Name: מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למד את שיטת MeRIP לאיתור שינויים מתילציה ב-RNA בצמחים. טכניקת אימונואוציאציה זו מאפשרת עשירת רנא מתילציה וזיהוי תעתיקים עם שינוי m5C באמצעות ריצוף עמוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של IMPRS ל- E.S, מלגת EMBO לטווח ארוך לסמנכ"ל כספים, וקרנות פנימיות של MPI-MPP ל- F.K. חלק מעבודה זו מומנה גם באמצעות PLAMORF, פרויקט שקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס ' 810131). המחברים מבקשים להודות לפדריקו אפלט על הניתוח הביואינפורמטי וההערות על כתב היד, ומתיו בהין ואמירה קראמדי על הניתוח הביואינפורמטי.

1. הכנת ה- RNA
<ol><li>טוחנים 200 מ"ג של רקמת צמח לאבקה בחנקן נוזלי, ומוודאים שהרקמה נשארת קפואה לאורך כל ההליך.</li>
	<li>לחלץ את ה-RNA מרקמת הצמח הרצוי בעקבות חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פרוטוקול החילוץ. כדי להקטין את האפשרות לזהם RNA עם DNA במהלך הפרדת הפאזה, השתמש 1-ברומו-3-כלורופרופן במקום כלורופורם.<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA המכיל guanidine thiocyanate וחומצה פנול לרקמת הצמח טחון (500 μL לכל 100 רקמת מ"ג). מערבבים היטב על ידי היפוך ולוודא את כל הרקמה רטובה. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את מתחמי ריבונוקלאופרוטאין.</li>
		<li>צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 200 μL של 1 ברומו-3-כלורופרופן (100 μL לכל 500 μL RNA מיצוי מגיב) ומערבולת במרץ.</li>
		<li>צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את השלב מימית העליונה (כ. 500 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הוסף 1 נפח של איזופרופנול (500 μL) ו 0.1 נפח של 3 M נתרן אצטט pH 5.5 (50 μL), לערבב היטב על ידי היפוך מזרז 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מומלץ להשתמש בנתרן אצטט (NaOAc) על מנת לשפר את המשקעים של ה-RNA. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה על ידי הארכת המשקעים של RNA במשך כמה שעות או אפילו לילה.</li>
		<li>צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולזרוק את supernatant.</li>
		<li>לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 μL של 80% EtOH, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס להשליך.</li>
		<li>לשטוף את גלולה פעם אחת עם 500 μL 99% EtOH, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 12,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס להשליך.</li>
		<li>יבש את גלולה במשך 5-10 דקות להתמוסס ב 30 μL של RNase חינם H2O. הערה: במקום זאת, השתמש בכל פרוטוקול חילוץ RNA לבחירה (למשל, מערכת מבוססת עמודה). אם תקציר DNase כלול בפרוטוקול, דלג עליו בשלב הבא (שלב 1.3).</li>
	</ol></li>
	<li>למדוד את ריכוז RNA (למשל, עם השימוש בספקטרופוטומטר) ולעכל 20 מיקרוגרם של RNA עם DNase. הערה: הדנ"א עשירב-m 5C והנוגדן אינו מבחין בין דנ"א ל-RNA.<ol>
<li>בתגובת DNase טיפוסית, לטפל 10 מיקרוגרם של RNA בתגובה 50 μL. מערבבים את הרכיבים הבאים ומדגרים את התגובות ב-37°C למשך 30 דקות: 10 מיקרוגרם של RNA x μL מאגר DNase 10x 5 μL DNase 1 μL (2 יחידות) H2O ללא RNase עד 50 μL</li>
		<li>הסר את האנזים או על ידי הוספת נפח מתאים של מגיב איון DNase (אם הוא כלול בערכת DNase ועל פי הוראות היצרן) או על ידי ביצוע צעד ניקוי (למשל, טיהור עמודה או מיצוי פנול / כלורופורם).</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק את האיכות והטוהר של RNA מבודד על ידי אלקטרופורזה נימי ולהמשיך אם מספר שלמות RNA (RIN) גבוה מ 7, כדי להבטיח את הדגימות הן באיכות טובה.</li>
	<li>אופציונלי: הסר את RNA ריבוזומלי כדי להעשיר את הדגימות בתוכן mRNA באמצעות ערכת הסרת rRNA ועל פי פרוטוקול היצרן.<ol>
<li>השתמש ב- DNase שטופלו ב- RNA מהשלב הקודם לתגובת דלדול rRNA. בצע תגובות מרובות אם כמות ה- RNA הכוללת היא יותר מהכמות המרבית המוצעת לתגובה.</li>
		<li>שים לב כי רק 5-10% מסכום הקלט יתאושש לאחר דלדול rRNA. המשך עם RNA מדולדל rRNA (כמות שווה עבור כל הדגימות) ולהתעלם הסכומים שהוזכרו בשלבים הבאים, כפי שהם מתייחסים RNA הכולל. הערה: להשוואה ותיאור של שיטות דלדול rRNA זמין ראה הפניות 38,39,40. rRNA הוא החלק העיקרי של RNA הכולל והוא m5C מתילציה באורגניזמים רבים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן מראש תעתיקי במבחנה (IVT) שישמשו כרצפי RNA של בקרה והוסף אותם בדגימות.<ol>
<li>לייצר שני IVTs נפרדים באמצעות ערכת שעתוק במבחנה, אחד עם נוקלאוזידים שאינם מתילציה ואחד שבו rCTP מוחלף על ידי 5-מתיל-rCTP, כדי לשמש פקדים שליליים וחיוביים MeRIP, בהתאמה. התמלילים שהוכנו היו אלה של EGFP ורניה לוציפראז. הערה: IVTs לא צריך להתקיים בתעתיק של האורגניזם שאתה מנתח. אם ה- IVTs הם מאותה תבנית (למשל, שניהם EGFP), הוסף את הפקד החיובי והשלילי בשתי דגימות שונות. אם הרצף שלהם שונה (למשל, EGFP ו- Renilla), ניתן להוסיף אותם לאותה דגימה.</li>
		<li>ספייק בכל מדגם 0.1 ng IVT לכל 3 מיקרוגרם של RNA, כפקדים.</li>
	</ol></li>
	<li>ל סוניק את ה-RNA לכ-100 nt שברים. הערה: התנאים לגזירה RNA חייב להיות מותאם מראש והם שונים עבור כל sonicator. עבור המודל המשמש כאן, sonication מבוצעת עם התנאים הבאים: כוח שיא 174, גורם חובה 10, מחזורים / פרץ 200, 17 דקות.<ol>
<li>Sonicate אותה כמות של RNA עבור כל הדגימות, לפחות 12 מיקרוגרם RNA לכל מדגם ב 80 μL של נפח כולל (מינימום 60 μL, מקסימום 100 μL), מלא RNase חינם H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>אשר את היעילות של sonication ואת הריכוז של דגימות RNA על ידי אלקטרופורזה נימי. הגודל הממוצע של RNA מקוטע צריך להיות סביב 100 nt.</li>
</ol>2. מתילציה RNA אימונופרציפיטציה (MeRIP)
<ol><li>בצינורות בעלי כריכה נמוכה, הוסיפו 9 מיקרוגרם של RNA sonicated ו- RNase ללא H2O עד 60 μL (או יותר, בהתאם לריכוז).</li>
	<li>לנתק את המבנים המשניים על ידי חימום RNA ב 70 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות וקירור במשך 10 דקות נוספות בתערובת מי קרח.</li>
	<li>לפצל את המדגם בשלושה חלקים: שליש (20 μL, אם 60 μL נלקחו בשלב 2.1) נשמר בצינור נפרד ב -80 מעלות צלזיוס כמדגם הקלט. מלא את 40 μL הנותרים עם RNase חינם H2O עד 860 μL ולאחר מכן לפצל שני צינורות מחייב נמוך: אחד עבור IP ואחד עבור שליטה מדומה (430 μL כל אחד).</li>
	<li>הוסף לשני הצינורות: 50 μL של מאגר MeRIP 10x 10 μL של מעכב RNase 10 μL של נוגדן α-m5C (10 מיקרוגרם) במדגם IP לכל 10 μL של H2O במדגם מדומה הערה: שיבוט הנוגדנים ששימש בעבר אינו זמין מסחרית יותר. עם זאת, כל נוגדן חד שבטי אנטי 5-מתילסיטוסין צריך לעבוד באופן דומה. נוגדנים יש לבדוק את הספציפיות לפני השימוש עבור MeRIP11,23.</li>
	<li>לאטום את הצינורות עם parafilm ודגרת במשך 12-14 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב תקורה.</li>
	<li>למחרת, להכין את החלבון G חרוזים מגנטיים עבור קשירה.<ol>
<li>עבור כל צינור (בקרת IP או Mock), השתמש 40 μL של חרוזים. הוסף את הכמות הכוללת של חרוזים (# של צינורות x 40 μL, לדוגמה, עבור 2 דגימות IP ו 2 דמה, 160 μL של חרוזים נדרשים) בצינור 15 מ"ל ולשטוף שלוש פעמים עם 800 μL של 1x מאגר MeRIP לכל מדגם (# של צינורות x 800 מאגר μL, למשל, 3.2 מ"ל עבור 2 IP ו 2 דגימות מדומה).</li>
		<li>בצע שטיפות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם סיבוב תקורה, לאסוף את החרוזים בעזרת מתלה מגנטי להשליך את מאגר הכביסה. לאחר הכביסה השלישית, resuspend את החרוזים באותו נפח של 1x מאגר MeRIP כמו נפח הראשוני של חרוזים נלקח (# של צינורות x 40 μL, למשל, 160 μL של 1x מאגר MeRIP עבור 2 IP ו 2 דגימות מדומה). הערה: כמות החלבון G חרוזים בשימוש נקבעת על ידי יכולת הכריכה של החרוזים עבור סוג הנוגדן הספציפי ואת כמות הנוגדן בשימוש. במקרה זה, החרוזים יש קיבולת מחייבת של כ. 8 מיקרוגרם של העכבר IgG לכל מ"ג של חרוזים ו 30 מ"ג / מ"ל ריכוז. לכן, 40 μL מספיקים כדי לאגד כ. 9.6 מיקרוגרם של נוגדן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף 40 μL של חרוזים בשימוש חוזר לכל מדגם IP ו Mock ודגירה במשך 2 שעות נוספות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב תקורה.</li>
	<li>מניחים את הצינורות על מתלה מגנטי במשך דקה ולזרוק את supernatant או לשמור אותו כפקד (מדגם RNA שאינו מאוגד).</li>
	<li>לשטוף את החרוזים 5 פעמים על ידי resuspending ב 700 μL של 1x מאגר MeRIP מסופק עם 0.01% Tween 20 ודגרת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב תקורה.</li>
	<li>מוציאים מחדש את החרוזים שנשטפו ב-200 μL של מאגר עיכול Proteinase K ומוסיפים 3.5 μL של Proteinase K. דגירה למשך 3 שעות ב-50°C, רועדים במהירות של 800 סל"ד. מדי פעם, להעיף באופן ידני את החלק התחתון של הצינור אם משקע של חרוזים נוצר במהלך הדגירה.</li>
	<li>לחלץ את ה-RNA על ידי תוספת של 800 μL של מגיב מיצוי RNA בעקבות חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פרוטוקול החילוץ, ולהמשיך כמו בשלב 1.2. כדי להגביר את הראות של גלולת RNA, משקעים צבעוניים ניתן להוסיף isopropanol בשלב המשקעים. Resuspend גלולה ב 20 μL של RNase חינם H2O (או שווה נפח קלט נשמר בשלב 2.3).</li>
</ol>3. ניתוח במורד הזרם
<ol><li>שלח את דוגמאות הקלט וה- IP עבור רצף קצה יחיד עם אורך קריאה של 50 בסיסים (SE50).</li>
	<li>חותכים מתאמי קצה 3' באמצעות cutadapt41 ולזרוק קריאות כי הם קצרים מ 48 nt.</li>
	<li>מפה קצוצה קוראת לגנום Arabidopsis (ביאור TAIR10) באמצעות STAR42 עם ניתוק של 6% עבור אי התאמות וגודל אינטרון מקסימלי של 10 kb. שמור קריאות הממופות באופן ייחודי לצורך ניתוח נוסף.</li>
	<li>זהה שברי RNA מועשרים בדגימות IP בהשוואה לקלט באמצעות שתי שיטות נפרדות ושקול את אלה שנמצאו מועשרים באופן משמעותי על ידי שניהם.<ol>
<li>תחילה, זהה פסגות MeRIP-seq באמצעות MACS2 שיא המתקשר43 על IPs במאגר לעומת קלט.</li>
