מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m⁵C שינוי ערבידופסיס

משקעים חיסוניים של RNA מתילציה, הנקראת גם MeRIP, היא שיטה שנועדה לזהות קבוצות מתילציה בטרנסקריפטומים שלמים. ניתן להתאים אותו לתמציות RNA של אורגניזמים מודלים רבים. השיטה פשוטה, אינה דורשת טיפול כימי קשה, וניתן להשתמש בה למיפוי כל שינוי RNA כל עוד משתנה ספציפי.

כדי לחלץ את דגימת ה-RNA, יש לטחון תחילה 200 מיליגרם מדגימת רקמת הצמח המעניינת לאבקה בחנקן נוזלי, תוך הקפדה על כך שהרקמה תישאר קפואה לאורך כל ההליך. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מגיב מיצוי RNA המכיל גואנידין תיוציאנט ופנול חומצה לרקמת הצמח הטחונה וערבב היטב על ידי היפוך, וודא שכל הרקמה רטובה. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את הדגימות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.

הוסף 200 מיקרוליטר של 1-ברומו-3-כלורופרופאן לסופרנטנט ומערבל במרץ את הדגימה. הפרד את השלבים על ידי צנטריפוגה והעביר כ -500 מיקרוליטר מהפאזה המימית העליונה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף לדגימה 500 מיקרוליטר איזופרופנול ו-50 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי וערבב היטב על ידי היפוך.

דגרו את הדגימה למשך 10 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס לפני שתזרזו את ה-RNA על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת הסופרנטנט יש לשטוף את הגלולה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של 80% אתנול ופעם אחת עם 500 מיקרוליטר של 99% אתנול. לאחר הכביסה האחרונה, יבש את הגלולה במשך חמש עד 10 דקות לפני המסה ב-30 מיקרוליטר מים ללא RNase.

מדוד את ריכוז ה-RNA בספקטרופוטומטר ועכל 20 מיקרוגרם של דגימת ה-RNA בתמיסת מים וחוצץ DNase. לאחר דגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, השתמש בנפח מתאים של מגיב אינאקטיבציה של DNase כדי להסיר את האנזים ולבדוק את האיכות והטוהר של ה-RNA המבודד על ידי אלקטרופורזה נימית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. אם מספר שלמות ה-RNA של דגימת ה-DNase המעוכלת גבוה משבע, הוסף לפחות 12 מיקרוגרם מכל דגימת RNA לצינור חדש.

ספייק ב-0.1 ננוגרם מכל תעתיק שהוכן בעבר במבחנה, אחד מתילציה ואחד ללא מתילציה, לכל שלושה מיקרוגרם של דגימת RNA והביא את הנפח הסופי בכל צינור ל-80 מיקרוליטר עם מים ללא RNase. לאחר מכן סוניקציה של כל הנפח של כל דגימת RNA בצינורות סוניקציה בודדים ואשר את יעילות הסוניקציה ואת ריכוז דגימות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה נימית. הגודל הממוצע של ה-RNA המקוטע צריך להיות בסביבות 100 נוקלאוטידים.

עבור משקעים חיסוניים של RNA שעבר מתילציה, הוסף תשעה מיקרוגרם מכל דגימת RNA סוניקציה ועד 60 מיקרוליטר מים נטולי RNase לצינורות קשירה נמוכים בודדים חדשים וחממו את ה-RNA ל-70 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 10 דקות. בתום הדגירה, יש לקרר את הדגימות למשך 10 דקות באמבט מי קרח ולהעביר 20 מיקרוליטר מכל דגימה לצינור קשירה נמוך חדש לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס כקלט. הוסף מים נטולי RNase ל-40 המיקרוליטרים הנותרים של כל דגימה לנפח סופי של 860 מיקרוליטר ופצל כל דגימה לצינור קשירה נמוך אחד למשקעים חיסוניים וצינור קשירה נמוך אחד כדגימה מדומה.

הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר MeRIP 10X ו-10 מיקרוליטר של מעכב RNase לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של נוגדן נגד M5C לצינורות המשקעים החיסוניים ו-10 מיקרוליטר מים לצינורות המדומים. אטמו את הצינורות עם פרפילם ודגרו את הדגימות למשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עילי.

למחרת בבוקר, הוסף 40 מיקרוליטר חרוזים לצינור אחד של 15 מיליליטר לדגימה. שטפו את החרוזים בשלוש שטיפות של חמש דקות עם 800 מיקרוליטר של מאגר MeRIP וסיבוב תקורה לכל דגימה לכל שטיפה, ואספו את החרוזים על מגנט לאחר כל שטיפה כדי לאפשר להשליך את המאגר. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את החרוזים ב-40 מיקרוליטר של מאגר MeRIP טרי לכל דגימה והוסיפו 40 מיקרוליטר של חרוזים תלויים למשקעים החיסוניים ולצינורות הדגימה המדומים לדגירה של שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב תקורה.

בסוף הדגירה, הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת לפני שתשליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים. שטפו את החרוזים חמש פעמים ב-700 מיקרוליטר של מאגר MeRIP בתוספת 0.01%Tween-20 למשך 10 דקות לכל שטיפה בטמפרטורת החדר עם סיבוב תקורה. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את החרוזים ב -200 מיקרוליטר חיץ עיכול חלבון K ו -3.5 מיקרוליטר חלבון K למשך שלוש שעות דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם טלטול ב -800 סיבובים לדקה.

בתום הדגירה, חלץ את ה-RNA עם 800 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA ואת פרוטוקול מיצוי החומצה גואנידיניום תיוציאנט פנול כלורופורם כפי שהודגם. לאחר המיצוי, השעו מחדש את כדור ה-RNA המופק ב-20 מיקרוליטר בדיוק של מים נטולי RNase. באיור זה מוצגת ריצה מייצגת של דגימת RNA טובה.

באותה דגימה לאחר סוניקציה, ניתן להבחין בנוכחות של שיא אחיד אחד שהוסט שמאלה בגודל של כ-100 נוקלאוטידים. הריכוז הנמוך יותר נגרם הן מאובדן RNA במהלך הפיצול והן מהנפח המוגבר של הדגימה. ניתן להעריך את איכות המשקעים החיסוניים והדגימות המדומות על ידי PCR כמותי של טרנסקריפטאז הפוך.

בניתוח מייצג זה, כ-80% מתעתיק המתילציה במבחנה שוחזר בדגימת המשקעים החיסוניים בעוד שרק כ-2% שוחזרו בדגימה המדומה. עבור הביקורת ללא מתילציה, ההתאוששות הייתה מתחת ל-1% הן בדגימות החיסון והן בדגימות המדומה. לאחר ריצוף עמוק ויישור הקריאות לגנום, ניתן ליישם אלגוריתמים של שיחות שיא כדי לזהות את החלונות המשמעותיים סטטיסטית המועשרים בדגימות המשקעים החיסוניים בהשוואה לקלט.

באמצעות נתוני הריצוף, אנו יכולים לזהות את המניע שבו מתרחשת מתילציה של RNA לרוב ומניע זה יכול לשמש כפיתיון למשיכת חלבוני קישור ספציפיים.