Name: הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: למדו שיטה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת מתאי גזע iPS אנושיים לטיפול בדלקת שריר הלב. הטכניקה מאפשרת שחזור מבנה ותפקוד הלב בחיות מודל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית מחקר הלב לילדים של Kosair Charities באוניברסיטת לואיוויל ופרויקט אורגנואיד במרכז RIKEN לחקר דינמיקת מערכות ביולוגיות. HiPSCs בשימוש בפרוטוקולים שפורסמו שלנו סופקו על ידי המרכז למחקר ויישום תא iPS, אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן.

1. תחזוקה של hiPSCs ובידול לב וכלי דם
<ol><li>להרחיב ולתחזק hiPSCs על מטריצת קרום מרתף מעיל דק (גורם גדילה מופחת, 1:60 דילול) בינוני מותנה מופק פיברובלסטים עוברי העכבר (MEF-CM) עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי (hbFGF)4. הערה: השתמשנו בקו hiPSCs (4 גורם (אוק3/4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc) שורה: 201B6). הוסף hbFGF בריכוז המתאים עבור כל קו תא. שבר Laminin-511 יכול לשמש גם לציפוי של צלחת תרבות במקום מטריצת קרום מרתף. אמצעי זמין מסחרית המיועד לתרבות ללא הזנה של hiPSCs יכול לשמש כתחליף ל- MEF-CM.</li>
	<li>השתמש Versene (0.48 mM אתילנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) פתרון) כדי לנתק ולנתק תאים כאשר קונפלוננס התא מגיע 90\u2012100%. הערה: ניתן להשתמש גם במוצרים אחרים הזמינים מסחרית עבור דיסוציאציה של תאים.</li>
	<li>תאי לוח בצפיפות של 10,000 תאים /מ"מ 2 על לוחות תרבות תא מצופה מטריצה ב MEF-CM עם hbFGF ותרבות במשך יומיים עדשלושה ימים.</li>
	<li>כאשר התרבות הופכת לתלת-תפלה מלאה, כסה את התאים במטריצה (דילול של 1:60 עם MEF-CM) ליום אחד.</li>
	<li>החלף את MEF-CM ב- RPMI 1640 + B27 בינוני. להוסיף 100 ng/mL של Activin A ו 100 ng/mL של Wnt3A למדיום ליום אחד. הערה: זהו היום 0 של בידול. כדי לתזמן איתות WNT canonical, מעכבי GSK3β יכול לשמש גם במקום Wnt3A.</li>
	<li>ביום הראשון של בידול, לשנות את המדיום RPMI חדש 1640 + B27 עם 10 ng/mL של BMP4 ו 10 ng/mL של hbFGF. תאי תרבות עבור שני ימים (פרוטוקול MC) או ארבעה (פרוטוקול CM+EC) ללא שינוי בינוני5. הערה: פרוטוקול CM+EC ממוטב כדי לגרום בו-זמנית לתאי קרדיומיוציטים (CMs) ותאי אנדותל כלי דם (ECs). פרוטוקול MC ממוטב לתאי ציור קיר של כלי דם (MCs).</li>
	<li>פרוטוקול CM+EC עבור אינדוקציה של CMs ו- ECs (איור 1A).<ol>
<li>החלף את המדיום ביום 5 של בידול עם RPMI 1640 + B27 בתוספת 50 ng/mL של VEGF165.</li>
		<li>שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פרוטוקול MC עבור אינדוקציה של תאי קיר כלי דם (איור 1B)<ol>
<li>החלף את המדיום בסרום RPMI1640 + 10% סרום נקבי עוברי (FBS) ביום 3 של בידול.</li>
