations במהלך כל הפרוטוקול.</li>
	<li>הכן את תאים מד-ה231. לניסוי<ol>
<li>מוחלק את המדיום בתוך הבקבוקון, לנתק את התאים עם 2 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 2 דקות, ו להשבית את הפעילות טריפסין עם 6 מ ל של בינונית מלאה (DMEM זיכרון עם 10% FBS). צנטריפוגה את התאים ב 150 x g עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ומשהה את התאים ב -5 מ ל של מדיום שלם.</li>
		<li>מערבבים מתלה שווה של תאי נפח ו-0.4% טרי, כחול. קח 10 μL של תערובת זו ולספור את התאים עם מונה התא האוטומטי. הערה: ניתן להשתמש בדלפק של קולטר או בהאנטי-הומוציטוטר לספירת תאים.</li>
		<li>הזרע את התאים לתוך 6 צלחת הבאר לצורך זרימה cy, ניתוח הזרע 150,000 תאים בגודל 1 מ ל בינוני לכל טוב. המתן 16 שעות לקובץ מצורף לתא.</li>
		<li>זרע את התאים לתוך 4 שקופית קאמרית היטב עבור דימות פלורסנט ו-seed 25,000 תאים 0.5 mL של בינוני לכל טוב. המתן 16 שעות לקובץ מצורף לתא. הערה: בארות בקרת זרעים בנוסף לבארות טיפול. השתמש באחת מבארות הבקרה כדי לקבוע את מספר התאים (אופציונלי: אם תקופת הקובץ המצורף עבור התאים קצרה מזמן ההכפלה, ניתן להניח שמספר התאים זהה לצפיפות הזריעה) והשני עבור פקד שאינו נגוע (0 מע).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אדנגיזציה של התמרה (יום 2 ו -3)
התראה: אדנווירוסים יכולים לגרום למחלות. בעת העברת התאים, השתמש בטיפים מסוננים ובטיפים טהרים, בפיפטות פסטר ובצינורות מיקרוצנטריפוגה עם מלבין 10%.
הערה: פרוטוקול זה הוכח עם כמות מסוימת של התאים הסלולאריים ציטוסול, אך בתאי הסלולר האחרים (למשל, מרחב מיטוכונדריאני או מנשא) יכול להיות ממוקד עם אותו פרוטוקול.
<ol><li>צור עקומת מינון-תגובה עבור משרד המידע כדי להשיג את יעילות התמרה הגבוהה ביותר על-ידי חישוב הנפח של אדנווירוס (mL) הנדרש עבור כל ערך משרד ה-i-MB-231 קו תא (טבלה 1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ01.jpg"> הערה: סיכוייו פונקציונלי של כל אצווה של מלאי אדנונגיפי, אשר מבוטא כיחידת היווצרות פלאק (pfu) לכל mL, מסופק על ידי החברה. משרד המידע האופטימלי לצורך התמרה שונה בין סוגי תאים. עבור מרבית תאי היונקים, טווח משרד המידע האופטימלי הוא בין 10 ל-300. על פי התגובה התאית, ערכי משרד התקשורת צריכים להיות מחושבים מחדש (למשל, טווח מוי צריך להיות מופחת אם התאים יש תגובה ציטוטוקסיים, או טווח צריך להיות מוגבר אם לתאים יש התמרה נמוכה יעילות).</li>
	<li>הפוך 1:100 דילול של 6 x 1010 pfu/mL אדנוויראלי הפתרון עם התרבות התאית בינונית (dmem עם 10% fbs) עבור מלטף אמין.</li>
	<li>פיפטה ולהוסיף 0.0125 mL (12.5 μL), 0.025 mL (25 μL), 0.05 mL (50 μL) של אדנוויראלי של הדילול לתוך כל באר של 6 צלחת הבאר על מנת לשנות את התאים ה150,000 עם 50, 100, ו-200 מע בהתאמה עבור הניתוח cy, לעבורבטבלה 1.</li>
	<li>הפיפטה והוספת 0.0042 mL (4.2 μL) של הדילול האנטי-ויראלי בבארות בארבע שקופיות הקאמרית כדי לשנות את 25,000 תאים עם 100 מע להדמיה (שולחן 1). הערה: כמות מינימלית של בינונית יש להשתמש בבארות כדי להבטיח את האינטראקציה הגבוהה ביותר בין המבנה והתאים של ה-הנגיף. את התוכן סרום של מדיום התרבות ייתכן שיהיה צורך להקטין עבור קווי תאים שונים, כי רמות גבוהות של סרום יכול להשפיע לרעה על יעילות התמרה בסוגי תאים מסוימים.</li>
	<li>התאים הדגירה עבור 16 – 24 שעות תחת תנאי תחזוקה תא. למחרת (יום 3), לשנות את המדיום לתרבות התאים בינונית (DMEM עם 10% FBS) כדי לאפשר שחזור התא 24 שעות נוספות. לדמיין את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את המבנה שלהם; תאים יכולים לבטא את רוfp גם אם יש להם שינויים מורפולוגיים. הערה: ביום 3, התאים אמורים להתחיל לבטא את רוfp; לכן, יעילות התמרה ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ קרינה (מסננים עם ex. 488/em. 525). כדי להשיג תוצאות עקביות עקבית, להיות מודעים ולתעד את השינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ הניגודיות פאזה ולבחון מורפולוגיה תוך הערכת יעילות התמרה.</li>
