Name: בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למדו בידוד גרעינים יחידים מתאי שומן בוגרים לצורך פרופיל תעתיקי תא-יחיד באיכות גבוהה. פרוטוקול זה ממזער צבירות גרעיניות ופסולת תאית ומאפשר חקר ארגון רקמת השומן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו רוצים להודות לדיויד ריינולדס מליבת אלברט איינשטיין גנומיקה ו Jinghang ג'אנג מן זרם Cy, ליבה לתמיכה טכנית. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (DK110426) ומענקי פיילוט והיתכנות מהמרכז לחקר הסוכרת של איינשטיין הר סיני (DK020541), ניו יורק מרכז מחקר השמנת יתר (DK026687) (כולם כדי K.S.). אנחנו גם רוצים להודות לאלברט איינשטיין סרטן המרכז (CA013330) לתמיכה בליבה.

טיפול בבעלי חיים וניסויים בוצעו על פי הליכים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים במכללת אלברט איינשטיין לרפואה.
1. הכנת מאגרי עיכול ולפירוק רקמות
<ol><li>הכן את מאגר. העיכול לרקמות<ol>
<li>הכן ~ 1 מ ל של מאגר העיכול עבור כל גרם של רקמת השומן.</li>
		<li>שקול החוצה 1.5 U/mL קולוראז D ו 2.4 U/mL dispase II ולהוסיף מלוחים מאגור פוספט (PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מאגר הכנה לגרעינים (NPB).<ol>
<li>הכינו 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 10 מ"מ אשלגן כלוריד, 250 mM סוכות, ו 0.1% NP-40 במים ללא שכירות. . תערבב היטב סוכרוז עלולה להימשך זמן רב יותר מאשר הרכיבים האחרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 0.5% בתמיסה של סרום (BSA).<ol>
<li>הכינו 0.5% BSA ב-PBS המכיל EDTA. מומלץ להשתמש מסונן מסוננים תרבות התא כיתה PBS (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. העיכול האנזימטי של רקמת האדיפוז
<ol><li>מנתחים עכברים כדי לחלץ רקמת אדיפוז על פי Aune ואח '13. לאסוף רקמה מבודדת בתבשיל המכיל PBS. להעביר את הרקמה למגבת נייר ללטף יבש. ואז למקם את הרקמה בתוך צלחת נקייה.</li>
	<li>הוסף סידן כלוריד לחוצץ העיכול לריכוז סופי של 10 מ"מ. הוסף נפח קטן של מאגר העיכול למנה והכה ביסודיות את רקמת השומן. הנפח של מאגר העיכול נדרש יהיה מבוסס על כמות רקמות מבודדים. בדרך כלל, נעשה שימוש ב-1 מ"ל או בפחות.</li>
	<li>הוסיפו כמחצית מכמות מאגר העיכול המוכן (למשל, ~ 10 מ"ל לחמישה עכברים) לרקמה הקצוצה. העבירו את הדגימה לצינור. הצנטריפוגה של 50 mL הוסף את כמות המאגר הנותרת כדי לשטוף את הצלחת ולהעביר לצינור 50 mL המכיל את המדגם. . הפיפטה עולה ויורד מספר פעמים לאחר מכן דגירה עם טלטול ב 200-210 rpm ב 37 ° צ' עבור 12-15 דקות.</li>
</ol>3. בידוד אדיפוציט
<ol><li>לאחר הדגירה, להוסיף 0.5% BSA ביחס 1:1 למדגם. מערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. צנטריפוגה את המדגם ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לסובב את שבר כלי הדם סטרומה (svf). שבר adipocyte יישאר בשכבה העליונה של המדגם.</li>
	<li>מקום מסנן תא 40 יקרומטר על גבי שפופרת צנטריפוגה של 50 mL ומסנן את המדגם, איסוף השכבה העליונה ולהשאיר מאחורי svf בתחתית הצינור. העבר את השכבה העליונה (שבר adipocyte) לצינור חדש על ידי היפוך מסנן הפוך מעל הצינור באמצעות 0.5% BSA כדי להפוך לשטוף את המסנן ולאסוף את המדגם בצינור.</li>
	<li>הביאו את עוצמת הקול הכוללת של 0.5% BSA ל 10-15 mL בהתבסס על גודל המדגם והפיפטה למעלה ולמטה באמצעות מפית סרוולוגית או בקצרה לנער למעלה ולמטה כדי לערבב את המדגם. צנטריפוגה את המדגם שוב ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.</li>
