הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo
9 ביוני 2020
הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אצילית וקלה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המופקות מחלקי גוף הנגרמים על ידי בני אדם ותאי לב שמקורם בתאי STEM. הגמישות של הגיאומטריה של הרקמה ואת המדרגיות של תפקוד הרקמה השתמר הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו. ה- ECTs של צורת רשת מושתלת יכול לשחזר מבנה לב ולתפקד במודל אוטם שריר הלב של חולדה.
אישור היתכנותו לשימוש בטיפול רגנרטיבי לב. טכניקות אלה דורשות עיבוד תאי STEM אנושיים לשחזור ואת כישורי תרבות הרקמה לקבלת תוצאות עקביות. התחל על ידי חיתוך גיליון PDMS נרפא לגודל המתאים כדי לאפשר את הגיליון להיות מלוכדות עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני 21 על ידי 20.5 מילימטר עם שבעה מילימטר ארוך 0.5 מילימטר רוחב ו 2.5 מילימטר גבוה עמדות מלבניות בתנופים מתנדנדים.
המרווח האופקי בין שתי שורות עמודים צריך להיות 2.5 מילימטרים. סעו אוטומטית במגש ב-120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפני ציפוי התבנית ב-1%Poloxamer 407 ב-PBS למשך שעה. לאחר מכן שוטפים ביסודיות את התבנית עם PBS ומ מניחים את התבנית לתוך באר אחת של צלחת שש בארות.
לניתוח שושלת היוחסין, שלבו את התאים מהקרדיומיוציט בתוספת פרוטוקולי תאי קיר אנדותל וסקולריים. כך שהריכוז הסופי של תאי קיר הוא 10 עד 20% במספר תאים כולל של שש פעמים 10 לש ששת התאים לכל מבנה. מערבבים 133 מיקרוליטרים של קולגן זנב עכברוש מסיס חומצה סוג אחד ו 17 microliters של מאגר אלקלי ל 17 microliters של 10X מינימום חיוני בינוני על קרח.
לאחר מכן הוסיפו 67 מיקרוליטרים של מטריצת קרום המרתף לפתרון הקולגן. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים resuspend את גלולה ב 167 microliters של בינוני חיוני מינימלי של גלוקוז Dulbecco גבוה בתוספת סרום חזיר עוברי ואנטיביוטיקה. מערבבים את התאים על פתרון המטריצה על הקרח.
ואז בזהירות לשפוך 400 microliters של ההשעיה מטריצת התא על פולוקסאמר 407 מצופה עובש רקמת PDMS. אין לארוב את תערובת מטריצת התאים באינקובטור סטנדרטי לתרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות. כאשר הרקמה נוצרה, בזהירות להשרות את התבנית עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות ECT ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 14 ימים.
לפני השתלת ECT, אתה מעקר מטלאים עדין כדי להסיר בזהירות את ECT מן עמדות הטעינה. תבניות רקמות ניתן להמציא עם דפוסים שונים, אורכי פוסט ומרווח פוסט כדי ליצור גיאומטריות ECT סופיות שונות. לניתוח זה נעשה שימוש בתבנית עם עמדות באורך שבעה מילימטרים עם מרווחים ברוחב 2.5 מילימטר.
Poloxamer 407 מונע הידבקות של התאים לתבנית ומאפשר היווצרות של מבנה רשת אופייני, לאחר דחיסת ג'ל מהירה בתוך 14 ימים. המבנה נשמר גם לאחר ECT הוא שוחרר מן התבנית. מבנה הרקמה המפוברק הוא ברוחב של כ-1.5 ס"מ ועוביו 0.5 מילימטרים.
והרוחב של כל חבילה רש הוא כ 0.5 מילימטרים בממוצע. ניתן ליצור רשת שינוי ברוחב סופי של 3 ס"מ המכילה 24 מיליון תאים מתבנית גדולה פי ארבעה עם אותו עיצוב פוסט מתנדנד. זה ECT רשת גדולה יותר ניתן גם להסיר בקלות מן התבנית ומייצר פעולה מקומית של כוח שווה ערך ECT רשת קטנה יותר.
חשוב לשפוך את תערובת מטריצת התא באופן שווה לתוך תבנית הרקמה מבלי ליצור בועות כדי למנוע תחושת פגמים בג'ל הסופי. אפיון תפקודי של הקבלן. ו ניתן לבצע קשרי תדר רביעי באמצעות מערכות מובנות.
המטרה הסופית שלנו היא תרגום פרדיגמות ECT לטיפולים קליניים המשתמשים במחקרים פרה-קליניים גדולים בבעלי חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ופשוטה ליצירת רקמות לב הנדסית במבנה רשת, המופקות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של בני אדם. הטכניקה מאפשרת חקירה של טיפול בהשתלת תאים למחלות לב, במיוחד במודל של אוטם שריר הלב בחולדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הנדסת רקמות לב
- טיפול בתאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- רקמות לביות מהונדסות יכולות לשקם את מבנה ותפקוד הלב.
- תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים מהווים משאב בעל ערך להפקת תאי לב.
- הגמישות של גיאומטריית הרקמה היא קריטית להשתלה יעילה.
- שחזוריות בעיבוד תאי גזע חיונית להשגת תוצאות עקביות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת.