	<li>לבנות עקומת התגובה מינון באמצעות 50, 100 ו 200 ממוי דגימות מוכן בשלב 2.3 התוצאות יעילות התמרה שלהם שהתקבלו מהניתוח זרימה cy, שלבים 3.1 ו-4.1. הערכת יעילות התמרה אופטימלית עם תיעוד של שינויים מורפולוגיים (שלב 2.5) ואת עקומת המינון-תגובה של משרד הבין. הערה: למרות שיותר מ-98% מאוכלוסיית התאים ב-100 מארה ב ו200 מארה ב מבטאים את זה (ראו תוצאות מייצגות), 200 החברה מארה ב הראתה שינויים ניכרים במבנה התאים של תאי מד א-MB-231. כתוצאה מכך, משרד המידע היעיל ביותר עבור תאים מד א-MB-231 היה נחוש להיות 100.</li>
	<li>לאחר משרד הפנים האופטימלי (כאן, 100 מע) נבחר עבור קו התאים מד א-MB-231, התנהלות ניסוי עם חומרי בדיקה (10 μM H2O 2 והרכב שלה 0.1% המים).<ol>
<li>הכן והזרע את התאים לפי סעיף 1. שימוש בנפח התמרה ויראלי עבור 100 מע מחושב בשלב 2.1, חזור על שלבים 2.2-2.4 עבור 100 מארה ב. התמרה ויראלית של תאים. לאחר מכן מודקת את הצלחת ואת שקופיות קאמרית לפי שלב 2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. רכישת מאזן כלוניים
<ol><li>הציטוצינסי זרימה (יום 4)<ol>
<li>ביום 4, בתאי הדגירה משלב 2.7.1 עם 10 μM H2O2 עבור 1 H. הערה: 10 μM H2או2 שימש כחומר המבחן ו 0.1% המים האלה שימשו כטיפול ברכב בפרוטוקול זה. סוכני חמצן אחרים יכולים לשמש כפקדים חיוביים כאן.</li>
		<li>מספר מדיה מ 6 צלחת הבאר, להחליף עם 750 μL של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון ולחכות 2 דקות לתאים להתנתק. הפעל טריפסין עם 2 מ ל של בינוני מלא (DMEM עם 10% FBS) ולאסוף את אמצעי האחסון לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 150 x g עבור 5 דקות ב 4 º c. להיפטר supernatant ולהשעות את התאים ב 500 μL של מלוחים מאגור פוספט (PBS).</li>
		<li>חזור על שלב 3.1.3</li>
		<li>לסנן את השעיות התא לתוך הזרימה cy, התואם צינורות באמצעות 40 יקרומטר רשת שינוי. לשמור על הצינורות על הקרח והרחק מן האור ובצע צעד 4.1 עבור ניתוח נתונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה מיקרוסקופית (יום 4)<ol>
<li>ביום 4, לטפל בתאים עם 10 μM H2O2, לרכוש תמונות מיד (נקודת זמן 0) ו 1 H לאחר הטיפול ובצע צעד 4.2 עבור ניתוח נתונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>מכמת<ol>
<li>הגדרת שיטת הזרימה cy, עבור 3 ניתוחים שונים באמצעות תוכנה לרכישתמדגם (ראה טבלת חומרים): פיזור הקדמי (fcs) על ציר x ופיזור בצד (הסוכנות למען המוות) על ציר y כדי להעריך את גודל התא ואת המורכבות של תאים (הסוכנות למען האו לזיהוי מחוספס של תאים לחיות); לשעבר. 488 ננומטר 525 ננומטר (פלואורואסעין איזוטיאוקלאט [FITC]) מסנן על ציר ה-x ו-אס. סי. על ציר y כדי להעריך את CyS-רוfp; לשעבר. 405 ננומטר 525 nm (סגול מבריק 510 [BV510]) מסנן בנדנה על ציר ה-x ו-ss על ציר y כדי להעריך CySS-רוfp.</li>
		<li>רוכשים בקרת משרד הפיקוח 0 ומדמיינים תאים עם תוכנת רכישה לדוגמה. חזור על שלב זה עבור הדגימות הנותרות (50, 100, 200 ממוי קבוצות ומאוחר יותר על 10 μMH 2O2 תאים מטופלים ותאים טיפול בכלי רכב). שמור את הקבצים לניתוח נתונים.</li>
		<li>פתח את תוכנת ניתוח הנתונים (ראה טבלת חומרים) ופתח קובץ לדוגמה 0 ממוי. הערכת האוכלוסיה של התאים המעניינים (שער 1). הגדר את הגגים הבאים כדי למזער את הזריחה של הרקע עבור ex. 488 ננומטר/em. 525 nm (שער 2) ו-ex. 405 ננומטר/em. 525 nm (שער 3) מסנני בנדנה עם תאי בקרה שאינם נגועים (0 מע).</li>
		<li>פתח את הקבצים 50, 100 ו-200 מארה ב בתוכנת ניתוח נתונים כדי להעריך את עקומת תגובת המינון. לנתח את עוצמות הזריחה עם גייטס 2 ו 3 עבור כל מדגם. חזור על שלב זה עבור דגימות בדיקה (10 μM H2O2 תאים מטופלים ותאים הטיפול ברכב).</li>