</ol>4. גרעיני בידוד
<ol><li>השתמש בעצת פיפטה רחבה ובזהירות להעביר את השכבה העליונה של המדגם למסנן תא 100 יקרומטר ממוקם על גבי צינור חדש מקורר על הקרח, משאיר מאחורי כל שרידי svf.</li>
	<li>לשטוף/לשטוף את המסנן עם כמות מספיקה של NPB ולמחוק את המסנן. משלב זה קדימה יש את המדגם על קרח לעתים קרובות ככל האפשר ולעבוד במהירות כדי למנוע דליפה ו/או בריא גרעיני. זה מועיל כדי לצנן מיקרוצנטריפוגה צינורות לשמש בעתיד בצעדים על הקרח.</li>
	<li>מניחים את המדגם על הקרח עבור לא יותר 2 דקות עם היפוך עדין לסירוגין של הצינור לערבב. זמן הדגירה על הקרח צריך להיות מותאם עבור גודל דגימה וסוג של adipocytes. צנטריפוגה ב 1,000 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של NPB. העבר את הדגימה. לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בעת העברת, להימנע מלגעת בקירות של הצינור, אשר מכילים פסולת ליפיד. הוסף 0.6 U/μL RNase מעכב למדגם ולערבב. צנטריפוגה שוב ב 1,000 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות. הערה: יש להקטין את מהירות הצנטריפוגה והזמן בשלב זה עבור דגימות קטנות יותר.</li>
	<li>הסר את supernatant ולהשעות מחדש 1 מ ל של מאגר שטיפת גרעינים (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase מעכב).</li>
	<li>מסנן כפול לתוך צינור נקי עם הערמה 30 יקרומטר מסננים. שטוף מסנן עם כרך קטן (~ 300 μL) של מאגר שטיפת גרעינים. לחילופין, עבור דגימות קטנות יותר, השתמש במסנן של 30 יקרומטר המתאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ומסנן ישירות לתוכו.</li>
	<li>אשר בידוד מוצלח של גרעינים בריאים.<ol>
<li>להכתים מונה קטן של המדגם עם טרימין ולהשתמש במונה תאים אוטומטיים כדי להעריך גודל ממוצע מתים ואחוז תאים מתים. גודל ממוצע מת עבור מדגם המכיל בעיקר גרעינים צריך לנוע בין 7-10 μm. גודל גרעינים הוא בדרך כלל סביב 8 μm.</li>
		<li>כתם מדגם קטן של המדגם עם DAPI ובדוק תחת מיקרוסקופ עם מטרה 20x או גבוה יותר. הקרום הגרעיני אמור להיות שלם. והגרעינים צריכים להיות עגולים</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. מכונות ניקוי והגרעין של FACS
<ol><li>המשך מיד לשלב ה-FACS כדי לנקות את הגרעינים ולהסיר את כל הפסולת העודפת. מאגר האוסף צריך להכיל מאגר שטיפת גרעינים. במהלך FACS המאגר מדולל. הכנת ריכוז גבוה יותר של BSA ו-RNase מעכב לחשבון עבור דילול במהלך המיון הוא מועיל. בלוק האיסוף של FACS צריך להיות במצב קירור.</li>
	<li>לאחר מיון גרעינים, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' כדי לרכז את המדגם. מהווים כמות מתאימה של מאגר שטיפת גרעינים כדי להשיג ריכוז של 500-1500 גרעינים/μL. אל תנסו להסיר את כל הסופרנטאנט. פעולה זו תגרום לאבדן גרעינים.</li>
	<li>השתמש בהוציטומטר ומוכתם DAPI לספירה סופית ולדמיין את הגרעינים. לאחר מכן המשך מיד עם snRNA-seq לפי פרוטוקול היצרן.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד גרעינים בודדים ולחקור את הטרוגניות רקמות מוצג. בהשוואה לרצף שלמות RNA רקמה, זרימת עבודה זו מציעה תצוגה משוחדת של טרוגניות הסלולר סמנים ספציפיים לאוכלוסיה. זה משמעותי וחדשני לקידום ביולוגיה adipocyte, חילוף חומרים מולקולרי, ומחקר השמנת יתר.
פרוטוקול זה מותאם במיוחד עבור יישום במטה של snRNA-seq. "ניקוי" צעד כדי להשיג בידוד של גרעינים בריאים עם מונה מהירות גבוהה של MoFlo XDP לחלוטין מסיר פסולת ואגרגטים מן ההשעיה הגס תוך שמירה על שלמות הקרום הגרעיני. לכן, זה מגביר את יע...

