אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית
11 ביוני 2020
מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.
ה- ACE הוא אתר הדמיה אופטימלי. הוא תומך לחזור על זה בהדמיה ארוכת טווח של ויוו של תאי איון על מנת ללמוד את תפקודם ואת הכדאיות שלהם במצב השתלה. זה יכול גם להיות מורחב ללמוד היבטים אחרים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בזמן אמת.
היתרון של טכניקת ACE טמון בעובדה כי אותם איונים אנושיים בודדים הלבלב ניתן לעקוב באופן לא פולשני עם רזולוציה תת תאית לתקופה ממושכת של זמן. שיעורי ההצלחה של טיפול בתחליפי תאי בטא ממשיכים להשתפר. עם זאת, הערכת היעילות של השתלת איון והישרדות ב vivo, עדיין מאתגר.
שיטה זו יכולה לעזור להעריך ולמטב את התוצאות של השתלות איון. גישה זו אינה מוגבלת לאיים בלבלב בלבד. זה גם מתאים ללמוד רקמות מושפעות.
לדוגמה, בסיבוכים סוכרתיים, כמו גלומרולי כליות או חתיכות כבד, רק שם כמה. כדי להתחיל למקם את העכבר על כרית חימום חמה למקם אותו במחזיק הראש ולשים על מסכת האף. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי להרים מעט את הראש.
הדקו אותו עם החלקים המתכתיים בצדדים. מוודא כי חתיכות האוזן לתקן את הראש ישירות מתחת לאוזניים. תת עורית להזריק פתרון buprenorphine לתוך החלק האחורי של העכבר.
בעדינות לסגת העפעפיים של העין להיות מושתל באמצעות מדפים קהים. פופ את העין החוצה באופן רופף לתקן את זה עם זוג פינצטה מכוסה צינור פוליאתן. לאחר העברת העפעפיים לצלחת פטרי עם PBS, להרים כ 20 עד 30 איונים ב cannular העין.
באמצעות 25 מד המחט רמה כלפי מעלה, בזהירות להכניס את הקצה לתוך הקרנית ולעשות חתך אחד לאורך. בזהירות להרים את הקרנית עם cannula טעון מראש עם איונים, ולאט לאט לשחרר את איונים לתוך העין. לאט לסגת cannula ולהחיל ג'ל עיניים על העין.
לאחר 10 דקות, להסיר את המדפים, מחזיק את העפעף והחזר את העין למצבו הרגיל. להדמיה של איונים אנושיים מושתלים עם שני מיקרוסקופ פוטון, מניחים את פלטפורמת מחזיק הראש מתחת למיקרוסקופ ומנהלים ג'ל לעיניים על העין כנוזל טבילה בין הקרנית לעדשה. מקם את העין מתחת למטרה ודמיין את איי האדם המושתלים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
להסרת השפע האוטומטי, עבור אל הכרטיסיה עיבוד תמונה, בחר אריתמטיקה של ערוץ והקלד ערוץ אחד פחות ערוץ 2. פעולה זו יוצרת ערוץ חדש 4. שנה את שמו לסקולטורה.
חזור על תהליך זה והקלד ערוץ 3 מינוס ערוץ 2 כדי ליצור ערוץ חדש חמש ולשנות את שמו עגבניות כל. כדי להגדיר את האיום באופן ידני ליצור משטח חדש ולבחור לערוך באופן ידני באשף. שמרו על המצביע במצב בחירה ובתצוגת תלת-מימד.
ולחץ על עוצמה כדי להמחיש מקטעים. בכרטיסיה ציור בחר מיתאר ולחץ על צייר כדי להתחיל לצייר קווי מתאר סביב גבול איון, החל ממיקום פרוסה אחד. לאחר מכן עברו למיקום פרוסה חדש וחזרו על קווי המתאר של הציור.
סיים עם הפרוסה האחרונה בחלק העליון של איון וסוף על ידי לחיצה על הכרטיסיה ליצור משטח. הקטע הבא, כלי הדם של איון ונוהורסצנטיות עגבניות איון באמצעות מסכת איון. בחרו בעצם מסיכת איון שהוגדר קודם לכן, עברו ללשונית העריכה ולחצו על הכרטיסייה 'מסיכה סך הכל', שפותחת חלון חדש.
בחרו בערוץ כלי הדם בתפריט הנפתח לבחירת ערוצים והפעילו אפשרויות ערוץ כפול לפני החלת המסיכה. קבוע בפנים, בחוץ ולהגדיר voxels מחוץ לפני השטח כדי 0.000 אשר יוצר ערוץ חדש שש. שנה את שם כלי הדם של איון הערוץ הזה.