		<li>שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח קציר תאים ו קוצר יוחות ביום בידול 13\u201215
<ol><li>לשטוף את התאים עם Ca2+ ו Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם אגירה (PBS).</li>
	<li>הוסף פתרון דיסוציאציה של תאים (המכיל פרוטאזים, קולאזנס ו-DNAses) בצלחת תרבות התא כדי לכסות את הצלחת. דגירה את הצלחת במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף ולנתק את התאים עם מדיום תרבות באמצעות pipette לאחר הדגירה.</li>
	<li>הקצה 1 x 106 תאים לניתוח שושלת עם ציתום זרימה. כדי לחסל תאים מתים, להכתים את התאים עם צבע קיימא לתקן.</li>
	<li>להכתים את התאים עם סמני משטח קרום PBS עם 5% FBS. השתמש דילולים הבאים של נוגדנים פלואורסצנטית מופעל תא מיון (FACS) כתמים מאגר: אנטי PDGFRβ (1:100), קאדרין נגד VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).</li>
	<li>עבור חלבונים תאיים, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS.</li>
	<li>להכתים את התאים עם isoform אנטי לב של טרופונין T (cTnT) ב PBS עם 5% FBS ו 0.75% סאפונין, ואז לתייג את הנוגדן cTnT עם 488 עכבר IgG1 (דילול 1:50).</li>
	<li>לתוסף מחדש את התאים המוכתמים ב PBS עם 5% FBS ולשים אותם בצינורות FACS עם מסננת תא.</li>
	<li>נתח את הרכב התא של התאים המוכתמים מכל פרוטוקול בידול עם ציתום זרימה כדי להקל על יצירת מתלי תאים עם הפצות שושלת מוגדרות. הערה: בעת ביצוע הליך זה, מתלי התא הנותרים עבור ECTs נשמרים במקרר של 4°C.</li>
</ol>3. ייצור של תבנית רקמת PDMS
<ol><li>הטלת שכבה בעובי 0.5 מ"מ ושכבה של מעל 30 מ"מ x 30 מ"מ של פולידימטילסילוקסן (PDMS) על-ידי ערבוב פתרון טרום-פולימר וחיבור צולב ביחס של 10:1 ולאחר מכן ריפוי ב-80°C למשך 3 שעות.</li>
	<li>חותכים את גיליון ה-PDMS ומקשרים אותו עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני של 21 מ"מ x 20.5 מ"מ באורך 7 מ"מ, ברוחב 0.5 מ"מ ובצבים מלבניים בגובה 2.5 מ"מ בתנוחה מלבנית. מרווח אופקי בין שתי שורות של פוסטים הוא 2.5 מ"מ(איור 2B).</li>
	<li>אוטוקבל המגש ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>ציפוי המגש עם 1% poloxamer 407 ב PBS עבור 1 שעה. יש לשטוף את הפולוקסאמר 407 ולשטוף את התבנית ב-PBS מספיק לפני השימוש.</li>
</ol>4. בניית ECT
<ol><li>לאחר ניתוח תוחם התא, שלב את התאים מפרוטוקולי CM+EC ו- MC כך שהריכוז הסופי של MCs הוא 10 עד 20% במספר תא כולל של שישה מיליון תאים לכלמבנה 5.</li>
	<li>להשעות מעורב שישה מיליון תאים במדיום תרבות ECT (אלפא מינימום חיוני בינוני בתוספת עם 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol ו 100 U /mL פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
	<li>הכנת פתרון מטריקס<ol>