- הערכת ההיתכנות של רקמות אלו לטיפול רגנרטיבי בלב.
- בחינת השחזור של תפקוד הלב לאחר ההשתלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור מגש מלבני באמצעות PDMS ודבק סיליקון.
- יצירת עמודי תמיכה לרקמות המהונדסות.
- השתלה של רקמות לב מהונדסות במודל של חולדה.
- הערכה של שחזור המבנה והתפקוד של הלב.
תוצאות עיקריות
- רקמות לביות מהונדסות במבנה רשת שיקמו בהצלחה את תפקוד הלב.
- השיטה הדגימה יכולת התרחבות וגמישות בגיאומטריה של הרקמה.
- הושגו תוצאות עקביות באמצעות עיבוד הדירות של תאי גזע.
- הטכניקה ישימה לשימוש בטיפול רגנרטיבי של הלב.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה מהימנה ליצירת רקמות לביות מהונדסות.
- רקמות בצורת רשת יכולות לשקם ביעילות את תפקודי הלב במודל של אוטם שריר הלב.
- גישה זו מבטיחה פוטנציאל לטיפולים עתידיים לרגנרציה של הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-הרחבה של רקמות לב הנדסית בצורת רשת מתאי לבים קרדיווסקולריים המופקים מ-iPSC אנושיים, ובכך מציע פלטפורמה הניתנת לשחזור עבור אסטרטגיות לתיקון השריר הלבבי. הגישה תומכת בהערכה פרה-קלינית של שילוב רקמות ושחזור תפקודי במודלים של פגיעה איסכמית, ובכך נותנת מענה לפער קריטי בקרדיולוגיה רגנרטיבית. באמצעות אספקת מבנה הניתן לכיוון גיאומטרי ולהרחבה, הפרוטוקול מקל על הפחתת סיכונים טרנסלציונלית של טיפולים מבוססי תאי גזע לאי-ספיקת לב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הערכת האינטגרציה המבנית והתפקודית של תאי לב המופקים מ-hiPSC in vivo.
- ערך תפעולי: מספק פורמט רקמה סטנדרטי וניתן לשחזור לקבלת תוצאות פרה-קליניות עקביות בין מחקרים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדים מבניים כמותיים (למשל, יישור של צמעי סיבי שריר, התכווצות סינכרונית) לצורך פיתוח בדיקות תפקודיות.
- ערך תפעולי: תומך ביכולת הרחבה למבנים גדולים יותר (עד 3.0 cm), מה שמאפשר בדיקות של תגובה למספר (dose-response) ועקביות בין סדרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים את הישימות של שיקום המבנה והתפקוד של הלב במודל של אוטם שריר הלב בחולדה, ובכך תומך בהסרת סיכונים מנקודת מבט מכניסטית.
- ערך תפעולי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות של השתלה והערכה תפקודית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה ממצבת רקמות הנדסית-תאיות (ECTs) בעלות מבנה רשתי כגשר בין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ובכך מאפשרת בדיקת השערות בשלבי גילוי מוקדמים ותיקוף תפקודי בשלבים פרה-קליניים באמצעות ייצור רקמה הניתן להרחבה ולשחזור.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומכת בבירור מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אפשור הערכה מבוקרת של השילוב והתפקוד האלקטרומכני של תאי לב המופקים מ-hiPSC.
- סריקה (Screening): מספקת רקמות סטנדרטיות המוכנות לבדיקה עם פלטים מדידים (סנכרון פעימות, יישור) לצורך השוואת תרכובות או תנאים.
- אנליטיקה: מספקת נתוני קריאה מבניים ותפקודיים (ממדי המבנה, קוטר סיב השריר, סנכרון התכווצות) כדי לאפשר ניתוח השוואתי בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רציפות מהבשלה in vitro ועד לשיקום תפקודי in vivo, ובכך תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת טכנולוגיית פלטפורמה הניתנת להתאמה לגיאומטריות וקנה מידה שונים, ובכך מקדמת שחזור בין פרויקטים ויעילות במשאבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהשתרשות תאי גזע ותרומה תפקודית לתיקון הלב.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה (scalability) באמצעות יחסי תאים מוגדרים, פורמולציית מטריצה וגאומטריית תבנית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת נתוני יעילות פרה-קליניים הניתנים לשחזור, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים לרגנרציה לבבית בהתאם לסיכון, בהתבסס על ביצועי רקמה מאומתים ויכולת הרחבה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגזנה של iPSC אנושי, התמחות של שושלת קרדיווסקולרית וטכניקות של תרבית רקמה בתלת-ממד.
- תלוי בגישה לציוד יציקה של PDMS, יכולות סטריליזציה וטיפול מדויק בנוזלים עבור ערבוב של מטריקס-תאים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של מקור התאים, הכנת המטריקס ופרוטוקולי אינקובציה כדי להבטיח עקביות בין סדרות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הגדלה למבנים גדולים יותר או גאומטריות חלופיות, במיוחד בנוגע לדיפוזיה של חומרים מזינים וצימוד חשמלי.
- מוגבל בשל ההסתמכות הנוכחית על מודלים של מכרסמים לצורך תיקוף תפקודי, מה שמחייב מערכות פרה-קליניות גדולות יותר לצורך תרגום קליני.