		<li>לחשב את היחס עוצמת פלורסנט ממוצע בין תחמוצת לעומת צורות מופחתת של רוfp עם המשוואה הבאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ02.jpg">
<ol start="2"><li>הערכת תמונות<ol>
<li>השתמש במיקרוסקופ המכיל מסנני קרינה עבור CyS-רוfp ו-CySS-רוfp (ex. 488 ננומטר/em. 525 nm ו ex. 405 ננומטר/em. 525 מסננים ננומטר, בהתאמה).</li>
		<li>בכל באר של שקופית קאמרית, לבחור 4 אזורים אקראיים להשיג תמונות, באמצעות מטרת 4x כדי להמחיש אזורים גדולים יותר. הערה: ניתן להשתמש במטרה 20x גם עבור תצוגות תמונה.</li>
		<li>פתח את התמונה באמצעות תוכנת ImageJ11. החל את הניתוח | למדוד פקודות עבור כל תמונה ולהשתמש במשוואה בשלב 4.1.5 כדי לכמת את הנתונים. הערה: קוונפיקציה של התמונות הוא מטימטרי; לפיכך, הפרוטוקול אינו כולל חיסור של רקע. עם זאת, כדי שתוכל להשוות בין תמונות, בהירות, ניגודיות ורוויה, עליך להיות זהה עבור כל תמונה. מובהקות סטטיסטית הוערך בניתוח חד כיוון של שונות (ANOVA) ו-Tukey הבדיקה הפוסט הוק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Redefining Oxidative Stress.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).</li>
<li>Pizzino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress%3A+Harms+and+Benefits+for+Human+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763(2017).</li>
<li>Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol%2Fdisulfide+redox+states+in+signaling+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).</li>
<li>Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+Mitochondrial+Compartmentation+of+Oxidative+Stress+and+Redox+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Dooley, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li>
<li>Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+intracellular+redox+conditions+using+GFP-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).</li>
<li>Bhaskar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+Redox+Sensitive+GFP+to+Measure+Mycothiol+Redox+Potential+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902(2014).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidant+stress+triggers+cell+death+in+simulated+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Loor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menadione+triggers+cell+death+through+ROS-dependent+mechanisms+involving+PARP+activation+without+requiring+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).</li>
<li>Esposito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+to+monitor+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).</li>
<li>Meyer, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+GFP+in+Arabidopsis+thaliana+is+a+quantitative+biosensor+for+the+redox+potential+of+the+cellular+glutathione+redox+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.</a> Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).</li>
<li>Galvan, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+mitochondrial+redox+assessment+confirms+enhanced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy.</a> Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).</li>
<li>Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+organisms+meet+redox+bioimaging%3A+One+step+closer+to+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).</li>
<li>Dey, S., Sidor, A., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+control+of+reactive+oxygen+species+scavenging+by+antioxidant+pathway+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