		<li>שנית, בצע את הניתוח עבור שיחות שיא MeRIP-seq כמתואר מאייר ואח'22 ויאנג ואח'17.<ol>
<li>באמצעות סקריפטים R מותאמים אישית, לחלק את הגנום בחלונות nt 25 nt ייחודי לספור את מספר קריאות ממופה באופן ייחודי עבור כל חלון בהתבסס על המיקום של נוקלאוטידים ממופה האחרון (מאז הקריאות מקורם 100 nt שברי RNA).</li>
			<li>חשב חלונות מועשרים באופן משמעותי בדגימות IP בהשוואה לקלט עם הבדיקה המדויקת של פישר.</li>
			<li>שמור על הפסגות המועשרות באופן משמעותי המשתרעות על פני שני חלונות רצופים לפחות ומשליכות פסגות המכסות חלון אחד בלבד.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>זהה אזורים מבוארים של הגנום (תעתיקים) עם פסגות מועשרות באופן משמעותי שנמצאו על ידי שתי השיטות.</li>
	<li>לחלופין או באופן משלים, בדוק יעדי RNA ספציפיים להעשרתם בדגימות ה- IP.<ol>
<li>הפוך לתמלל את RNA (אותו נפח של דגימות קלט, IP ו Mock) עם hexamers אקראי.</li>
		<li>בצע PCR כמותי בזמן אמת על המטרות שנבחרו, השוואת קלט, IP ו Mock באמצעות שיטת ΔΔCt. הערה: המוצר שנוצר לא צריך להיות ארוך יותר מ 100 bp, כמו זה הוא גודל הפיצול הממוצע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Trixl, L., Lusser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+RNA+modification+5-methylcytosine+and+its+emerging+role+as+an+epitranscriptomic+mark%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).</li>
<li>Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of RNA methylation.</a> F1000Research. 8, 559(2019).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).</li>
<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).</li>
<li>Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+order+to+translation%3A+the+contributions+of+transfer+RNA+anticodon-domain+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications.</a> EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).</li>
<li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Nucleotide+Repertoire+of+the+Ribosome+with+Post-Transcriptional+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications.</a> ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).</li>
<li>Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+methylations+in+the+domain+IV+of+25S+rRNA+is+required+for+ribosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability.</a> RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).</li>
<li>Motorin, Y., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA+Stabilization+by+Modified+Nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">tRNA Stabilization by Modified Nucleotides.</a> Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).</li>
<li>Shatkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capping+of+eucaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capping of eucaryotic mRNAs.</a> Cell. 9 (4), 645-653 (1976).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+6+-Methyladenosine+RNA+Modification+Regulates+Shoot+Stem+Cell+Fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis.</a> Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+RNA+Methylation+in+Arabidopsis+Thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).</li>
<li>Huber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+abundance+of+5-hydroxymethylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA.</a> ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).</li>
<li>Zuber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridylation+and+PABP+Cooperate+to+Repair+mRNA+Deadenylated+Ends+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis.</a> Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).</li>
<li>Luo, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+features+of+the+m6A+methylome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Communications. 5 (1), 5630(2014).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+high-throughput+deep+m6A-seq+reveals+unique+differential+m6A+methylation+patterns+between+three+organs+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana.</a> Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-Wide+Mapping+of+RNA+5-Methylcytosine+in+Arabidopsis+mRNAs+and+Noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs.</a> The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m5C+Methylation+Guides+Systemic+Transport+of+Messenger+RNA+over+Graft+Junctions+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants.</a> Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analysis+of+pseudouridylation+of+mRNA+and+non-coding+RNAs+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089(2019).</li>
<li>Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+mRNA+modification+landscape+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">In search of the mRNA modification landscape in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 421(2019).</li>
<li>Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Modifications+of+mRNA+and+DNA+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants.</a> Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+mRNA+Methylation+Reveals+Enrichment+in+3%27+UTRs+and+near+Stop+Codons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m5C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs.</a> PLoS genetics. 9 (6), 1003602(2013).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+N1-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N1-methyladenosine+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).</li>
<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+separation+of+purines%2C+pyrimidines%2C+and+nucleosides+by+paper+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).</li>
<li>Wyatt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurence+of+5-Methyl-Cytosine+in+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids.</a> Nature. 166, 237-238 (1950).</li>
<li>Dubin, D. T., Taylor, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylation+state+of+poly+A-containing-+messenger+RNA+from+cultured+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells.</a> Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSun2-mediated+cytosine-5+methylation+of+vault+noncoding+RNA+determines+its+processing+into+regulatory+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs.</a> Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).</li>
<li>Khoddami, V., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+direct+targets+and+modified+bases+of+RNA+cytosine+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases.</a> Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).</li>
<li>Burgess, A., David, R., Searle, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+tRNA+and+rRNA+5-methylcytosine+in+the+kingdom+Plantae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae.</a> BMC Plant Biology. 15 (1), 199(2015).</li>
<li>Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cytosine+methylation+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).</li>
<li>Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+tRNA+m+%285%29+C+methyltransferase+Misu+is+multisite-specific%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific.</a> RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li>
<li>Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+rRNA+depletion+procedures+for+the+improved+analysis+of+bacterial+biofilm+and+mixed+pathogen+culture+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41114(2017).</li>
<li>Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+and+cost-effective+ribonuclease-based+rRNA+depletion+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics.</a> Nucleic Acids Research. 48 (4), 20(2020).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137(2008).</li>
<li>Saletore, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+birth+of+the+Epitranscriptome%3A+deciphering+the+function+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications.</a> Genome Biology. 13 (10), 175(2012).</li>
<li>Schwartz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cracking+the+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Cracking the epitranscriptome.</a> RNA. 22 (2), 169-174 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).</li>
<li>Keith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilities+of+modified+ribonucleotides+on+two-dimensional+cellulose+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography.</a> Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).</li>
<li>Feederle, R., Schepers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+specific+for+nucleic+acid+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibodies specific for nucleic acid modifications.</a> RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).</li>
<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+N+6+-Methyladenosine+%28m+6+A%29+Map+Using+Photo-Crosslinking-Assisted+m+6+A+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

