בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד
12 ביוני 2020
פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.
פירוק רקמת השומן לתת-סוגים היה מאתגר מכיוון שהטבע השברירי של האדיפוזיטים. פרוטוקול זה פותח כדי להתגבר על זה על ידי בידוד יעיל של גרעינים בודדים. זרימת עבודה זו מספקת גרעיני יחיד מטוהרים ביותר עם אגרגטים גרעיניים ממוזערים ופסולת תאית.
זה יתרון לפרופיל תמלול חד-תאי של אלפי תאים. פרוטוקול פשוט וחזק זה ניתן ליישם כדי ללמוד ארגון ברמת הרקמות של adipocyte בתאים שלהם תושב שומן. ובמיוחד, לפיתוח פנוטיפים, נוקאאוט שומן ועכברים מהומנים.
הדגמה חזותית של פרוטוקול זה היא קריטית, כך שאנשים שאין להם ניסיון רב בטיפול adipocyte יכול לשכפל תובנה לתוך הטרוגניות שומן. לאחר איסוף רקמת שומן מעכברים, לטפוח אותו יבש עם מגבת נייר, ומניחים אותו בצלחת נקייה. מוסיפים סידן כלורי למאגר העיכול לריכוז סופי של 10 מ"מ.
לאחר מכן, להוסיף נפח קטן לרקמה ביסודיות לטחון אותו. מוסיפים כמחצית מכמות מאגר העיכול המוכן לרקמה הטחון. ולהשתמש פיפטה סרולוגית להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
לשטוף את המנה עם המאגר הנותר ולהוסיף אותו צינור 50 מ"ל. פיפטה המדגם למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן, הדגירה אותו במשך 12 עד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 200 עד 210 סל"ד.
לאחר הדגירה, הוסף 0.5%BSA לדגימה ביחס נפח של 1 עד 1 ומערבב היטב על-ידי צינורות. צנטריפוגה המדגם ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לסובב את השבר stromovascular משאיר את שבר adipocyte על גבי. סנן את השבר העליון למרות מסנן תא 400 מ 'לתוך צינור 50 מ"ל.
לאחר מכן, הפוך את המסנן במהופך מעל הצינור והעבר את האדיפוזיטים לצינור חדש באמצעות 0.5%BSA כדי לשטוף לאחור את המסנן. להביא את הנפח הכולל של BSA ל 10 עד 15 מ"ל ו pipette המדגם למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, צנטריפוגה זה שוב ב 300 xg במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הצנטריפוגה, השתמש בקצה פיפטה רחב כדי להעביר בזהירות את השכבה העליונה של המדגם למסנן תאים של 100 מ 'על גבי צינור חדש מקורר מראש על קרח. לשטוף את המסנן עם כמות מספקת של מאגר הכנת גרעינים, ולאחר מכן להשליך אותו. מצעד זה ואילך, שמור דגימה על קרח ועבוד במהירות.
השאירו את הדגימה על קרח עד שתי דקות לסירוגין היפוך הצינור לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1000 xg ו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה ב 1 מ"ל של מאגר הכנת גרעינים.
מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי מטפל כדי למנוע נגיעה בקירות הצינור הישן. מוסיפים 0.6 יחידות למעכב RNase ומערבבים אותו. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות נוספות.
הסר את supernatant ו resuspend גלולה ו 1 מ"ל של מאגר שטיפת גרעינים. סנן פעמיים את הדגימה לתוך צינור נקי באמצעות מסננים לערימת 30 מ '. לאחר מכן, לשטוף את המסננים עם כ 300 L של מאגר לשטוף גרעינים.
כדי לאשר בידוד מוצלח של גרעינים בריאים, הכתם aliquot קטן של המדגם עם trypan ולהשתמש מונה תאים אוטומטיים כדי להעריך את גודל מת ממוצע ואחוז של תאים מתים. הכתם ב aliquot קטן של המדגם עם DAPI ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ עם מטרה 20X ומעלה. הגרעינים צריכים להיות עגולים ויש להם קרום גרעיני שלם.
חצים לבנים מצביעים על גרעינים ללא קרום שלם. לאחר ניקוי הגרעינים עם FACS, לרכז מדגם זה על ידי צנטריפוגה ב 500 xg במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מחדש אותו בנפח המתאים של מאגר שטיפת גרעינים.
כדי להשיג 50 עד 1500 גרעינים לכל ריכוז L ולהמשיך עם זרע RNA גרעיני תא יחיד. כדי להסיר פסולת סלולרית וכפולים, גרעיני adipocyte ממוינים לגודל וצפיפות כדי לא לכלול אגרגטים גרעיניים multiplets. ולבסוף לאירועים חיוביים DAPI.
אסטרטגיית דירוג זו גורמת לגרעין יחיד מטוהר מאוד עם אגרגטים ופסולת מינימליים. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה, הגרעינים ממוינים צריך להיות עגול יש קרום שלם. טיהור מוצלח של הגרעינים יכול להתבצע גם עם qRT-PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים עבור ucp1 mRNA המתהווה, גן סמן עבור adipocytes חום.
פלטפורמת הכרום קבעה תמלול של 7500 גרעינים מרמת שומן חומה בין-שרירית של מורין. שבעה סוגי תאים שונים התגלו עם הפחתת ממדי T-SNE וקיבוץ באשכולות k-פירושו. כל האשכולות ביטא Fabp4, גן adipocyte פאן קבוצת משנה ביטא רמה גבוהה של Ucp1 mRNA.