האיזון הטימלי/דיגופרתי באורגניזם משקף את מעמדם החדש של תאים. אורגניזמים חיים יש גלוטתיון, cysteine, החלבון thiols, ו נמוך מולקולרי משקל thiols, כולם מושפעים על ידי רמת החמצון ואת הד מעמד החמצון של תאים4. הנדסה מהונדסים לאפשר את הכמת הבלתי מפריעה של האיזון thiol/disulfide באמצעות שאריות CyS שלהם7. המאפיין הטימטרי של המלון מספק מדידות מחדש ואמינות לתאי מיונקים. ניתן להכניס בקלות לתאים עם שיטות החצייה ו/או וקטורים התמרה, אך התמרה ויראלית בעלת יעילות גבוהה יותר.
<p class="j...

לחץ חמצוני הוגדר ב 1985 על ידי הלמוט שעירים כמו "הפרעה ב-prooxidant-מאזן נוגד חמצון לטובת לשעבר"1, ושפע של מחקר נערך כדי להשיג מחלות-, תזונה-, ו-הזדקנות-מעמד החיים ספציפי חמצון של אורגניזמים1,2,3. מאז, ההבנה של לחץ חמצוני הפך להיות רחב יותר. בדיקת השערות של שימוש נוגדי חמצון נגד מחלות ו/או הזדקנות הראו כי לחץ חמצוני לא רק גורם נזק אלא גם יש תפקידים אחרים בתאים. יתר על כן, מדענים הראו כי רדיקלים חופשיים לשחק תפקיד חשוב עבור התמרה אות2. כל מחקרים אלה מחזקים את החשיבות של קביעת השינויים הפחתת חמצון היחס של קרו. פעילות אנזימים, נוגדי חמצון ו/או חמצון, ומוצרי חמצון ניתן להעריך עם שיטות שונות. בין אלה, שיטות הקובעות חמצון תיול הם ללא ספק המשמשים ביותר משום שהם מדווחים על האיזון בין נוגדי חמצון ו prooxidants בתאים, כמו גם אורגניזמים4. במיוחד, היחס בין הגלוטתיון (gsh)/גלוטתיון קשר דיסולפידי (gssg) ו/או ציסטאין (cys)/cyסטינה (cyss) משמשים כסמנים לניטור מעמד החמצון של אורגניזמים2.
שיטות המשמשות לאמירת האיזון בין prooxidants ונוגדי חמצון להסתמך בעיקר על רמות של חלבונים מופחת/תחמוצת או מולקולות קטנות בתוך תאים. הכלים המערבי וספקטרומטר המסה משמשים כדי להעריך באופן כללי את היחס של מופחת/תחמוצת קרו (חלבון, שומנים וכו '), ו gsh/gssg יחס יכול להיות מוערך עם ספקטרופוטומטר5. תכונה נפוצה של שיטות אלה היא הנטייה הפיזית של המערכת על ידי הליזה תא ו/או רקמת המגון העור. מנתח אלה גם להיות מאתגרת כאשר יש צורך למדוד את מצב החמצון של תאים סלולריים שונים. כל אלה מרטבאליות לגרום לחפצים בסביבת העבודה.
החלבונים הניאון הרגישים מחדש פתחו עידן היתרון להערכת איזון החמצון מבלי לגרום להפרעה בתאים6. הם יכולים למקד תאים תאיים שונים, המאפשר כימות של פעילויות ספציפיות לחלקה (g., לומר את המצב החדש של המיטו, ואת הציטוסול) כדי לחקור את הקשר בין אורגלים סלולריים. חלבון פלורסנט צהוב (YFP), חלבון פלורסנט ירוק (GFP), וחלבונים HyPeR נבדקים על ידי מאייר ועמיתיו6. בין החלבונים האלה, החמצון הרגיש (gfp) הוא ייחודי עקב קריאות פלורסנט שונות של cys (ex. 488 ננומטר/em. 525 nm) ו-cyss (ex. 405 nm/525 nm) שאריות, אשר מאפשרת ניתוח של טימטרי, בניגוד לחלבונים אחרים הרגישים מפני חמצון כגון yfp7,8. פלט טימטרי הוא בעל ערך מכיוון שהוא מאזן את ההבדלים בין רמות הביטוי, הרגישויות לזיהוי והלבנתשמונה. תאי משנה של תאים (ציטוזול, המיטומטר, גרעין) או אורגניזמים שונים (חיידקים, כמו גם תאים ממיונקים) ניתן לפלח על ידי שינוי רוfp7,9,10.
הספר מבוצע באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית, במיוחד עבור ניסויים חזותיים בזמן אמת. ניתוח ציטומטלי זרימה של "רומינטריק" ניתן גם לניסויים בנקודות זמן שנקבעו מראש. המאמר הנוכחי מתאר הן את השימוש של מיקרוסקופ פלורסנט ואת הזרימה cy, מנסה לבצע הערכה מחודשת של מעמד החמצון בתאי היונקים overexpressing (ממוקד ציטוסול) באמצעות התמרה ויראלית.