חזור על השלבים הקודמים ובחר את העגבניות הכל בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ, כדי ליצור את הערוץ החדש, לשנות את שמו, עגבניית איון. לאחר מכן צרו משטח חדש בתפריט הסצנה ובחרו יצירה אוטומטית באשף. הגדר את ערוץ המקור כלי הדם של איון שנוצר בעבר ובחר חיסור רקע.
באופן אופציונלי, השתמש במסננים. לדוגמה, בחר עוצמה וכוונן את המסנן בחלון, שיכול להסיר אובייקטי שירות נבחרים. סיים את האשף ותן שם לעצם פני השטח החדש, כלי הדם של איון.
באובייקט שירות כלי הדם של איון עבור אל כרטיסיית העריכה ולחץ על הכרטיסיה מסיכת הכל, הפותחת חלון חדש. בחרו בערוץ עגבניות איון בתפריט הנפתח לבחירת ערוצים והגדירו את הווקסלים מחוץ למשטח ל-10.000 שיוצר ערוץ חדש. שנה את שמו של כלי הדם עגבניות איון ערוץ זה.
כדי למקטע אות פלואורסצנטי של כמוסת עגבניות, בחרו אריתמטיקה של ערוץ בכרטיסיית עיבוד התמונה והקלדו ערוץ 7 מינוס ערוץ 8 היוצר את הערוץ החדש. שנה את שמה לכמוסת עגבניות. צור משטח חדש כפי שתואר בעבר ובחר ערוצי מקור, כלי דם עגבניות איון או כמוסה עגבניות באשף.
לאחר מכן בצע חיסור רקע. פתח את קובץ ה- backscatter של האיון וצור משטח חדש. באשף, בחר יצירה אוטומטית והגדר אזור עניין.
במידת הצורך, התאימו את הסף בעוצמה מוחלטת. ניתן ללחוץ או לכבות את עצם פני השטח, כדי להצליב בעוצמת הערוץ המתאימה. לאחר שתסיים, סגור את האשף.
לבסוף, בצע כימות, בחר אובייקט משטח שנוצר בתפריט הסצנה ועבור אל הכרטיסיה סטטיסטיקה. כדי לאחזר נתוני אמצעי אחסון מפורטים, בחר את הכרטיסיה המפורטת ובחר ערכים ואמצעי אחסון ספציפיים מהתפריט הנפתח. כדי לאחזר ערך אמצעי אחסון כולל עבור אל הכרטיסיה המפורטת ובחר ערכים ממוצעים.
פרוטוקול זה שימש להשתלת איונים אנושיים שאינם מסומנים בתא הפנימי של העין של עכברים נמען פלואורסצנטי אדום בן שמונה שבועות. תוכנת הדמיה אינטראקטיבית שימשה אז כדי לחלץ נתונים כמותיים מהתמונות. בהדמיית ויבו פלואורסנס, שתלי איון האדם נפגעו על ידי הפרעה משמעותית משפעת אוטומטית של רקמות שלא נצפתה בעכברים שתלי איון.
כדי לשפר את יחס האות לרעש, ערוץ השפע האוטומטי הוחסך. לאחר מכן הוגדר ידנית גבול איון הנקרא מסיכת איון והערוצים המתאימים. לבסוף, פילוח אות העגבניות לתוך כלי הדם העפעפיים ואת קפסולת העפעפיים ואת עיבוד פני השטח הסופי שימש כדי לחלץ נתונים כמותיים.
כאן כמפגש הדמיה אורך מייצג של אותו שתל איון אנושי בשבועיים, חודשיים, חמישה חודשים ושמונה חודשים לאחר ההשתלה. תמונות MIP של נתונים גולמיים שהוקלטו במקור, תמונות מעובדות לאחר הסרת שפעת אוטומטית של איון ואובייקטי איון מקופלים מוצגים. בעת ביצוע הזרקת העפעפיים, הקפד לטעון מראש את איונים בנפח קטן ולהשתמש בזרועות אור תאומות גמישות במיקרוסקופ הסטריאו שלך, כדי להדגיש את שטח תא העין על מנת להזריק בהצלחה את איונים לתוך ACE.
בעקבות ההדמיה in vivo ניתן לתקן את העיניים ולתחקר עוד יותר על כתמי נוגדנים והיסטולוגיה קונבנציונלית. טכניקה זו שימושית מאוד למחקרים תפקודיים של איונים אנושיים בודדים בזמן אמת ובתנאים פיזיולוגיים, במיוחד בהקשר של כלי דם, כדאיות ומחקרים מטבוליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר ניטור רציף של דינמיקת השתקעות איים מהלבלב אנושי ותפקידם של תאי המאכסן אל מול תאי התורם. על ידי השתלת איים אנושיים לתא anterior chamber of the eye (ACE) של עכברי NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sor tm4 - Rag2 -/-, חוקרים יכולים לבצע הדמיית 2-photon חוזרת כדי להעריך את תפקודי האיים ואת חיוניותם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של השתלה
- טכניקות דימות
רקע
- הלשכה הקדמית של העין (ACE) היא אתר אופטימלי עבור דימות.