RNA נושא יותר ממאה שינויים בסיסיים נפרדים4 היוצרים את האפיטראנפרנודום44. שינויים אלה מוסיפים שכבה נוספת של רגולציה של תרגום ואיתות (נבדק ב5,6,8,20,45,46). מחקרים מוקדמים הצליחו לזהות את נוכחותם של שינויים שלאחר שעתוק על RNA28,47 אבל RNAs שונה ספציפי צריך להיות מזוהה על מנת להבין את התפקיד של אפיטראנודיה. MeRIP תוכנן כשיטה למיפוי אתרי מתילציה RNA תעתיק רחב21,22. זה יכול להיות מותאם לכל שינוי, אם נוגדן ספציפי זמין.
החוזק העיקרי של פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, בטוח עבור RNA והמשתמש (למשל, 5-azaC הוא רעיל מאוד עבור צמחים ובני אדם) ואינו דורש רצף או שינוי מידע אנזים. יתר על כן, העשרת RNAs מתילציה על ידי ה-IP מגדילה את הסיכויים של mRNAs בשפע נמוך להתגלות, בניגוד רצף ביסולפיט שאינו מכיל צעד העשרה. כאשר מבוצעים שני סבבים סדרתיים של MeRIP, העשרה בקטעי RNA המכילים אתרי מתילציה עולה עוד22. אחת המגבלות של MeRIP, במיוחד כאשר מוחל על מחקרי מתילציה mRNA, היא כמות גבוהה של RNA הנדרש כקלט עבור התסמכת. ריבודפלציה – או poly(A) העשרה – צעד יקטין את הרקע שנגרם על ידי RNA ריבוזומלי שונה בכבדות אבל זה מסיר יותר מ 90% של RNA הכולל. DNA חייב גם להיות מוסר לחלוטין כפי שהוא עשיר 5-מתילציה ציטוזינות. חיסרון נוסף הוא הרזולוציה הנמוכה יותר של המיקום המדויק של מתילציה. Sonication של RNA לפני הדגירה עם הנוגדן מסייע לכיוון זה על ידי צמצום האזור המכיל את השינוי 100-200 נוקלאוטידים. כאשר MeRIP משולב עם רצף עמוק, הרזולוציה של חיזוי אתר m5C גדלה ככל שהרצף קורא ליצור התפלגות גאוסיאנית סביב אתר מתילציה פוטנציאלי. בנוסף, יש לאשר את הספציפיות של הנוגדן לפני ההסתעפות (למשל, עם מבחני כתמי נקודה RNA, המבוצעים עם אוליגוס מסונתז עם נוקלאוטידים מותאמים), עם זאת, עד כמה נוגדן יכול למעשה להבחין בין שינויים הקשורים קשר הדוק (למשל, m6A ו m6Am) הוא נקודת ויכוח בתחום48,49. יתר על כן, RNAs מובנה מאוד עלול להפריע האינטראקציה נוגדן אנטיגן, הגבלה נוספת כי הוא התייחס בעיקר עם פיצול דנטורציה של RNA לפני IP. להיפך, רצף ביסולפיט המושפע גם על ידי מבנים משניים, אינו כולל שלב פיצול וזו עשויה להיותסיבהאחת שגורמת לפער בין אתרי m 5 C לבין mRNAs החזויים על ידי רצף ביסולפיט16 ו MeRIP-seq11,17. שינויים אחרים ציטוצין (למשל, hm5C) הם גם עמידים deamination בתיווך ביסולפיט35.
שינויים של MeRIP-seq כוללים שלב הצלבה, או עם כניסתה של ריבונוקלאוסייד פוטואקטיבי (צילום-crosslinking בסיוע m6A-seq, PA-m6A-seq 50)או באמצעות אור UV כדי ליצור נוגדן-RNA crosslinks לאחר ה-IP (miCLIP49, שיטה שונה מאשר miCLIP המתואר במבוא30, אלא גם עם רזולוציה אינדיבידואלית-נוקליאוטיד). בעתיד, וכיוון שהידע על מתילציה של RNA מצטבר, גישות ממוקדות יותר עשויות להיות עדיפות, בהתבסס על האנזימים המשנים ו/או רצפי הקונצנזוס שבהם מופיע מתילציה. זיהוי חלבוני הקורא חיוני להבנת הפונקציה המולקולרית והאותתנית של שינויים שלאחר שעתוק. טכנולוגיית ריצוף Nanopore כבר מאפשר זיהוי ישיר של נוקלאוטידים שונה ללא טיפול מוקדם של RNA17 אבל עדיין יש מקום לשיפור בתחום זה לגבי עומק רצף וניתוח ביואינפורמטי. בסך הכל, MeRIP-seq היא כיום גישה מבוססת, אמינה ובלתי משוחדת לזיהוי תעתיקי RNA מתילציה.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