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>25200-056</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>4 בארות שקופית תא</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>154526</td><td>חומר זריעת תאים להדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>צינורות 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים</td><td>פלקון</td><td>352235</td><td>צינור מתלה תא יחיד לניתוח ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>צלחת קורנינג 6 בארות</td><td></td><td>353046</td><td>חומר זריעת תאים לניתוח זרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>75 ס"מ2 צלוחיות תרבית רקמת כובע מאוורר</td><td>קורנינג</td><td>4306414</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>ציטוזול אדנו-ויראלי ספציפי roGFP</td><td>ViraQuest</td><td>VQAd roGFP</td><td>roGFP מבנה מסופק באדיבות על ידי ד"ר שומאקר</td></tr><tr><td>Class II, ארון קולט אדים בטיחותי מסוג A2</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>רוזנת מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>שקופיות תא מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>ספירת תאים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco על ידי מדעי החיים</td><td>11995-065</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td>FBS אטלנטה ביולוגית</td><td>S11150</td><td>תרבית</td></tr> <tr><td>תאיםקצות פיפטות מסוננות, סטריליות, 20 ומיקרו; l</td><td>פישרברנד</td><td>02-717-161</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>קצות פיפטה מסוננים, סטריליים, 1000 ומיקרו; l</td><td>פישרברנד</td><td>02-717-166</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td> של תרבית תאים <td>BD Biosciences</td><td>LSRFortessa</td><td>מכשיר מצויד במסנני פס פס FITC ו-BV510 לניתוחי ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>קבוצת מיקרוסקופיה מתקדמת (AMG)</td> <td>Evos FL</td><td>הדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מי חמצן 30%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>H325-100</td><td>בקרה</td></tr> <tr>חיובית<td>Light Cube,</td><td>Custom Life Sciences</td><td></td><td>CUB0037 הדמיה פלואורסצנטית של תאים המבטאים roGFP (לדוגמה 405 ננומטר)</td></tr><tr><td>Light Cube, GFP</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEP4651</td><td>הדמיה פלואורסצנטית של תאים המבטאים roGFP (לדוגמה 488 ננומטר)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>אוסף תרביות רקמות אמריקאיות</td><td>HTB-26</td><td>קו תאי סרטן שד אפיתל אנושי</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה, 2 מ"ל</td><td>Grenier Bio-One</td><td>623201</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>10010-023</td> בקר <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Hood Mate דגם 360</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פיפט סרולוגי, 1 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-11B</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פיפט סרולוגי, 5 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-11D</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פיפט סרולוגי, 10 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים תרבית רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACell 150i</td><td>CO<>2 חממה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן 0.4%</td> <td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>ספירת תאים</td></tr></tbody></table>

