הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה
June 18th, 2020
פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.
שמאי פרוטוקול נוכחיים בטקסטיל, שינויים במצב redox באופן תא תאי ספציפי. הפרוטוקול שלנו מאפשר הבנה וניטור טובים יותר של כל המנגנונים הפיזיולוגיים או הפתופיזיולוגיים של סטרס חמצוני. טכניקה זו מאפשרת כימות לא מפריע של יחס סולפיד העין הרעף בתאים שלמים באמצעות פלט מדד יחס כדי לאזן את ההבדלים בין רמות ביטוי האות, הלבנת תמונות, ורגישויות זיהוי.
פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על אורגניזמים שונים, כולל חיידקים בצמחים. ביום הראשון של הניסוי לטפל בתאים מתוך קו תאים סרטן השד confluent במשך שתי דקות, עם שני מיליליטר של 0.2, 5% נסיעות EDTA. כאשר התאים מתחילים לנתק לעצור את התגובה עם שישה מיליליטר של בינוני מלא ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה.
להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של טרי, בינוני מלא, לספור את התאים לדלל אותם 1.5 פעמים 10 לתאים החמישי לכל מיליליטר אחד של מדיום שלם. ואז לזרוע 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של תאים ל הבאר בצלחת 6 באר, ולהחרים את התאים באינקובטור תרבות התא בן לילה. או לא להוסיף שום טרנסדוקציה GFP שורה ויראלית.
למחרת בבוקר, להוסיף 12.5, 25, ו 50 microliters של אחד עד 100 מדולל שש פעמים 10 כדי 10 לוחית 10 להרכיב יחידות למיליליטר של להוסיף שום פתרון GFP שחיקה ויראלי, במדיום מלא. הוסף את זה ל בארות המתאימות או לצלחת 6 באר כדי להתמר את התאים עם 50, 100, ו 200 כפל זיהום, בהתאמה. כאשר כל הבארים מדגם כבר מתמר עם וירוס, להחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 16 עד 24 שעות.
למחרת, לדמיין את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והחליף את supernatant עם בינוני, ללא וירוס כדי לאפשר לתאים להתאושש במשך 24 שעות נוספות. כדי לקבוע את יעילות ההעתקה האופטימלית, להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות והמורפולוגיה של התאים על ידי ציטומטריית זרימה. הקפד לנהל את כל ההליכים שיכולים לגרום לזיהום מתרסיסים או התזות בתוך ארון בטיחות ביולוגי מוסמך ברמה 2.
כדי להעריך את מצב redox של התאים, למחרת בבוקר, דגירה התאים ואת הבאר המתאימה של צלחת 6 באר עם 10 מי חמצן micromolar במשך שעה אחת, לפני ניתוק התאים עם 750 microliters של 0.2 5% טפטוף ב EDTA לגם, כפי שהוכח. לעצור את התגובה עם שני מיליליטר של מדיום שלם לגם ולמשוך את supernatants עבור כל מצב בודדים 15 צינורות חרוט מיליליטר. מסיסים את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את כדורי ב 500 microliters של PBS היטב על ידי צנטריפוגות פעמיים.
לאחר הכביסה השנייה, לסנן את מתלי התא דרך 40 רשתות רשת מיקרו מטר לתוך צינורות תואמי cytometry זרימה על קרח, מוגן מפני אור. בתוכנת ציטומטר זרימה, להפעיל את ריבוי אפס של מדגם בקרת זיהום. ואז לנתח את מי חמצן ותאים מטופלים.
זה יאפשר חישוב של יחס עוצמת הפלואורסצנטי הממוצע בין הצורות מחומצן לעומת מופחת של GFP שורה, באמצעות הנוסחה כפי שצוין. להלן אסטרטגיית gating לבחירת מספר גדול של תאים לפי ציטומטריית זרימה מוצגת. ציטומטריית זרימה יכולה לשמש גם כדי לקבוע את עקומת תגובת המינון לניתוח GFP שורה ואת ריבוי היעיל ביותר של קלט זיהום.
על פי ריבוי הזיהום, עקומת תגובת המינון בניתוח מייצג זה, ריבוי של 200 זיהומים נתן את הביטוי GFP הכביש הגבוה ביותר, אבל מורפולוגיה התא היה תוצאה של ציטוטוקסיות. לכן, יעילות התמרה האופטימלית נקבעה להיות ריבוי של זיהום של 100. בניתוח מצב זה של חמצון מחדש, עוצמות פלואורסצנטיות של GFP משורה מחומצנות ומצומצמות התקבלו מניתוח ציטומטריית זרימה לרכב וארבעה 10 טיפולים במי חמצן בשליטה חיובית מיקרומולרית.
ההיסטוגרמות מכוסות מייצגות את השינויים במספר התא ב-10 מי חמצן מיקרומולריים וקבוצות מטופלות ברכב או GFP מופחת ומחמצן. חישוב היחס בין GFP שורה מחומצן ומופחת לניתוח זה גילה כי 10 מי חמצן micromolar גרם לעלייה משולשת חמצון של GFP שורה לעומת הטיפול ברכב. לאחר מספרי תאים מדויקים חשוב עבור חישובי MRI ושכפול.
על מנת לקבל תוצאות לשחזור, החוקרים צריכים לערבב ביסודיות את הפתרונות האנטי ויראליים כדי להשיג השעיות הומוגניות. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור שינויים מהירים של redox כחלק בלתי נפרד מהמגוון הרחב של תהליכים תאיים נורמליים והתקדמות המחלה בזמן אמת.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכת מצב חיזור ספציפי לתא-תת-תא בתאים באמצעות בדיקת זורם פלורסנטי רגיש לחיזור. טכניקה זו מאפשרת כימות ללא הפרעה של מצב החיזור בתאים שלמים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- ביולוגיה של חיזור
- לחץ חמצון
רקע
- הבנת מצבי חיזור חיונית לחקר לחץ חמצון.
- בדיקות רגישות לחיזור מספקות תובנות לגבי מנגנונים תאיים.
- שינויים במצב החיזור יכולים להצביע על מצבים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פני אורגניזמים שונים.
מטרת המחקר
- לאפשר ניטור של לחץ חמצון בתאים.
- לספק שיטה ללא הפרעה לכימות מצבי חיזור.
- לשפר את ההבנה של תגובות תאים לתנאים חמצוןיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שימוש בבדיקה פלורסנטית רגישה לחיזור.
- ניתוח רציומטרי לאיזון הבדלי אותות.
- יישום הפרוטוקול על סוגי תאים שונים, כולל תאי סרטן.
- טיפול בתאים וצנטריפוגה להכנת דגימות.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של מצבי חיזור בתאים שלמים.
- הוכחת יישומיות על פני סוגי תאים שונים.
- הספקת תובנות לגבי המנגנונים הפיזיולוגיים של לחץ חמצון.
- איפשר ניטור של שינויים בחיזור בזמן אמת.
מסקנות
- פרוטוקול זה יעיל להערכת מצב החיזור בתאים.
- הוא מספק כלי חשוב לחקר מנגנוני לחץ חמצון.
- השיטה יכולה להיות מותאמת ליישומים מחקריים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
