הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לאיסוף דגימות, הכנת תמצית ומשקעים חיסוניים לאישור משיכת חלבון מוצלחת וזיהוי חלבונים מעניינים. ניתן לבצע את הכנת תמצית החלבון עבור עד 24 דגימות והיא תואמת למספר יישומים במורד הזרם, כולל משקעים חיסוניים וניסויי משיכת RNA. ניתן להתאים שיטה זו כדי להקל על בדיקת האינטראקציות בין שני חלבוני C.elegans אנדוגניים או יותר, מתויגים אנדוגנית או מתבטאים יתר על המידה במגוון רקעים גנטיים.

הדגמה חזותית של פרוטוקול זה נועדה לגרום לחוקרים להרגיש בנוח עם הכנת תמצית חלבון ומשקעים חיסוניים, בתקווה לעודד את החדשים בטכניקות להשתמש בהן במחקר שלהם. כדי לאסוף דגימת תולעת, זרע ראשון שלב מעורבב או תולעים מסונכרנות על צלחות מדיום גידול נמטודות מוצקות בטמפרטורה הנדרשת ולאפשר לתולעים לגדול עד לשלב הרצוי. בסוף הדגירה, השתמש במאגר M9 כדי לשטוף את התולעים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר ולגלול את התולעים על ידי צנטריפוגה.

בתום הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט ושטוף את התולעים שלוש עד חמש פעמים נוספות במאגר M9 טרי בכל שטיפה. כאשר הסופרנטנט כבר לא מעונן, בצע שטיפה אחרונה אחת עם מים מזוקקים כפולים והעביר את כדור התולעת הרופף לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. גלולה את התולעים עם צנטריפוגה נוספת והשליכו את הסופרנטנט שנותר לקבלת כדור תולעים ארוז.

להכנת תמצית מכדור התולעת שנאסף, הוסף נפח שווה של מאגר ליזה קר כקרח 2X לגלולה מומלצת בנפח 300 מיקרוליטר וערבב במרץ את התרחיף שהתקבל. סובב את הדגימה כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור ולהעביר את תכולת הצינור לצינור נטול RNAse בנפח 1.5 מיליליטר המכיל חרוזי מתכת. לאחר כיסוי הצינור בחוזקה, הניחו את הדגימה בהומוגנייזר של טחנת חרוזים בארבע מעלות צלזיוס תוך הקפדה על איזון הדגימה בתוך ההומוגנייזר.

הומוגניזציה של הדגימה במהירות הגבוהה ביותר למשך ארבע דקות לפני העברת הדגימה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר ללא חרוזים. סובב את הדגימה כדי להבהיר את תמצית החלבון ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר על קרח מבלי להעביר את המשקעים הלבנים העכורים בחלק העליון של הדגימה. הניחו בצד 10 מיקרוליטר של התמצית המובהרת כדי לקבוע את ריכוז החלבון הכולל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ודללו מיד את הדגימה לחמישה או 10 מיליגרם חלבון למיליליטר של מאגר ליזה קר כקרח 1X על קרח.

לצורך משקעים חיסוניים של החלבון המעניין, תחילה השעו מחדש את החרוזים המגנטיים על ידי היפוך והעבירו 150 מיקרוליטר של מתלה החרוזים 50X לצינור של 1.5 מיליליטר. ממגנט את החרוזים על קרח על מעמד מגנטי למשך כדקה. כאשר התמיסה ברורה, השליכו את הסופרנטנט.

הסר את הצינור מהמעמד המגנטי ושטוף את החרוזים בשלושה נפחים של 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה 1X. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את החרוזים ב-150 מיקרוליטר של מאגר ליזה קר כקרח והעבירו 75 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים לשני מיליגרם של דגימת תמצית החלבון. לאחר דגירה של שעה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה, הנח את צינור הדגימה במגנט על קרח למשך כדקה.

כאשר החרוזים ממוגנטים לחלוטין והדגימה צלולה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר מבלי להפריע לחרוזים. הקדישו 10% מהדגימה לניתוח כתמים מערביים והוסיפו 20 מיקרוגרם של נוגדן מטוהר זיקה לליזאט שנוקה מראש לדגירה של שעה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. בתום הדגירה מוסיפים את 75 המיקרוליטרים הנותרים של תרחיף חרוזים שטוף מראש לתערובת הליזאט של הנוגדנים לדגירה נוספת של שעה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.

בתום הדגירה, הנח את הדגימה בחזרה על המגנט למשך כדקה. כאשר החרוזים ממוגנטים לחלוטין והדגימה צלולה, שטפו את החרוזים המכילים את המשקעים החיסוניים שלוש פעמים ב-450 מיקרוליטר של מאגר כביסה על קרח. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את גלולת החרוזים ב-20 מיקרוליטר של מאגר טעינת ג'ל חלבון בטא-מרקפטואתנול 2X SDS והרתיחו את הדגימה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לזיהוי החלבונים המשקעים במערכת החיסון על ידי ניתוח כתמים מערביים, טען את דגימת החלבון המפורקת על ג'ל SDS-PAGE מבלי להעביר את החרוזים ובצע ניתוח כתמים מערביים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים תוך שימוש בנוגדנים המתאימים לחלבונים המעניינים, ולאחר מכן זהה את הרצועות באמצעות כימילומינסנציה מבוססת חזרת פרוקסידאז. פרוטוקול ההומוגנייזר המודגם של טחנת חרוזים ניתן להשוואה במיצוי חלבון כולל לשיטות מבוססות דונס למיצוי יעיל של חלבונים גרעיניים וציטופלזמיים. בניתוח זה, חלבוני ארגונאוט נקבעו כמקיימים אינטראקציה עם חברים במשפחת החלבונים GW182 היוצרים את קומפלקסי ההשתקה המושרים על ידי מיקרו-רנ"א הנקשרים ל-RNA שליח המטרה ומדכאים את ביטוים.

ניתן להשתמש בפרוטוקולי התמצית והמשקעים החיסוניים המוכחים גם כדי לשחזר בהצלחה משקעים קו-אימונו-משקעים ספציפיים ל-ALG-1 ו-HRPK-1. בנוסף, בדיקת האינטראקציה של ALG-1:AIN-1 במגוון רקעים גנטיים גילתה כי HRPK-1 אינו נחוץ עבור מכלול ההשתקה המושרה-על ידי ALG-1:AIN-1. חשוב לוודא שמיצוי החלבון והמשקעים החיסוניים מתבצעים בארבע מעלות צלזיוס או על קרח כדי לשמור על יציבות הדגימות.

תכשיר תמצית חלבון כולל זה תואם לניסויי משקעים חיסוניים של חלבונים ומשיכת מיקרו-רנ"א באמצעות אוליגונוקלאוטיד משלים של מיקרו-רנ"א ומקל על איסוף במורד הזרם של רכיבי חלבון ו-RNA כאחד.