גרעיני מבודד ולאחר מכן אישר למרות פרוטוקול זה יכול להיות נתון כמעט כל פלטפורמה ביטוי גנים ברמת תא יחיד כולל כרום מ 10x Genomics.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד יעיל של גרעינים בודדים מאדיפוציטים בוגרים, המעניק יכולת משופרת למחקר של ארגון רקמת השומן. תהליך העבודה מפחית את היווצרותם של צבירי גרעינים ושל שיירי תאים, ובכך מאפשר ביצוע פרופיל תמלול של תאים בודדים באיכות גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר רקמת שומן
רקע
- פירוק של רקמת שומן לתתי-סוגים הוא מאתגר בשל טבעם השביר של האדיפוציטים.
- בידוד יעיל של גרעינים בודדים הוא קריטי לצורך ניתוח מדויק.
- פרוטוקול זה נועד לספק שיטה חסונה לחקר ארגון האדיפוציטים.
- ניתן ליישם אותו בתחומי מחקר שונים, כולל פנוטיפציה ומחקרים גנטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לבידוד גרעינים בודדים מאדיפוציטים.
- מתן אפשרות לאפיון איכותי של התמלס (transcriptome) ברמת התא הבודד.
- סיוע במחקר על ארגון ותפקוד של רקמת שומן.
שיטות בשימוש
- בידוד גרעינים מאדיפוציטים בוגרים.
- טיהור באמצעות מיון מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- טרנסקריפטומיקה ברמת התא הבודד.
- מזעור של אגרגטים גרעיניים ושאריות תאיות.
תוצאות עיקריות
- התקבלו גרעינים בודדים בדרגת טהרה גבוהה.
- הפרוטוקול הוכיח חסינות ופשטות.
- סייע לחקר ארגון האדיפוציטים בתאים תושבים.
- אפשר ביצוע פנוטיפיקציה של עכברים טרנסגניים ועכברי knockout של רקמת שומן.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לבידוד גרעינים בודדים.
- הוא מספק כלי בעל ערך לניתוח טרנסקריפטום של תא בודד.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של רקמת שומן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד גרעינים בודדים מרקמת שומן מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של ההטרוגניות התאית במאגרי שומן תרמוגניים, ובכך פותר צוואר בקבוק מרכזי במחקר ביולוגיה של רקמת שומן. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת תתי-אוכלוסיות נפרדות של אדיפוציטים בעלות מקור התפתחותי ותפקודים מטבוליים ייחודיים. הנתונים המתקבלים משפרים את רמת הוודאות החיזויית במודלים פרה-קליניים של השמנה ומחלות מטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ההטרוגניות ברקמת השומן כדי לזהות תתי-סוגים של אדיפוציטים בעלי תפקודים שונים.
- ערך תפעולי: מספק גרעינים מטוהרים ליישומים של אומיקה (omics) בהמשך, ובכך מפחית אותות מבלבלים מאדיפוציטים בוגרים עתירי ליפידים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של ריצוף RNA גרעיני בודד (single-nucleus RNA-seq) המתאימים לגילוי סמנים ביולוגיים וניתוח מסלולים.
- ערך תפעולי: מספק תכשירי גרעינים ניתנים לשחזור התואמים לפלטפורמות בעלות תפוקה גבוהה כגון 10x Genomics Chromium.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין טרנסקריפטומיקה גרעינית לתוצאות פנוטיפיות במודלים טרנסגניים ובמודלים של נקישה (knockout) ספציפיים לרקמה שומנית.
- ערך תפעולי: תומך במחקרים אורך של עיצוב מחדש (remodeling) של רקמה שומנית תחת אתגר מטבולי או התערבות טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת פרופיל מולקולרי של רקמת שומן לפני תיקוף תפקודי במודלים של מחלות.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשר פירוק בלתי מוטה של רקמת שומן לתת-סוגים תאיים לצורך יצירת היפותזות.
- סריקה: מייצר תרחיפי גרעינים סטנדרטיים המתאימים לריצוף תאים בודדים ברמת קנה מידה רחב.
- אנליטיקה: מספק תוצרי קריאה טרנסקריפטומיים המאפשרים השוואה של מצבי תאים בין תנאים גנטיים או סביבתיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין חתימות מולקולריות לבין תפקוד רקמת השומן במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לבידוד גרעינים, הישומה על מאגרי אדיפוציטים שונים ורקעים גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי פתרון של מורכבות רקמת השומן ברזולוציה של גרעין בודד.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבים סטנדרטיים של דיסוציאציה, סינון ומיון מופעל פלואורסצנציה.
- ערך אסטרטגי: מפחית נשירה בשלבים מאוחרים על ידי שיפור ההבנה המכניסטית של תגובות רקמת השומן.
- השפעה על תיק הפיתוח: מספק בסיס לתעדוף מותאם סיכונים של מטרות המעורבות בדיפרנציאציה של אדיפוציטים ובטרמוגנזה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפירוק רקמות, הכנת גרעינים ומיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).
- תלוי בגישה לצנטריפוגות, מסנני תאים, ציטומטרים זרימה ופלטפורמות לריצוף תאים בודדים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין מעבדות כדי להבטיח עקביות בתשואת הגרעינים ובטוהרם.
- בעת התאמת הפרוטוקול, יש להביא בחשבון שונות במקור הרקמה השומנית (מאגר, מין, מצב מטבולי).
- מוגבל על ידי שלמות ה-RNA בגרעינים, דבר העלול להשפיע על הרגישות לתמלילים בשפע נמוך.