בכל שלוש ממלכות החיים, מיני RNA עוברים שינויים פוסט-שעתוק ומחקר על שינויים ביוכימיים רלוונטיים מבחינה תפקודית אלה נקרא "אפיטרנקריפטומיקה". אפיטראנודומיקה היא תחום גדל ושיטות שונות מפותחות כדי ללמוד ולמפות את השינויים על מולקולות RNA (נבדק ב1,2). יותר ממאה שינויים RNA נמצאו, זוהו rRNAs, tRNAs, ncRNAs אחרים, כמו גם mRNAs3,4. למרות הנוכחות והתפקוד של שינויים פוסט שעתוק מגוונים מבחינה כימית tRNAs ו rRNAs נחקרים בהרחבה5,6,7,8, רק לאחרונה יש שינויים mRNA התאפיינו. בצמחים זוהו עד כה שינויים רבים ב- mRNA, כולל m7G במבנה הכובע9, m1A10,hm 5C11,12, ו uridylation13. עם זאת, רק m6A10,14,15, m5C11,16,17, ו פסאודורידין18 מופו תעתיק רחב ערבידופסיס. שינויים בבסיס mRNA לאחר שעתוק מעורבים במספר תהליכים התפתחותיים19,20.
אחת הגישות הנפוצות ביותר באפיטראנודומיקה היא האימונופרציפיטציה המתילציה של RNA בשילוב עם רצף עמוק (MeRIP-seq). MeRIP-seq פותחה בשנת 2012 כדי לחקור m6A בתאי יונקים21,22. זה דורש שימוש בנוגדן לשינוי הרצוי ומטרתו להעשיר עבור שברי RNA הנושאים את הנוקלאוטידים ששונו. זה בדרך כלל ואחריו רצף עמוק כדי לזהות ולמפות את שברים מועשרים או PCR כמותי כדי לאמת מטרות RNA ספציפיות. הדיוק של MeRIP מבוסס על הספציפיות של הנוגדן לזהות את הנוקלאוטידים ששונו על פני שינויים דומים (למשל, מ'5C ו hm5C11,23). מלבד m6A, MeRIP-seq הוחל גם ללמוד m1A ו m5C RNA מתילציה בכמה אורגניזמים11,17,23,24,25.
מתילציה של ציטוצין בתנוחת הפחמן החמישית (m5C) היא שינוי הדנ"א השכיח ביותר26,27 ואחד השינויים הנפוצים ביותר RNA מדי3,4. בעוד m5C זוהה ב mRNAs eukaryotic בשנת 197528, רק לאחרונה יש מחקרים התמקדו במיפוי תעתיק השינוי רחב, קידוד ולא קידוד RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
שיטות חלופיות המשמשות במחקר m5C RNA כוללות המרה כימית של ציטוסינים לא מתילציה לתוך uracils (רצף ביסולפיט) ו immunoprecipitation assays מבוסס על כריכה בלתי הפיכה של ציטוסין RNA ידוע מתילטרנספראז למטרות RNA שלה (miCLIP, aza-IP). בקצרה, רצף ביסולפיט מנצל את התכונה של ציטוצין 5-מתילציה להיות עמיד לטיפול דו-סולפיט נתרן כי deaminates ציטוסינים ללא שינוי כדי uracil. השיטה פותחה לראשונה עבור DNA אך הותאמה גם עבור RNA ומחקרים רבים בחרו בגישה זו כדי לזהות m5C אתרים RNA16,23,29,32,34,35. הן miCLIP והן aza-IP דורשים ידע קודם של RNA ציטוסין מתילטרנספראז ושימוש בנוגדן בהתאמה. במקרה של miCLIP (מתילציה אישית-נוקלאוטידים ברזולוציה הצלבה ו immunoprecipitation), מתיל טרנספראז נושאת מוטציה אחת חומצת אמינו, כך שהוא נקשר למצע RNA אבל לא ניתן לשחרר30. ב aza-IP (5-azacytidine-בתיווך RNA immunoprecipitation), הכריכה הבלתי הפיכה נוצרת בין נוקלאוזיד 5-azaC לבין RNA ציטוצין מתילטרנספראז כאשר מסופק אקסוגני 5-azaC משולב על ידי פולימראזים RNA לתוך מולקולת RNA היעד31.
היתרון העיקרי של שלוש שיטות אלה הוא שהם מאפשרים מיפוי רזולוציה נוקלאוטידים יחיד של m5C. בנוסף, miCLIP ו- aza-IP מספקים מידע על המטרות הספציפיות של RNA נבחר ציטוסין מתילטרנספראז, פענוח עמוק יותר את המנגנון והתפקיד של שינויים RNA שלאחר שעתוק. עם זאת, הגישה MeRIP-seq יכול לזהות תמלול רחב m5C אזורים ללא כל ידע קודם נדרש ומונע תנאים כימיים וטמפרטורה קשים, כגון טיפול ביסולפיט או דגירה עם 5-azaC. ניתן לעכב הן את מריפט והן את רצף הביסולפיט על ידי מבני RNA משניים36. שלב הפיצול הכלול במבחן MeRIP לפני immunoprecipitation נועד להקל על מחייב נוגדנים ולהגדיל את הרזולוציה של זיהוי m5C.
שיטה נוספת שראוי להזכיר היא ספקטרומטריית מסה (MS) של גרעיני RNA. טרשת נפוצה יכולה לזהות ולהבחין בכל סוג של שינוי הן בדנ"א והן ב- RNA. בקצרה, RNA מופק DNase מתעכל, אז התפלה מתעכל נוקלאוזידים בודדים. נוקלאוזידים RNA מנותחים על ידי ספקטרומטר מסה. שיטה זו יכולה לשמש לכימות הרמות של כל שינוי והיא אינה מסתמכת על נוגדן או המרה כימית. עם זאת, חיסרון גדול הוא שהוא מספק מידע בתפזורת על נוכחות של שינויים RNA. על מנת למפות את השינויים, טרשת נפוצה צריכה להיות משולבת עם עיכול RNase ומידע רצף על מולקולות RNA ספציפיות, כמו במקרה של tRNAלאואנושי(CAA)37.
כאן, אנו מתארים ומשוחחים על מבחני MeRIP כפי שרגילים ללמוד m5C RNA מתילציה ב Arabidopsis17.