מחקרים הראו כי רקמת השומן החום (BAT) יש יכולת יוצאת דופן לפרוק אנרגיה. שני סוגים של adipocytes התרמוגניים עם תכונות התפתחותיות ברורים להתקיים הן מכרסמים ובני אדם: אדיפוציטים בז ' ו הקלאסי חום. בעוד adipocytes חום קלאסי ממוקמים בעיקר בתוך מחסני עטלפים העטלף, בצבע אדיפוציטים בז ' מופיע ברקמת השומן הלבן (WAT) בתגובה לרמזים פיסיולוגיים מסוימים, כגון חשיפה כרונית קר, תהליך המכונה "בראונינג" או "בייגינג". באמצעות הדמיה מתקדמת, כעת ברור כי בני אדם בוגרים יש מחסני משמעותית של UCP1+ BAT, במיוחד באזור הגדול של1su, 1,2,3,4. כמות העטלף האנושי המבוגר מתואם בצורה מושלמת ויכול להיות מוגבר על ידי רמזים חיצוניים, כגון חשיפה כרונית לקור5,6 או β3-אדרררגיות קולטן אגוניסט7. ההוצאה האנרגטית של בת-תיווך עשויה להציע גישה מעשית ללוחמה בהשמנה.
עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים חשפו את קיומם של תת-סוגי או אוכלוסיות מרובות, כי הם ברורים ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript8,9,10. למשל, סוג של adipocyte בז ' כי מעדיפים בשימוש גלוקוז עבור התרמוגנזה, g-בז ' אדיפוציט, תיאר לאחרונה10. ההבנה הבלתי מלאה של סוגי התאים ברקמת השומן בחום ובבז ' והיעדר סמנים ספציפיים מהווים מכשול קריטי לחקר תפקודיו הביולוגיים.
שיטות מסורתיות לבידוד אוכלוסיות משנה של תאים מבוססות על ביטוי של רק כמה גנים הסמן הידוע. ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של תא בודד מאפשרת את השימוש בנתוני הביטוי הגנטי הגלובלי של תאים בודדים כדי לספק אומדן לא משוחדת של מספר אוכלוסיות המשנה ברקמה. המטרה האולטימטיבית של פרוטוקול זה היא לקבוע את כל סוגי הרקמה האדיפוז תחת גירויים תרמוגניים שונים ברזולוציה של תא בודד. בניגוד לרקמות אחרות וסוגי תאים, קביעת תת-סוגי תאית של רקמת האדיפוז מאתגרת עקב שבריאת האדיפוציטים מלאות השומנים. נייר זה מציג פרוטוקול חזק כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמת האדיפוז עבור יישום המטה לרצף snRNA. חשוב לעשות זאת, הספרות האחרונות השוואת התאמה היטב-גרעיני ברצף RNA (snRNA-seq) ו-תא יחיד ברצף RNA (scRNA-seq) datasets חשף כי snRNA-seq הוא המקבילה scRNA-seq בזיהוי סוג התא, ומעולה בכיסוי הסלולר עבור רקמה מורכבת כמו המוח11. פרוטוקול זה משלב מעבר הדרגתי צנטריפוגה שיטה ממוטבת עבור הרקמה האדיפוז על ידי רוזן ואח '12 עם גרעין "ניקוי" צעד עם מיון מהירות גבוהה של מופלו xdp. כפי שנראה תוצאות הנציג, ניתוח של 7,500 גרעיני יחיד מתוך העכבר רקמת שומן חום מזוהה מספר סוגי תאים בתוך adipocytes לכאורה חום הומוגנית. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט ויציב ניתן להחיל על המחקר ברמת רקמת הארגון של אדיפוציטים ותאים תושב אדיפוז, זיהוי של גנים סמן תת-סוג ספציפי, ופנוטיפים לפיתוח של אדיפוז-בררנית העכברים/טרנסגניים.