<li>לערבב 133 μL של חומצה מסיסה זנב חולדה זנב קולגן סוג אני פתרון (2 מ"ג / מ"ל, pH 3) עם 17 μL של 10x מינימום חיוני בינוני (MEM). לאחר מכן לערבב את הפתרון עם 17 μL של מאגר אלקלי (0.2 M NaHCO3, 0.2 M HEPES, ו 0.1 M NaOH). הערה: יש לשמור על קולגן על קרח (4°C). בדוק את צבע המאגר ואם המדיום אינו הופך ורדש כאשר כל הפתרונות מעורבבים, הוסף מאגר אלקלי נוסף למדיום. שלבי ערבוב חייבים להיות שילוב קולגן I + MEM 10x ולאחר מכן להוסיף מאגר אלקלי. אל תשנה הזמנה זו. אל תיצור בועות בתמהיל.</li>
		<li>הוסף 67 μL של מטריצת קרום מרתף לפתרון קולגן מנוטרל. הערה: יש לשמור את הפתרון המעורב על קרח (4 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה מתלי התא המוכן המכיל שישה מיליון תאים ב 1,100 סל"ד (240 x g)במשך 5 דקות ולתחל מחדש את התאים עם 167 μL של DMEM גלוקוז גבוה + 20% FBS + 1% פניצילין סטרפטומיצין (100x).</li>
	<li>ערבב את מתלי התא ואת פתרון המטריצה. הנפח הכולל של תערובת תא / מטריצה עבור מבנה אחד הוא 400 μL. הערה: תערובת התא/מטריקס צריכה להיות לא צמיגית וצבע ורדיד בשלב זה. שמור אותו על קרח כמו הג'ל יתגבש בטמפרטורת החדר. הריכוז הסופי של קולגן סוג אני הוא 0.67 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>יוצקים את תערובת התא / מטריקס באופן שווה על פולוקסאמר 407 מצופה PDMS רקמת עובש, אשר ממוקם בצלחת תרבות שש באר12. הערה: יוצקים את התערובת בזהירות כדי למנוע יצירת בועות כדי למנוע מילוי פגמים בג'ל שנשפך.</li>
	<li>דגירה את תערובת התא / מטריקס באינקובטור CO2 סטנדרטי (37C, 5 % CO2) במשך60 דקות.</li>
	<li>לאחר הרקמה נוצרת, להשרות את עובש הרקמה עם 4 מ"ל של ECT תרבות בינונית. הערה: למרות התא / מטריצה הוא crosslinked בתוך 60 דקות, המבנה הוא עדיין שביר מאוד. מוסיפים בעדינות מדיום כדי למנוע פגיעה בו.</li>
	<li>תרבות הרקמה במשך 14 ימים עם שינוי בינוני בכל יום.</li>
	<li>לפני השתלת ECT, הסר את ECT מעמדות הטעינה בעדינות באמצעות מפלצות עדינות מעוטרות. הערה: ממדי ECT הסופיים לאחר ההסרה מהתבנית הם פחות מהתבנית המקורית. תבנית 2.1 ס"מ על 2.05 ס"מ יוצרת ECT משוחרר של כ 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ. תבנית גדולה יותר באורך 3.9 ס"מ על 4.05 ס"מ יוצרת ECT של כ-3 ס"מ על 3 ס"מ. ECT לא פרוק מראה מכות ספונטניות פנימיות במדיום תרבות חמה. למרות שבתחילה הוא שומר על מבנה רשת שינוי, ECT לא פורק מתכווץ ומתעב לאורך זמן. ניתן להחזיק את הרקמה ברכות עם מלקות עדינות ולאחר מכן להשתמש בתפר משי 7-0 כדי לחבר את ECT לאפיקארדיום.</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
<li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+heart+failure%3A+cell-based+therapy+with+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vessel+Plus%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li>
<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים כלכליים או מדעיים לחשוף.