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

מדידת חמצון תאיים/הפחתת המאזן מספק סקירה של המצב הפיסיולוגי ו/או פתופסולוגית הסטטוס של אורגניזם. תיוולים חשובים במיוחד להארת המצב החדש של התאים באמצעות dithiol מופחת וביחס דיגומי. מהונדסים cysteine-המכיל חלבונים פלורסנט לפתוח עידן חדש לחמצון רגישות biosensors. אחד מהם, חלבון הניאון רגישות ירוק רגיש (רוfp), יכול בקלות להיות הציג לתאים עם התמרה ויראלי, המאפשר את מצב החמצון של תאי subcellular להיות מוערך מבלי לשבש את התהליכים הסלולריים. Cysteines מופחת ו cysteines תחמוצת של רוfp יש עירור מקסימה ב 488 ננומטר ו 405 nm, בהתאמה, עם פליטה ב 525 nm. הערכת היחס בין צורות מופחתות ומחמצנים מאפשרת חישוב נוח של איזון מחדש בתוך התא. במאמר שיטה זה, מונצח האדם האנושי משולשת שליליים סרטן השד תאים (מד א-MB-231) שימשו כדי להעריך את הסטטוס של חמצון בתוך התא החי. שלבי הפרוטוקול כוללים התמרה מד-התאים מספר 6-1-MB-231, הטיפול ב-H2O2, והערכה של היחס ציסטאין וציסטינה עם שתי הזרימה הציטונסות והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית.

המצב החדש של ה-CyS/CySS הוא בקלות עם התמרה באמצעות מדידה של רוfps. בדיקת פלורסנט מכמת את היחס בין צורות מופחתת ו תחמוצת (העירור אורכי גל 488 nm ו 405 nm, בהתאמה). נתונים בעלי קרינה פלואורסצנטית ניתן להשיג על ידי שניהם cy, הזרמת לנסות מיקרוסקופ.
מספר גדול של תאים יכול בעקביות ובנוחות להיות באמצעות הזרימה cy, try. הניתוח כולל 3 צעדים עיקריים: 1) בחר את אוכלוסיית התאים המעניינים במסנן האזור FSC (איור 1A); 2) לשער את התאים המבטאים את ה-רוfp עם אקס. 488/em. 525 ננומטר ...