<table><tbody><tr><td>פתרון שטיפה autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS עם EDTA;</td></tr> מסנן <tr><td>תאים BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים 100 &mu; m</td><td>מסנן תאים 431752</td><td></td><td></td>קורנינג</tr><tr><td>40&mu; מ</td><td>קורנינג</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>מסננות חכמות של MACS (30 ומיקרו; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>מסננים הניתנים לערמה</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP סדרן תאים</td><td>בקמן קולטר</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>מגן מעכב RNase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

שומן חום ו-בז ' הם ברקמות אדיפוז מיוחדות המודקות את האנרגיה לתרמוגנזה על ידי UCP1 (חלבון בלתי מצמד-1)-שבילים תלויים ועצמאיים. עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם תתי-סוגי מספר או תת אוכלוסיות נפרדות ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript. למרות ההתקדמות בגנומיקה תא יחיד, התפרקות לא משוחדת של רקמות האדיפוז לתוך סוגי התאים הסלולריים כבר מאתגרת בגלל האופי השברירי של adipocytes מלא השומנים. הפרוטוקול המוצג פותח כדי לעקוף מכשולים אלה על ידי בידוד אפקטיבי של גרעין יחיד מרקמת האדיפוז עבור יישומי במטה, כולל רצפי RNA. טרוגניות הסלולר ניתן לנתח על ידי רצפי RNA וניתוחים ביולוגיים.

גרעיני adipocyte ללא מיון מכילים פסולת ו doublets ליצור רעש ורקע גבוה במורד הזרם ברצף RNA של תא יחיד. אסטרטגיית שער ה-FACS הייצוגית מוצגת באיור 1. הגרעינים נבחרו לראשונה בהתבסס על פיזור הקדמי (FSC) ופיזור בצד (למעלה) (א), אז, רק סינגטים נבחרו בהתבסס על שילוב של רוחב וגבהים של מדינת האס. אס. אס (ב). לבסוף, רק אירועים DAPI-חיוביים נבחרו וממוינים לתוך מאגר אוסף (C). זרימת עבודה זו מספקת מאוד מטוהרים גרעין יחיד ע...