לאחר השלמת החקירה שלנו של פורמט ליניארי, hiPSC נגזר ECT5, התאמנו את הפרוטוקול כדי לערבב cMs נגזר hiPSC, ECs, ו- MCs כדי להקל על הרחבת מבחנה של תאי כלי דם בתוך ECTs ולאחר מכן צימוד כלי דם vivo בין ECTs ו שריר הלב הנמען.
כדי להקל על יצירת גיאומטריות ECT גדולות יותר, הניתנות להשתלה, השתמשנו בגיליונות PDMS דקים כדי לעצב את תבניות תלת-ממדיות עם עמדות טעינה מסודרות בעמדות מטלטלות. במהלך ניסויים ראשוניים, הערנו כי ECTs דבק הפוסטים PDMS במהלך דחיסת ג'ל ולכן שינינו את השיטה שלנו...

מחקרים פרה-קליניים רבים וניסויים קליניים אישרו את היעילות של טיפולים התחדשות לב מבוססי תאים עבורלבבות כושלים 1,,2,,3. בין סוגי תאים שונים, תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) מבטיחים מקורות תאים מכוח יכולת ההתפשטות שלהם, פוטנציאל לייצר תוחינות לב וכלידם שונים 4,,5, ו allogenicity. בנוסף, טכנולוגיות הנדסת רקמות אפשרו להעביר מיליוני תאים ללבפגום 5,6,,,7,,8.
בעבר, דיווחנו על הדור של רקמות לב ליניאריות (3D) ליניאריים מהונדסים (ECTs) מ-hiPSC נגזר תחבולות לב וכלי דם באמצעות מערכת תרבות מסחרית זמינה עבור רקמות ביו-ארטיפיאליות 3D5,7. מצאנו כי הדו-קיום של תאי אנדותל כלי דם ותאי ציור קיר עם קרדיומיוציטים בתוך ECT הקלה על התבגרות רקמות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות. יתר על כן, אימתנו את הפוטנציאל הטיפולי של hiPSC-ECTs מושתל במודל אוטם שריר הלב חולדה סובלני חיסונית כדי לשפר את תפקוד הלב, לחדש את שריר הלב, ולשפר אנגיוגנזה5. עם זאת, ECTs ליניארי שנבנה על ידי שיטה זו היו 1 מ"מ על 10 מ"מ צילינדרים ולכן לא מתאים להשתלה במחקרים פרה-קליניים עם בעלי חיים גדולים יותר או שימוש קליני.
בהתבסס על השימוש המוצלח של תבניות רקמות כדי ליצור היווצרות רקמות מהונדסות נקבוביות באמצעות myoblasts שלד חולדה ו cardiomyocytes9, אדם ESC נגזר cardiomyocytes10 ועכבר iPSCs11,פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור מדרגי hiPSC נגזר רקמות מושתלות גדולות יותר באמצעות תבניות polydimethylsiloxane (PDMS). הערכנו מגוון של גיאומטריות עובש כדי לקבוע את מאפייני עובש היעילים ביותר. ECTs בצורת רשת עם חבילות וצמתים מרובים הציגו מאפיינים מצוינים בכדאיות התא, פונקציית רקמות ומדרגיות בהשוואה לפורמטים פשוטים או ליניאריים שחסרים נקבוביות או צמתים. השתלנו את ECT בצורת רשת במודל אוטם שריר הלב חולדה ואימת את השפעותיו הטיפוליות דומה ECTs גלילימושתל 12. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול כדי ליצור ECT בצורת רשת שינוי נגזר hiPSC.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים בסגנון 100x20 מ"מ</td><td>פלקון / תומאס סיינטיפיק</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מרובות לתרבית תאים 6well 50 / CS</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>טכנולוגיות תאים חדשניות</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4, רקומביננטי (10 ומיקרו; ז)</td> <td>מו"פ D</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>קולגן, תמיסה מסוג I מזנב עכברוש</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr> גורם <tr><td>גדילה מופחת גורם גדילה Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF (165) IS, Miltenyi בדרגת פרימיום</td><td>130-109-385</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127, 0.2 ומיקרו; m מסוננים (10% תמיסה במים)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה ActivinA (50&מיקרו; ז)</td> <td>מו"פ D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a (10&micro; ז)</td> <td>מו"פ D</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Versene</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיום תרבית ותוספי מזון</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2 מרקפטרו אתנול</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 מינוס אינסולין</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A1895601</tr> DMEM, סרום בקר עוברי <tr><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td><td>עם גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>(500 מ"ל)</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (500 מ"ל)</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td></td> 25030081-NaHCO3 <td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (5000 יח'/מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>בינוני Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>Flowcytometry</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-TRA-1-60, FITC, שיבוט: TRA-1-60, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-טרופונין T, איזופורם לב Ab-1, שיבוט: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Clean תמיסה</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSנוזל נדן חלושה</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSתמיסת רינס</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שפופרת פלקון עם מכסה מסננת תאים (מארז של 500)</td>סרום <td>בקר עוברי קורנינג</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>(500 מ"ל)</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת כתמי תאים מתים Aqua Fixable LIVE/DEAD, לבדיקות מולקולריות עירור של 405 ננומטר</td><td></td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, שיבוט: 28D4, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, שיבוט: 55-7H1, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 ערכת תיוג</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי ips אנושיים לתיקון שריר הלב vivo

