Name: מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: חקור פוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי פצוע באפיתל של זבובי הפירות Drosophila. שיטה זו מאפשרת למדוד גודל תאים, רמת פלואידיות וארגון רקמה לתיקון פצעים אפיתליים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

במכללת בוסטון, ברצוננו להודות לד"ר אריק פולקר על השימוש במצלמת המעבדה שלו ובמיקרוסקופ הסטריאוסקופ להדמיה וברטון ג'דסון במכללת בוסטון Core להדמיה עבור תשתית ותמיכה. ברצוננו גם להודות למשאבי הקהילה לטוס: בלומינגטון Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), וינה Drosophila מרכז משאבים, ו TRiP מרכז בבית הספר לרפואה של הרווארד (NIH / NIGMS R01-GM084947) למתן מניות טרנסגנית בשימוש במחקר זה. נוגדן FasIII העכבר הושגו מבנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים נתמך על ידי NICHD של NIH והתוחזק באוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר פרס R35GM124691. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryos+close+epithelial+wounds+using+a+combination+of+cellular+protrusions+and+an+actomyosin+purse+string%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).</li>
<li>Wood, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+recapitulates+morphogenesis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos.</a> Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biology. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+and+cell+fusion+contribute+to+wound+healing+in+the+adult+Drosophila+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium.</a> Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+Adhesions+Suppress+Syncytium+Formation+in+the+Drosophila+Larval+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis.</a> Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).</li>
<li>Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scar-like+lesion+is+apparent+in+basement+membrane+after+wound+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo.</a> Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).</li>
<li>Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cdc37+is+essential+for+JNK+pathway+activation+and+wound+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).</li>
<li>Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-Induced+Polyploidization%3A+Regulation+by+Hippo+and+JNK+Signaling+and+Conservation+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals.</a> PLoS One. 11 (3), e0151251(2016).</li>
<li>Tamori, Y., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+through+cell+competition+and+compensatory+cellular+hypertrophy+in+postmitotic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia.</a> Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-dependent+TOR-independent+endocycles+support+Drosophila+gut+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration.</a> Nature Communications. 8, 15125(2017).</li>
<li>Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fizzy-Related+dictates+A+cell+cycle+switch+during+organ+repair+and+tissue+growth+responses+in+the+Drosophila+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut.</a> Elife. 7, e38327(2018).</li>
<li>Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+Polyploid+Mystery+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease.</a> Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+Creates+an+Endoreplication+Wavefront+that+Leads+Regeneration+of+Epicardial+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue.</a> Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li>
<li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).</li>
<li>Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+polyploidization+is+driven+by+Myc+and+supports+tissue+repair+in+the+presence+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage.</a> Development. 146 (15), 173005(2019).</li>
<li>Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycling+cells+do+not+apoptose+in+response+to+DNA+rereplication+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress.</a> Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+mononuclear+diploid+cardiomyocytes+underlies+natural+variation+in+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration.</a> Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).</li>
<li>Gonzalez-Rosa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Polyploidization+Creates+a+Barrier+to+Heart+Regeneration+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish.</a> Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).</li>
<li>Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+nucleus%3A+nuclear+shape%2C+size+and+nuclear-envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).</li>
<li>Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Segregation+Fidelity+in+Epithelia+Requires+Tissue+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture.</a> Cell. 175 (1), 200-211 (2018).</li>
<li>Box, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycles+support+tissue+growth+and+regeneration+of+the+adult+Drosophila+accessory+gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland.</a> bioRxiv. , 719013(2019).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3111(2011).</li>
<li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Border+Cell+Migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li>
</ol>

מוצג פרוטוקול מפורט על איך לנתח ולהשתמש באפיתל הבטן D. מלנוגסטר למבוגרים כדי ללמוד כיצד גנים לווסת WIP על ידי שינוי אפיתל מחדש אנדורליזציהבמהלך תיקון הפצע 16. באמצעות שיטה זו, Myc proto-oncogene זוהה לאחרונה כרגולטור מפתח של WIP. Myc נדרש עבור תאי אפיתל אנדורפליפט לאחר פציעה והוא מספיק עבור תאי אפיתל שלווה כדי endocycle הן אפיתל לטוס למבוגרים ובלוטותאביזר 16,,22. נמצא גם כי החלפת תאי אפיתל למחזור תא מיטוטי על ידי ביטוי של stg, fzrRNAi מזיק לתיקון הפצע. מחקרים מתמשכים באמצעות שיטה זו יזהו גנים אחרים הנדרשים לווסת אפיתל מחדש אנדורכיכה במהלך WIP, חושף גם קווי דמיון והבדלים כיצד polyploidy מוסדר ופונקציות במגוון רחב של רקמות.