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

פירוק רקמת השומן לתת-סוגים היה מאתגר מכיוון שהטבע השברירי של האדיפוזיטים. פרוטוקול זה פותח כדי להתגבר על זה על ידי בידוד יעיל של גרעינים בודדים. זרימת עבודה זו מספקת גרעיני יחיד מטוהרים ביותר עם אגרגטים גרעיניים ממוזערים ופסולת תאית.זה יתרון לפרופיל תמלול חד-תאי של אלפי תאים. פרוטוקול פשוט וחזק זה ניתן ליישם כדי ללמוד ארגון ברמת הרקמות של adipocyte בתאים שלהם תושב שומן. ובמיוחד, לפיתוח פנוטיפים, נוקאאוט שומן ועכברים מהומנים.הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית, כך שאנשים שאין להם ניסיון רב בטיפול adipocyte יכול לשכפל תובנה לתוך הטרוגניות שומן. לאחר איסוף רקמת שומן מעכברים, לטפוח אותו יבש עם מגבת נייר, ומניחים אותו בצלחת נקייה. מוסיפים סידן כלורי למאגר העיכול לריכוז סופי של 10 מ"מ.לאחר מכן, להוסיף נפח קטן לרקמה ביסודיות לטחון אותו. מוסיפים כמחצית מכמות מאגר העיכול המוכן לרקמה הטחון. ולהשתמש פיפטה סרולוגית להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.לשטוף את המנה עם המאגר הנותר ולהוסיף אותו צינור 50 מ"ל. פיפטה המדגם למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, הדגירה אותו במשך 12 עד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 200 עד 210 סל"ד.לאחר הדגירה, הוסף 0.5%BSA לדגימה ביחס נפח של 1 עד 1 ומערבב היטב על-ידי צינורות. צנטריפוגה המדגם ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את השבר stromovascular משאיר את שבר adipocyte על גבי. סנן את השבר העליון למרות מסנן תא 400 מ 'לתוך צינור 50 מ"ל.לאחר מכן, הפוך את המסנן במהופך מעל הצינור והעבר את האדיפוזיטים לצינור חדש באמצעות 0.5%BSA כדי לשטוף לאחור את המסנן. להביא את הנפח הכולל של BSA ל 10 עד 15 מ"ל ו pipette המדגם למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, צנטריפוגה זה שוב ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הצנטריפוגה, השתמש בקצה פיפטה רחב כדי להעביר בזהירות את השכבה העליונה של המדגם למסנן תאים של 100 מ 'על גבי צינור חדש מקורר מראש על קרח. לשטוף את המסנן עם כמות מספקת של מאגר הכנת גרעינים, ולאחר מכן להשליך אותו. מצעד זה ואילך, שמור דגימה על קרח ועבוד במהירות.השאירו את הדגימה על קרח עד שתי דקות לסירוגין היפוך הצינור לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1000 xg ו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה ב 1 מ"ל של מאגר הכנת גרעינים.מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי מטפל כדי למנוע נגיעה בקירות הצינור הישן. מוסיפים 0.6 יחידות למעכב RNase ומערבבים אותו. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות נוספות.הסר את supernatant ו resuspend גלולה ו 1 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים. סנן פעמיים את הדגימה לתוך צינור נקי באמצעות מסננים לערימת 30 מ '. לאחר מכן, לשטוף את המסננים עם כ 300 L של מאגר לשטוף גרעינים.כדי לאשר בידוד מוצלח של גרעינים בריאים, הכתם aliquot קטן של המדגם עם trypan ולהשתמש מונה תאים אוטומטיים כדי להעריך את גודל מת ממוצע ואחוז של תאים מתים. הכתם ב aliquot קטן של המדגם עם DAPI ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ עם מטרה 20X ומעלה. הגרעינים צריכים להיות עגולים ויש להם קרום גרעיני שלם.חצים לבנים מצביעים על גרעינים ללא קרום שלם. לאחר ניקוי הגרעינים עם FACS, לרכז מדגם זה על ידי צנטריפוגה ב 500 xg במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש אותו בנפח המתאים של מאגר שטיפת גרעינים.כדי להשיג 50 עד 1500 גרעינים לכל ריכוז L ולהמשיך עם זרע RNA גרעיני תא יחיד. כדי להסיר פסולת סלולרית וכפולים, גרעיני adipocyte ממוינים לגודל וצפיפות כדי לא לכלול אגרגטים גרעיניים multiplets. ולבסוף לאירועים חיוביים DAPI.אסטרטגיית דירוג זו גורמת לגרעין יחיד מטוהר מאוד עם אגרגטים ופסולת מינימליים. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה, הגרעינים ממוינים צריך להיות עגול יש קרום שלם. טיהור מוצלח של הגרעינים יכול להתבצע גם עם qRT-PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים עבור ucp1 mRNA המתהווה, גן סמן עבור adipocytes חום.פלטפורמת הכרום קבעה תמלול של 7500 גרעינים מרמת שומן חומה בין-שרירית של מורין. שבעה סוגי תאים שונים התגלו עם הפחתת ממדי T-SNE וקיבוץ באשכולות k-פירושו. כל האשכולות ביטא Fabp4, גן adipocyte פאן קבוצת משנה ביטא רמה גבוהה של Ucp1 mRNA.גרעיני מבודד ולאחר מכן אישר למרות פרוטוקול זה יכול להיות נתון כמעט כל פלטפורמה ביטוי גנים ברמת תא יחיד כולל כרום מ 10x Genomics.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מכליות עכבר קפואות המשפרים את ייצוג סוגי תאי הכליה המדולריים ומונעים את ביטוי הגנים מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.

ATAC-Seq ספציפי לאדיפוציט עם רקמות שומן באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

הביולוגיה של רקמת השומן הבין-שרירית (IMAT) לא נחקרה במידה רבה בשל הנגישות המוגבלת של רקמת האדם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד גרעינים והכנת ספרייה של IMAT אנושי קפוא לריצוף RNA של גרעינים בודדים כדי לזהות את ההרכב התאי של מחסן שומן ייחודי זה.

בידוד גרעינים מרקמת שומן בין-שרירית אנושית וריצוף RNA חד-גרעיני במורד הזרם

למדו בידוד גרעינים יחידים מתאי שומן בוגרים לצורך פרופיל תעתיקי תא-יחיד באיכות גבוהה. פרוטוקול זה ממזער צבירות גרעיניות ופסולת תאית ומאפשר חקר ארגון רקמת השומן.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

גלה סרטונים נוספים