<table><tbody><tr><td>נוגדן אנטי-m5C</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001 (הופסק), A3002 זמין</td><td>Clone 10G4 (הופסק), 7D21</td></tr><tr><td>זמין שבב וריאגנטים לאלקטרופורזה נימית</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 ערכת ננו</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO ערכת נטולת DNA</td></tr><tr><td>משקע משותף של חומצות גרעין</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>גליקובלו, 15 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>In vitro ערכת תמלול</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדול</td></tr><tr><td>צינורות תגובה מחייבים נמוכים</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td></tr><tr><td>חלבון G חרוזים מגנטיים</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads חלבון G</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20mg/mL תמיסת מלאי, דרגת</td></tr> <tr>RNA<td>מעכב RNase</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&mu; l</td></tr><tr><td>ערכת הסרת rRNA</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero ערכת הסרת rRNA (עלה צמח)</td></tr> <tr><td>צינורות סוניקציה</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>מיקרו-צינור AFA סיבים מראש חריץ Snap-Cap 6x16 מ"מ</td></tr><tr><td>מגיב מיצוי RNA</td><td>אמביון</td><td>15596018</td><td>TRIzol מגיב</td></tr> <tr><td>< חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת אלקטרופורזה נימית</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer System</td></tr><tr><td>מתלה מגנטי</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>הופסק</td><td>דגם 5417R</td></tr><tr><td></td><td>Rotator Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 ספקטרופוטומטר ממוקד אולטרה-סאונד</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>אמבט דגירה</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 אמבט דגירה</td></tr></tbody></table>