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ליצירת רקמות לב מהונדסות (ECTs) מדרגיות בצורת רשת המורכבות מתאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם, אשר מפותחים לקראת המטרה של שימוש קליני. קרדיומיוקיטים נגזר HiPSC, תאים אנדותל, ותאי ציור קיר כלי דם מעורבבים עם מטריצת ג'ל ולאחר מכן נשפכים לתוך עובש רקמה polydimethylsiloxane (PDMS) עם הודעות מלבניות פנימיות מטלטלות. ביום תרבות 14 ECTs להבשיל לתוך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת מבנה עם חבילות myofiber קוטר 0.5 מ"מ. קרדיומיוציטים ליישר את הציר הארוך של כל צרור ולנצח באופן ספונטני באופן סינכרוני. ניתן לשנות את קנה המידה של גישה זו עד ECT רשת גדולה יותר (3.0 ס"מ x 3.0 ס"מ) תוך שמירה על התבגרות ופונקציה של מבנה. לכן, ECTs בצורת רשת המופקת מתאי לב הנגזרים על-ידי hiPSC עשויים להיות אפשריים עבור פרדיגמות התחדשות הלב.

איור 1A,B מציג את השרטוטים של פרוטוקול CM+EC ו- MC. לאחר גורם CMs ו- ECs מפרוטוקול CM + EC ו- MCs פרוטוקול MC, התאים מעורבים התאמת ריכוזי MC הסופי לייצג 10 עד 20% של תאים הכולל. תבנית רקמה ברוחב 2 ס"מ מפוברקת על פי ציור העיצוב מגליון PDMS בעובי 0.5 מ"מ(איור 2א', ב). שישה מיליון תאי CM+EC+MC משולבים עם קולגן I, מטריצה ומוזגים על עובש הרקמה precoed עם poloxamer 407(איור 2C). במהלך ניסויים ראשוניים, מפ...