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

שמאי פרוטוקול נוכחיים בטקסטיל, שינויים במצב redox באופן תא תאי ספציפי. הפרוטוקול שלנו מאפשר הבנה וניטור טובים יותר של כל המנגנונים הפיזיולוגיים או הפתופיזיולוגיים של סטרס חמצוני. טכניקה זו מאפשרת כימות לא מפריע של יחס סולפיד העין הרעף בתאים שלמים באמצעות פלט מדד יחס כדי לאזן את ההבדלים בין רמות ביטוי האות, הלבנת תמונות, ורגישויות זיהוי.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על אורגניזמים שונים, כולל חיידקים בצמחים. ביום הראשון של הניסוי לטפל בתאים מתוך קו תאים סרטן השד confluent במשך שתי דקות, עם שני מיליליטר של 0.2, 5% נסיעות EDTA. כאשר התאים מתחילים לנתק לעצור את התגובה עם שישה מיליליטר של בינוני מלא ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה.להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של טרי, בינוני מלא, לספור את התאים לדלל אותם 1.5 פעמים 10 לתאים החמישי לכל מיליליטר אחד של מדיום שלם. ואז לזרוע 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של תאים ל הבאר בצלחת 6 באר, ולהחרים את התאים באינקובטור תרבות התא בן לילה. או לא להוסיף שום טרנסדוקציה GFP שורה ויראלית.למחרת בבוקר, להוסיף 12.5, 25, ו 50 microliters של אחד עד 100 מדולל שש פעמים 10 כדי 10 לוחית 10 להרכיב יחידות למיליליטר של להוסיף שום פתרון GFP שחיקה ויראלי, במדיום מלא. הוסף את זה ל בארות המתאימות או לצלחת 6 באר כדי להתמר את התאים עם 50, 100, ו 200 כפל זיהום, בהתאמה. כאשר כל הבארים מדגם כבר מתמר עם וירוס, להחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 16 עד 24 שעות.למחרת, לדמיין את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והחליף את supernatant עם בינוני, ללא וירוס כדי לאפשר לתאים להתאושש במשך 24 שעות נוספות. כדי לקבוע את יעילות ההעתקה האופטימלית, להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות והמורפולוגיה של התאים על ידי ציטומטריית זרימה. הקפד לנהל את כל ההליכים שיכולים לגרום לזיהום מתרסיסים או התזות בתוך ארון בטיחות ביולוגי מוסמך ברמה 2.כדי להעריך את מצב redox של התאים, למחרת בבוקר, דגירה התאים ואת הבאר המתאימה של צלחת 6 באר עם 10 מי חמצן micromolar במשך שעה אחת, לפני ניתוק התאים עם 750 microliters של 0.2 5% טפטוף ב EDTA לגם, כפי שהוכח. לעצור את התגובה עם שני מיליליטר של מדיום שלם לגם ולמשוך את supernatants עבור כל מצב בודדים 15 צינורות חרוט מיליליטר. מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את כדורי ב 500 microliters של PBS היטב על ידי צנטריפוגות פעמיים.לאחר הכביסה השנייה, לסנן את מתלי התא דרך 40 רשתות רשת מיקרו מטר לתוך צינורות תואמי cytometry זרימה על קרח, מוגן מפני אור. בתוכנת ציטומטר זרימה, להפעיל את ריבוי אפס של מדגם בקרת זיהום. ואז לנתח את מי חמצן ותאים מטופלים.זה יאפשר חישוב של יחס עוצמת הפלואורסצנטי הממוצע בין הצורות מחומצן לעומת מופחת של GFP שורה, באמצעות הנוסחה כפי שצוין. להלן אסטרטגיית gating לבחירת מספר גדול של תאים לפי ציטומטריית זרימה מוצגת. ציטומטריית זרימה יכולה לשמש גם כדי לקבוע את עקומת תגובת המינון לניתוח GFP שורה ואת ריבוי היעיל ביותר של קלט זיהום.על פי ריבוי הזיהום, עקומת תגובת המינון בניתוח מייצג זה, ריבוי של 200 זיהומים נתן את הביטוי GFP הכביש הגבוה ביותר, אבל מורפולוגיה התא היה תוצאה של ציטוטוקסיות. לכן, יעילות התמרה האופטימלית נקבעה להיות ריבוי של זיהום של 100. בניתוח מצב זה של חמצון מחדש, עוצמות פלואורסצנטיות של GFP משורה מחומצנות ומצומצמות התקבלו מניתוח ציטומטריית זרימה לרכב וארבעה 10 טיפולים במי חמצן בשליטה חיובית מיקרומולרית.ההיסטוגרמות מכוסות מייצגות את השינויים במספר התא ב-10 מי חמצן מיקרומולריים וקבוצות מטופלות ברכב או GFP מופחת ומחמצן. חישוב היחס בין GFP שורה מחומצן ומופחת לניתוח זה גילה כי 10 מי חמצן micromolar גרם לעלייה משולשת חמצון של GFP שורה לעומת הטיפול ברכב. לאחר מספרי תאים מדויקים חשוב עבור חישובי MRI ושכפול.על מנת לקבל תוצאות לשחזור, החוקרים צריכים לערבב ביסודיות את הפתרונות האנטי ויראליים כדי להשיג השעיות הומוגניות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור שינויים מהירים של redox כחלק בלתי נפרד מהמגוון הרחב של תהליכים תאיים נורמליים והתקדמות המחלה בזמן אמת.

assessment-cellular-oxidation-using-subcellular-compartment-specific

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הדמיה של עקה חמצונית באורגנואידים בתרבית. עבודה זו מסייעת בהבנת רמת העקה החמצונית עקב הצטברות ROS בסוגי התאים השונים הקיימים באורגנואיד לאחר טיפול במודולטורים שונים של ROS.

בדיקת הדמיה פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת עקה חמצונית בתאי אורגנואיד בתרבית של מיני חמצן תגובתי שטופלו על ידי השראת תאים אורגנואידים במעי

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או בVivo

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.

גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

למדו להעריך מצב רדוקס תת-תאי באמצעות בדיקה פלואורסצנטית רגישה לחמצון. שיטה זו מאפשרת כימות לא פולשני של מצב החמצון בתאים שלמים בזמן אמת.

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

גלה סרטונים נוספים