מתילציה rna אימונואוציאציה assay ללמוד m5c שינוי ערבידופסיס

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

שינויים משניים בבסיס על RNA, כגון m5C, משפיעים על המבנה והתפקוד של מולקולות ה- RNA ששונו. מתילציה RNA אימונואוציאציה רצף (MeRIP-seq) היא שיטה שמטרתה להעשיר עבור RNA מתילציה ובסופו של דבר לזהות תעתיקים שונה. בקצרה, RNA sonicated הוא דגירה עם נוגדן עבור 5-מתילציה ציטוזינות, זירז בסיוע חרוזי חלבון G. לאחר מכן, הקטעים המועשרים רצפים ואתרי המתילציה הפוטנציאליים ממופים על סמך התפלגות הקריאות וזיהוי השיא. MeRIP יכול להיות מיושם על כל אורגניזם, כפי שהוא אינו דורש כל רצף קודם או שינוי ידע אנזים. בנוסף, מלבד פיצול, RNA אינו נתון לכל טיפול כימי או טמפרטורה אחר. עם זאת, MeRIP-seq אינו מספק חיזוי חד-נוקלאוטידים של אתר המתילציה כפי שעושות שיטות אחרות, אם כי ניתן לצמצם את האזור המתילציה לכמה נוקלאוטידים. השימוש בנוגדנים ספציפיים לשינויים שונים מאפשר ל- MeRIP להיות מותאם לשינויי הבסיס השונים הקיימים ב- RNA, ולהרחיב את היישומים האפשריים של שיטה זו.