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה אצילית וקלה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המופקות מחלקי גוף הנגרמים על ידי בני אדם ותאי לב שמקורם בתאי STEM. הגמישות של הגיאומטריה של הרקמה ואת המדרגיות של תפקוד הרקמה השתמר הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו. ה- ECTs של צורת רשת מושתלת יכול לשחזר מבנה לב ולתפקד במודל אוטם שריר הלב של חולדה.אישור היתכנותו לשימוש בטיפול רגנרטיבי לב. טכניקות אלה דורשות עיבוד תאי STEM אנושיים לשחזור ואת כישורי תרבות הרקמה לקבלת תוצאות עקביות. התחל על ידי חיתוך גיליון PDMS נרפא לגודל המתאים כדי לאפשר את הגיליון להיות מלוכדות עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני 21 על ידי 20.5 מילימטר עם שבעה מילימטר ארוך 0.5 מילימטר רוחב ו 2.5 מילימטר גבוה עמדות מלבניות בתנופים מתנדנדים.המרווח האופקי בין שתי שורות עמודים צריך להיות 2.5 מילימטרים. סעו אוטומטית במגש ב-120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפני ציפוי התבנית ב-1%Poloxamer 407 ב-PBS למשך שעה. לאחר מכן שוטפים ביסודיות את התבנית עם PBS ומ מניחים את התבנית לתוך באר אחת של צלחת שש בארות.לניתוח שושלת היוחסין, שלבו את התאים מהקרדיומיוציט בתוספת פרוטוקולי תאי קיר אנדותל וסקולריים. כך שהריכוז הסופי של תאי קיר הוא 10 עד 20% במספר תאים כולל של שש פעמים 10 לש ששת התאים לכל מבנה. מערבבים 133 מיקרוליטרים של קולגן זנב עכברוש מסיס חומצה סוג אחד ו 17 microliters של מאגר אלקלי ל 17 microliters של 10X מינימום חיוני בינוני על קרח.לאחר מכן הוסיפו 67 מיקרוליטרים של מטריצת קרום המרתף לפתרון הקולגן. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים resuspend את גלולה ב 167 microliters של בינוני חיוני מינימלי של גלוקוז Dulbecco גבוה בתוספת סרום חזיר עוברי ואנטיביוטיקה. מערבבים את התאים על פתרון המטריצה על הקרח.ואז בזהירות לשפוך 400 microliters של ההשעיה מטריצת התא על פולוקסאמר 407 מצופה עובש רקמת PDMS. אין לארוב את תערובת מטריצת התאים באינקובטור סטנדרטי לתרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות. כאשר הרקמה נוצרה, בזהירות להשרות את התבנית עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות ECT ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 14 ימים.לפני השתלת ECT, אתה מעקר מטלאים עדין כדי להסיר בזהירות את ECT מן עמדות הטעינה. תבניות רקמות ניתן להמציא עם דפוסים שונים, אורכי פוסט ומרווח פוסט כדי ליצור גיאומטריות ECT סופיות שונות. לניתוח זה נעשה שימוש בתבנית עם עמדות באורך שבעה מילימטרים עם מרווחים ברוחב 2.5 מילימטר.Poloxamer 407 מונע הידבקות של התאים לתבנית ומאפשר היווצרות של מבנה רשת אופייני, לאחר דחיסת ג'ל מהירה בתוך 14 ימים. המבנה נשמר גם לאחר ECT הוא שוחרר מן התבנית. מבנה הרקמה המפוברק הוא ברוחב של כ-1.5 ס"מ ועוביו 0.5 מילימטרים.והרוחב של כל חבילה רש הוא כ 0.5 מילימטרים בממוצע. ניתן ליצור רשת שינוי ברוחב סופי של 3 ס"מ המכילה 24 מיליון תאים מתבנית גדולה פי ארבעה עם אותו עיצוב פוסט מתנדנד. זה ECT רשת גדולה יותר ניתן גם להסיר בקלות מן התבנית ומייצר פעולה מקומית של כוח שווה ערך ECT רשת קטנה יותר.חשוב לשפוך את תערובת מטריצת התא באופן שווה לתוך תבנית הרקמה מבלי ליצור בועות כדי למנוע תחושת פגמים בג'ל הסופי. אפיון תפקודי של הקבלן. ו ניתן לבצע קשרי תדר רביעי באמצעות מערכות מובנות.המטרה הסופית שלנו היא תרגום פרדיגמות ECT לטיפולים קליניים המשתמשים במחקרים פרה-קליניים גדולים בבעלי חיים.

preparation-mesh-shaped-engineered-cardiac-tissues-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטות להכנת ג'ל מטריצה ​​בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב...

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה אינדוקציה של שמאל cryoinjury חדרית ואחריו ההשתלה של תיקון שריר הלב, נגזר iPS-התא האנושי cardiomyocytes במודל של שפן.

השרשת נגזר hiPSC תיקונים שריר הלב לאחר פציעה שריר הלב במודל שפן

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

מוצגת כאן סדרה של פרוטוקולים ליצירה ושימור בהקפאה של ספרואידים לבביים (CSs) מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שמקורם בתאי גזע בתרבית בפורמט רב-ממדי בעל תפוקה גבוהה. מודל תלת מימדי זה מתפקד כפלטפורמה חזקה למידול מחלות, הקרנות בתפוקה גבוהה, ושומר על הפונקציונליות שלו לאחר שימור בהקפאה.

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למדו שיטה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת מתאי גזע iPS אנושיים לטיפול בדלקת שריר הלב. הטכניקה מאפשרת שחזור מבנה ותפקוד הלב בחיות מודל.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

גלה סרטונים נוספים