- היא מאפשרת ניטור ארוך טווח של תאי איים in vivo.
- ניתן להרחיב שיטה זו לחקר מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים בזמן אמת.
- מעקב לא פולשני של איים לבלב אנושיים אפשרי ברזולוציה תת-תאית.
מטרת המחקר
- להערכת הדינמיקה של השתלת איים והישרדותם.
- לשיפור ההבנה של טיפול בהחלפת תאי בטא.
- להערכת יעילות השתלת איים in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של איים לבלב אנושיים לתוך ה-ACE של עכברים.
- דימות חוזר בשיטת 2-פוטון לצורך ניטור.
- הערכה של תפקוד האיים והחיוניות שלהם לאורך זמן.
- ניתוח של תרומת תאי המאכסן לעומת תאי התורם.
תוצאות עיקריות
- דימוג ארוך טווח מוצלח של תאי איים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של השתקת איים.
- הערכה של תפקוד וחיוניות איים במצב של השתקה.
- הבנה משופרת של האתגרים ביעילות השתקת איים.
מסקנות
- טכניקת ה-ACE מספקת כלי בעל ערך לחקר דינמיקת האיים.
- היא משפרת את הערכתן של תרופיות להחלפת תאי בטא.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו למגוון מחקרים פיזיולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי ארוכי-טווח in vivo של השתמי islets בלבלב אנושי בתא anterior chamber של העין מאפשר ניטור רציף ולא פולשני של הישרדות השסתם, וסקולריזציה ותרומה של תאי המארח ברזולוציה סוב-סלולרית. גישה זו נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי במחקר על השתלת islets על ידי אספקת נתונים כמותיים בזמן אמת על דינמיקת השסתם בתנאים פיזיולוגיים. השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית של טיפולי החלפת תאי beta על ידי הבהרת התפקידים של תאי התורם לעומת תאי המקבל במעטפת השסתם וברו-וסקולריזציה, ובכך מספקת ביטחון חיזוי בשלב הפיתוח הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר התרחבות השתלה של איים אנושיים ותרומת תאי המארח לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף פונקציונלי של יעדים במסלולים המעורבים בהישרדות השבת ולהיווצרות כלי דם (ווסקולריזציה).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון נפח איים (islet volume), צפיפות כלי דם ויצירת קפסולה, לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: תומך בתהליכי דימות הניתנים לשחזור ולהרחבה לצורך סריקה אורכית של ביצועי השתלה תחת תנאים משתנים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מציע פלטפורמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי קורלציה בין תוצרי דימות לבין חיוניות ותפקוד השתל.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף של מודלים פרה-קליניים משלב הגילוי ועד למחקרי השתרעות ארוכי טווח.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים, תמיכה במוכנות הבדיקה (assay readiness) בסריקה, ואספקת אנליטיקה כמותית לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בהתקדמות הפרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבירור נתיבים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות בין המארח להשתלה בזמן אמת.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של הבדיקה ופלט כמותי באמצעות סגמנטציה אוטומטית של מדורי האיים והכלי הדם.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח סטטיסטי של נתונים ארוכי טווח להשוואת תוצאות השתלה בתנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת מדדי דימיון לרצף פרה-קליני על ידי מעקב אחר וסקולריזציה וחיוניות כסמנים תרגומיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימיון ניתנת לשימוש חוזר, הישמה על סוגי רקמות מרובים מעבר לאיי לבלב, כולל מודלים של סיבוכים סוכרתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהישרדות השטבל והווסקולריזציה המתווכת על ידי המארח.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לרכישת תמונות ולכימות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת קריאות מוקדמות ואורכיות על תפקודיות השתבל, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של טיפולים מבוססי איים (islet-based therapies) בהתבסס על דינמיקת השתבצות מדידה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהשתלה מיקרו-כירורגית ובמיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל מחזיקי ראש, קנולות ותוכנה אינטראקטיבית לניתוח תמונות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לעיבוד תמונות עקבי, ובמיוחד לצורך חיסור אוטו-פלואורסצנציה וסגמנטציה של ערוצים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לרקמות אחרות או למצבים פתולוגיים.
- מוגבל בשל הצורך במודלים של מקבלים עם מערכת חיסונית מוחלשת כדי לאפשר השתרה של איים של בני אדם.