סכמטי של השיטה מסופק באיור 1. השלבים הקריטיים הראשונים של הפרוטוקול הם להשיג RNA באיכות טובה (RIN ≥ 7) ולהסתנן אותו כ 100 nt שברים. היעילות של שני השלבים נבחנת על ידי מכונת אלקטרופורזה נימי מבוסס שבב. באיור 2Aמוצגת הפעלה מייצגת של דגימת RNA טובה. המדגם מדולל 1:10 לפני טעינה על השבב על מנת לקבל ריכוז כי הוא בטווח של זיהוי של הערכה בשימוש (5-500 ng/μL). אותה דגימה מופעלת גם לאחר sonication ומוצגת באיור 2B. שים לב שנוכחותו של פסגה אחידה אחת עברה משמאל לדיאגרמה, בגודל של כ-100 נוקלאוטידים. הריכוז הנמוך נגרם הן על ידי אובדן RNA במהלך הפיצול, אלא גם בגלל נפח מוגבר של הדגימות (60-100 μL, שלב 1.7.1).
ניתן להעריך את איכות דגימות ה- IP וה- Mock על-ידי qRT-PCR. לשם כך, IVTs זינק לשמש פקדים חיוביים ושליליים: IVT מתילציה, שבו בכל תנוחות ציטוצין יש m5C, צפוי להיות מועשר מאוד במדגם ה-IP; להיפך, IVT שאינו מתילציה לא צריך להיות הבדל בין IP ו Mock. הפריימריז המשמשים ב- qRT-PCR לבדיקת שני ה- IVTs של הפקד(EGFP ורנילה לוציפראז) מפורטים בטבלה 1. ואכן, כפי שמוצג באיור 3, כ-80% מה-IVT המתילציה נמצאו במדגם ה-IP, ורק כ-2% ב-Mock. עבור פקד שאינו מתילציה, ההתאוששות הייתה מתחת 1% הן דגימות IP ו Mock. זה מאמת את היעילות של MeRIP כי שברי RNA מתילציה היו זירז מועשר, והוא אינדיקטור טוב כי הדגימות ניתן להשתמש לניתוח במורד הזרם. בנוסף, העשרת הקיפול של IVT שאינו מתילציה (יחס IP ל- Mock) ניתן להחיל כסף להערכת המשמעות של העשרה ב- qRT-PCR מבחנים.
לאחר יישור הקריאות לגנום (איור 4), אלגוריתמי הקריאה הגבוהים המתוארים בשלבים 3.4.1 ו- 3.4.2 מוחלים כדי לזהות את החלונות המשמעותיים סטטיסטית, המועשרים בדגימות ה- IP בהשוואה לקלט. ניתן להשתמש ברצפים התואמים לחלונות אלה עוד יותר, לדוגמה כדי לחפש מוטיבים שמורים הקשורים למתילציה11,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול MeRIP-seq. דגימות RNA הם דגירה עם נוגדן עבור 5-מתילציה ציטוזינות ואת המתחמים נמשכים למטה עם חלבון G חרוזים מגנטיים הלוכדים את הנוגדנים יחד עם RNA קשור. דגימות RNA eluted מנותחים על ידי רצף עמוק qRT-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> איור 2: תוצאות מייצגות מניתוח איכות של דגימות RNA. (A) פרופיל מייצג של מדגם מפעל RNA כולל מוסמך. (B) פרופיל מייצג של דגימת RNA לאחר sonication ל 100 nt שברים. קבצי פלט מתוכנת אלקטרופורזה נימי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> איור 3: ניתוח qRT-PCR של IVTs בקרה. תעתיקים מתילציה ולא מתילציה במבחנה שימשו כפקדים חיוביים ושליליים של מבחני MeRIP, בהתאמה. לאחר immunoprecipitation, IVT מתילציה מועשר מאוד מדגם IP (ירוק) אבל לא במדגם מדומה (ללא נוגדן אנטי מ'5C; סגול). IVT שאינו מתילציה לא הראה שום העשרה ואין הבדל בין IP ו Mock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> איור 4: קרא יישור לפני ואחרי MeRIP סביב תעתיק מייצג. קריאות מיושרות לתעתיק ספציפי בדוגמת הקלט (השורה העליונה) ובשני משכפלי IP (שורה אמצעית ותחתונה). הקופסה השחורה מציגה חלון ארוך מועשר מזוהה של 50 nt המבוסס על MACS243 וניתוחי שיחות שיא של MeRIP-seq22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>היעד</td>
			<td colspan="2">זוג פריימרים</td>
			<td colspan="2">רצף מוצרים</td>
			<td>אורך מוצר</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">EGFP (EGFP)</td>
			<td colspan="2">עבור: 5 '- GGCAACTACAAGACCCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGקאקטאקאקאגאגג'יג'יגה-ג'אג GTGAAGTTCGGGCGACCCTG GTGAACCGקטגקטגאגאגג'ק</td>
			<td rowspan="2">72 סיביות לשנייה</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCCCTTCTCCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">רנילה לוציפראז</td>
			<td colspan="2">עבור: 5'- GGAGAATAACTTCCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGאגאטקטקטקטג'יגטגאגא3 אטגטגקאקאקאאאאטקטגה אגטגאקאקאגאגאטגג'ק</td>
			<td rowspan="2">75 סיביות לשנייה</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rev: 5'- GCTGCAACTCTTCTCTCTCTAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מידע על פריימרים ומוצרים שנוצרו עבור ניתוח qRT-PCR.
חיץ מתכונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