מודל ושיטה אלה מציעים יתרונות ייחודיים, כולל אינדוקציה קלה של polyploidy עם נקב מכני והעובדה כי תאים polyploid נוצרים בתוך ימים4. פרוטוקולי ניתוח הרקמות וההכנה מבוססים על טכניקות ניתוח זחל23, אך הבטן של הזבוב הבוגר נוקשה יותר ולכן קל לפגוע בה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה דורש תרגול ודיוק כדי לבודד רקמה שלמה כדי ללמוד WIP. עם זאת, לאחר הניתוח, האפיתל נראה בבירור ותמונה בקלות, ומניב תמונה של תהליך ריפוי הפצע. שיטה זו מספקת שפע של מידע על הארגון האפיתל של הזבוב הבוגר, גודל התא והסינכרון, ועל התחבולה של תאים וגרעין בודד. בעוד הדמיה חיה עדיין לא אפשרי בתוך זבוב פירות שלם בשל התוצר האטום שלה, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכלול כיום תנאי תרבות vivo לשעבר זמין בשימוש D. מלנוגסטר לבצע מחקרי הדמיה חיים לטווח קצר24.
בעתיד, מודל זה יהיה אידיאלי ללמוד crosstalk מתא לתא ואת התרומה של סוגי תאים אחרים כדי WIP על ידי ויסות ביטוי גנים עם מערכת Gal4/UAS בסוגים אחרים של עניין. שאלות דומות ניתן לענות גם באמצעות מגוון רחב של רקעים גנטיים ומוטנטים. הבטן לטוס למבוגרים לנתח מכיל מגוון רחב של סוגי תאים שניתן לדמיין בקלות באמצעות שיטה זו, כולל גוף שומן oenocytes, סיבי שריר לחוץ, נוירונים חושיים, קנה נשימה, ו המוציטים כמו מקרופאג.. בנוסף, מודל זה יאפשר לחוקרים לחקור כיצד משתנים פיזיולוגיים משפיעים על WIP, כולל מין, דיאטה, זיהום, גיל, ולחצים סביבתיים. בעוד הפרוטוקול משתמש בזבוב הנקבה הבוגרת בשל גודלו הגדול יותר, WIP מתרחש גם בזבוב הפירות הגברי (Gjelsvik ו Losick, שלא פורסם). תאים Polyploid נמצאו להתעורר במהלך הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל בכבד היונקים, המוח, העין, ולב12. מודל זבוב הפירות יאפשר לחוקרים לחקור פוליפלואידציה בהקשרים פיזיולוגיים ומחלות, משום שגנים הקשורים למחלות אנושיות הם מאוד שמורים.

מנוגסטר Drosophila היא מערכת מודל אטרקטיבית ללמוד את המנגנונים הסלולריים והמולקולריים של תיקון פצע אפיתל. כמו ביונקים, מנגנוני תיקון הרקמות המשמשים תלויים הן ברקמה והן בשלב ההתפתחותי שלה. ריפוי פצע ללא צלקות מתרחש בעובר זבוב הפירות שבו אקטומיויסין "מחרוזת הארנק" צורות בקצה המוביל אפיתל המאפשר את הפצע לסגורבצורה חלקה 1,,2. ריפוי פצע לאחר העובר בזחלים, גלימות, וזבובי פירות למבוגרים תוצאות שיפוץ מטריצה extracellular, היווצרות צלקת מלנין, וצמיחת תאים אפיתל3,,4,,5,6. תאי האפיתל להגדיל את גודל על ידי היתוך התא ואת endocycle, מחזור תא לא שלם העוקףמיטוזה 3,,4,,7,8. כתוצאה מכך, אובדן תאים מפוצה על ידי צמיחת תאים polyploid במקום חלוקת תאים. המבוגר לטוס hindgut, midgut, ו אפיתל זקיקים גם להסתמך על צמיחת תאים פוליפלואידים כדי לפצות על אובדן תאים לאחר נזקלרקמות 9,10,11.