משקעים חיסוניים של RNA מתילציה, הנקראת גם MeRIP, היא שיטה שנועדה לזהות קבוצות מתילציה בטרנסקריפטומים שלמים. ניתן להתאים אותו לתמציות RNA של אורגניזמים מודלים רבים. השיטה פשוטה, אינה דורשת טיפול כימי קשה, וניתן להשתמש בה למיפוי כל שינוי RNA כל עוד משתנה ספציפי.כדי לחלץ את דגימת ה-RNA, יש לטחון תחילה 200 מיליגרם מדגימת רקמת הצמח המעניינת לאבקה בחנקן נוזלי, תוך הקפדה על כך שהרקמה תישאר קפואה לאורך כל ההליך. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מגיב מיצוי RNA המכיל גואנידין תיוציאנט ופנול חומצה לרקמת הצמח הטחונה וערבב היטב על ידי היפוך, וודא שכל הרקמה רטובה. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את הדגימות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר.הוסף 200 מיקרוליטר של 1-ברומו-3-כלורופרופאן לסופרנטנט ומערבל במרץ את הדגימה. הפרד את השלבים על ידי צנטריפוגה והעביר כ -500 מיקרוליטר מהפאזה המימית העליונה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף לדגימה 500 מיקרוליטר איזופרופנול ו-50 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי וערבב היטב על ידי היפוך.דגרו את הדגימה למשך 10 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס לפני שתזרזו את ה-RNA על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת הסופרנטנט יש לשטוף את הגלולה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של 80% אתנול ופעם אחת עם 500 מיקרוליטר של 99% אתנול. לאחר הכביסה האחרונה, יבש את הגלולה במשך חמש עד 10 דקות לפני המסה ב-30 מיקרוליטר מים ללא RNase.מדוד את ריכוז ה-RNA בספקטרופוטומטר ועכל 20 מיקרוגרם של דגימת ה-RNA בתמיסת מים וחוצץ DNase. לאחר דגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, השתמש בנפח מתאים של מגיב אינאקטיבציה של DNase כדי להסיר את האנזים ולבדוק את האיכות והטוהר של ה-RNA המבודד על ידי אלקטרופורזה נימית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. אם מספר שלמות ה-RNA של דגימת ה-DNase המעוכלת גבוה משבע, הוסף לפחות 12 מיקרוגרם מכל דגימת RNA לצינור חדש.ספייק ב-0.1 ננוגרם מכל תעתיק שהוכן בעבר במבחנה, אחד מתילציה ואחד ללא מתילציה, לכל שלושה מיקרוגרם של דגימת RNA והביא את הנפח הסופי בכל צינור ל-80 מיקרוליטר עם מים ללא RNase. לאחר מכן סוניקציה של כל הנפח של כל דגימת RNA בצינורות סוניקציה בודדים ואשר את יעילות הסוניקציה ואת ריכוז דגימות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה נימית. הגודל הממוצע של ה-RNA המקוטע צריך להיות בסביבות 100 נוקלאוטידים.עבור משקעים חיסוניים של RNA שעבר מתילציה, הוסף תשעה מיקרוגרם מכל דגימת RNA סוניקציה ועד 60 מיקרוליטר מים נטולי RNase לצינורות קשירה נמוכים בודדים חדשים וחממו את ה-RNA ל-70 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 10 דקות. בתום הדגירה, יש לקרר את הדגימות למשך 10 דקות באמבט מי קרח ולהעביר 20 מיקרוליטר מכל דגימה לצינור קשירה נמוך חדש לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס כקלט. הוסף מים נטולי RNase ל-40 המיקרוליטרים הנותרים של כל דגימה לנפח סופי של 860 מיקרוליטר ופצל כל דגימה לצינור קשירה נמוך אחד למשקעים חיסוניים וצינור קשירה נמוך אחד כדגימה מדומה.הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר MeRIP 10X ו-10 מיקרוליטר של מעכב RNase לכל דגימה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של נוגדן נגד M5C לצינורות המשקעים החיסוניים ו-10 מיקרוליטר מים לצינורות המדומים. אטמו את הצינורות עם פרפילם ודגרו את הדגימות למשך 12 עד 14 שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עילי.למחרת בבוקר, הוסף 40 מיקרוליטר חרוזים לצינור אחד של 15 מיליליטר לדגימה. שטפו את החרוזים בשלוש שטיפות של חמש דקות עם 800 מיקרוליטר של מאגר MeRIP וסיבוב תקורה לכל דגימה לכל שטיפה, ואספו את החרוזים על מגנט לאחר כל שטיפה כדי לאפשר להשליך את המאגר. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את החרוזים ב-40 מיקרוליטר של מאגר MeRIP טרי לכל דגימה והוסיפו 40 מיקרוליטר של חרוזים תלויים למשקעים החיסוניים ולצינורות הדגימה המדומים לדגירה של שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב תקורה.בסוף הדגירה, הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת לפני שתשליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים. שטפו את החרוזים חמש פעמים ב-700 מיקרוליטר של מאגר MeRIP בתוספת 0.01%Tween-20 למשך 10 דקות לכל שטיפה בטמפרטורת החדר עם סיבוב תקורה. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את החרוזים ב -200 מיקרוליטר חיץ עיכול חלבון K ו -3.5 מיקרוליטר חלבון K למשך שלוש שעות דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם טלטול ב -800 סיבובים לדקה.בתום הדגירה, חלץ את ה-RNA עם 800 מיקרוליטר של מגיב מיצוי RNA ואת פרוטוקול מיצוי החומצה גואנידיניום תיוציאנט פנול כלורופורם כפי שהודגם. לאחר המיצוי, השעו מחדש את כדור ה-RNA המופק ב-20 מיקרוליטר בדיוק של מים נטולי RNase. באיור זה מוצגת ריצה מייצגת של דגימת RNA טובה.באותה דגימה לאחר סוניקציה, ניתן להבחין בנוכחות של שיא אחיד אחד שהוסט שמאלה בגודל של כ-100 נוקלאוטידים. הריכוז הנמוך יותר נגרם הן מאובדן RNA במהלך הפיצול והן מהנפח המוגבר של הדגימה. ניתן להעריך את איכות המשקעים החיסוניים והדגימות המדומות על ידי PCR כמותי של טרנסקריפטאז הפוך.בניתוח מייצג זה, כ-80% מתעתיק המתילציה במבחנה שוחזר בדגימת המשקעים החיסוניים בעוד שרק כ-2% שוחזרו בדגימה המדומה. עבור הביקורת ללא מתילציה, ההתאוששות הייתה מתחת ל-1% הן בדגימות החיסון והן בדגימות המדומה. לאחר ריצוף עמוק ויישור הקריאות לגנום, ניתן ליישם אלגוריתמים של שיחות שיא כדי לזהות את החלונות המשמעותיים סטטיסטית המועשרים בדגימות המשקעים החיסוניים בהשוואה לקלט.באמצעות נתוני הריצוף, אנו יכולים לזהות את המניע שבו מתרחשת מתילציה של RNA לרוב ומניע זה יכול לשמש כפיתיון למשיכת חלבוני קישור ספציפיים.

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים...

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

התפקיד של שינויים RNA בזיהומים ויראליים רק מתחיל להיחקר והוא יכול להדגיש מנגנוני אינטראקציה ויראלי מארח חדשים. בעבודה זו, אנו מספקים צינור לחקור m6A ו m5C RNA שינויים בהקשר של זיהומים ויראליים.

לחקור m6A ו- m5C Epitranscriptomes על זיהום ויראלי: דוגמה עם HIV

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

פרוטוקול זה מספק גישה מפורטת להערכת רמות שינוי m6A של RNA ספציפי באמצעות MeRIP-qPCR.

מבחן MeRIP-qPCR לזיהוי שינויים ברמות m6A של RNA ספציפי בתאי אוסטאוסרקומה

למד את שיטת MeRIP לאיתור שינויים מתילציה ב-RNA בצמחים. טכניקת אימונואוציאציה זו מאפשרת עשירת רנא מתילציה וזיהוי תעתיקים עם שינוי m5C באמצעות ריצוף עמוק.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m⁵C שינוי ערבידופסיס

גלה סרטונים נוספים