Polyploidy הוא היבט ידוע של התפתחות אורגנית בצמחים וחרקים, אבל בשנים האחרונות זה הפך להיות יותר ברור כי polyploidy היא אסטרטגיה תיקון רקמות שוחמר בעלי חוליות12. דג הזברה, אשר יש את היכולת לחדש את לבו, מסתמך על צמיחת תאים polyploid לרפא epicardium פגום13. Polyploidy גם תורם התחדשות הכבד יונקים תיקון אפיתל צינור כליה לאחר פציעהחריפה 14,15. בדוגמאות אלה, תאים polyploid נוצרים על ידי אנדורפולציה באמצעות אנדוציקל או אנדומיטוזיס, וכתוצאה מכך תא binucleated עקב בלוק ציטוקינזיס12. האניגמה היא הסיבה לכך שתאי פוליפזואיד מתעוררים במהלך תיקון הפצע וכיצד polyploidy משפיע על תפקוד הרקמה. מחקרים אחרונים סיפקו תובנה חדשה לשאלה אם polyploidy מציע יתרון ריפוי או חיסרון. באפיקארדיום דגי זברה, polyploidy שיפר את המהירות של ריפוי הפצע13. ב D. מלנוגסטר hindgut וכבד יונקים, polyploidy נמצא המגן מפני צמיחה oncogenic11,14. באפיתל זבוב למבוגרים, לאחרונה נמצא כי polyploidy מאפשר תיקון הפצע בנוכחות מתח גנוטוקסי16. אנדורפולציה עמידה בפני נזק DNA, המאפשר ריפוי הפצע כאשר התפשטות תאים אחרת היה בסכנה17. עבור cardiomyocytes בלבבות עכבר וזברה, עם זאת, polyploidy מאט ריפוי, וכתוצאה מכךהיווצרות צלקת משופרת 18,19. לכן, בהתאם לאיבר ו/או סוג התא, polyploidy יכול להיות אסטרטגיה מועילה או מזיקה לתיקון רקמות. הנגישות של גנטיקה מלנוגסטר D. יחד עם ניתוח של תגובת פוליפלואידציה (WIP) הנגרמת על ידי פצע להפוך אותו למערכת מודל אידיאלית להדרת מנגנונים מולקולריים ותאיים המנחים אסטרטגיה זו ריפוי הפצע.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח WIP באפיתל D. מלנוגסטר למבוגרים. כלולים הוראות לפציעה זבוב פירות, ניתוח, חיסון, הרכבה, הדמיה, וניתוח של אפיתל מחדש, היתוך תאים, אנדורפול (ploidy). ניתן להתאים את ניתוח ההדמיה והתכסיס גם למודלים אחרים כדי לבדוק אם WIP מתרחש. יש ל ציין כי עם עלייה בתכני ה-DNA הגרעיני יש לעתים קרובות עלייה מקבילה בגודל גרעיני. עם זאת, ישנן דוגמאות רבות בביולוגיה שבהן גודל גרעיני אינו משקף שינוי מקביל בתכסיס20. עוד יותר זהירות יש לנקוט בעת פרשנות גודל גרעיני בהקשר של סביבת הפצע שבו תאים לעתים קרובות להתפשט או למתוח כדי לכסות את אתר הפצע. לכן, ההוכחה המוחלטת היחידה לשינוי בתחבולה היא למדוד תוכן DNA בשיטה זו (או אחרים, כגון רצף גנום שלם)21. שיטה זו מגבירה את התאמתו של אפיתל הבטן D. מלנוגסטר למבוגרים כמודל ללמוד את התפקיד ואת הרגולציה של polyploidy בתיקון הפצע.

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי 35 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>ליצירת צלחות לניתוח בצינורות</td></tr><tr><td>צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>להכנת ריאגנטים לצביעה</td></tr><tr><td>ב-AxioImager M2 עם Apotome</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td>לדוגמאות הדמיה</td></tr><tr><td>Blowgun mini</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104M</td><td>להרדמה D. melanogaster זנים</td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין, 30%</td> <td>סיגמא</td><td>A7284-500ML</td><td>עבור immuostaining</td></tr><tr><td>פחמן דו חמצני</td><td>מיכל מפיצים שונים</td><td>N/A</td><td>להרדמה D. melanogaster זנים</td></tr><tr><td>Click-iT EdU 594 Kit</td><td>Thermofisher</td><td>C10339</td><td>לבדיקת EdU</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermofisher</td><td>3406</td><td>להרכבת</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td>לצביעת</td></tr><tr><td>צלחות חיתוך (השתמש בערכה אלסטית של Sylgard 184 Sil)</td><td>דבקי אלסוורת'</td><td>184SIL</td><td>ליצירת צלחות לניתוח. מערבבים אפוקסי לפי ההוראות, נותנים להתייבש למשך הלילה</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Thermofisher</td><td>A21206</td><td>לצביעת</td></tr><tr><td>חמור משני נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 568 מצומד</td><td>Thermofisher</td><td>A10042</td><td>לצינורות</td></tr><tr><td>ואביזרי דרוזופילה</td> משניים אימואוצביעה <td>Genesee Scientific</td><td>59-124C, 59-123, 59-140</td><td>להרדמה של זני D. melanogaster</td></tr><tr><td>Dumont #5 Leverps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>epi-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793, b27392</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>Excel</td><td>, Microsoft</td><td></td><td>לביצוע חישובים פלואידיים</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ (תוכנת ניתוח תמונה)</td><td>NIH</td><<td>a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td><td>לניתוח תמונה</td></tr><tr><td>מזון זבובים</td><td>Archon Scientific</td><td>N/A</td><td>סירופ תירס/מזון סויה</td></tr><tr><td>Flystuff Flypad Genesee</td><td>Scientific</td><td>59-114</td><td>להרדמה D. זני melanogaster</td></tr><tr><td>צלחת חיתוך זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-748B</td><td>לביצוע נתיחות</td></tr><tr><td>בשקופיות זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-518-104C</td><td>להרכבת</td></tr><tr><td>נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עזים, Alexa Fluor 488 מצומד</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>לצביעת</td></tr><tr><td>עיזים משני נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 568 מצומד</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>לצביעה משנית</td></tr> של <tr><td>מדיום החרקים של גרייס, ללא תוספת</td><td>Thermofisher</td><td>11595030</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>בסיכות חרקים</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>לפציעה והצמדת בטן זבוב שטוח</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-פאסיקלין III (דרוזופילה)</td><td>מחקרי התפתחות</td> נוגדנים ראשוניים בנק היברידומה <td>7G10</td><td>לצמתים חיסוניים של צמתי תא-תא</td></tr> אפיתל <tr><td>Mouting Media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>אמצעי הרכבה נגד דהייה למניעת הלבנת תמונות במהלך הדמיה</td></tr><tr><td>לק</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72180</td><td>לאיטום שקופיות</td></tr><tr><td>שייקר אורטיבל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-217-988</td><td>לצביעת</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח, PH 7.4</td><td>סיגמא</td><td>P3813-10PAK</td><td>לצביעה</td></tr><tr><td>של מחזיקי סיכות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91606-07</td><td>לפציעה</td></tr><tr><td>של ארנב נגד גרגירים נוגדן ראשוני</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לצביעה חיסונית של גרעיני אפיתל. ניתן למצוא פרוטוקול לייצור נוגדן (Ref. #4 ו-8)</td></tr> <tr><td>ארנב אנטי-RFP נוגדן ראשוני</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>לצביעה חיסונית mCD8-RFP אפיתל זבוב</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZ51</td><td>לניתוח והרכבה של רקמת זבוב</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>10789704001</td><td>לצביעה</td></tr><tr><td>UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN</td><td>VDRC (v) ומרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (b)</td><td>v108837, b6292</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>UAS-fzr RNAi, UAS-Stg</td><td>VDRC (v) ו-Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>v25550, b56562</td><td>Grendler et al. Development, 2019</td></tr><tr><td>UAS-Myc</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b9674</td><td>Grendler et al. Development, 2019</td></tr><tr><td>UAS-myc RNAi</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b36123</td><td>Grendler et al. פיתוח, 2019</td></tr><tr><td>Vannas אביב מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>לניתוח</td></tr></tbody></table>

מודל drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy היא תופעה תכופה שהשפעתה על בריאות אורגניזמית ומחלות עדיין לא מובנת היטב. תא מוגדר פוליפלואיד אם הוא מכיל יותר מעותק diploid של הכרומוזומים שלה, שהוא תוצאה של אנדורפול או היתוך תא. בתיקון רקמות, פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע (WIP) נמצאה כאסטרטגיית ריפוי שנסמרה מזבובי פירות ועד בעלי חוליות. WIP יש מספר יתרונות על התפשטות תאים, כולל התנגדות לצמיחה oncogenic ומתח genotoxic. האתגר היה לזהות מדוע תאים פוליפלואידים מתעוררים וכיצד תאים ייחודיים אלה מתפקדים. מסופק הוא פרוטוקול מפורט ללמוד WIP באפיתל זבוב פירות למבוגרים שבו תאים פוליפלואידים נוצרים בתוך 2 ימים לאחר פצע דקירה. ניצול של ערכת הכלים הגנטיים הנרחבת של D. melanogaster, הגנים הנדרשים ליזום ולווסת WIP, כולל Myc, החלו להיות מזוהים. מחקרים מתמשכים בשיטה זו יכולים לחשוף כיצד משתנים גנטיים ופיזיולוגיים אחרים כולל מין, דיאטה, וגיל לווסת ולהשפיע על תפקוד WIP.

פרוטוקול מפורט מסופק להשתמש D. מלנוגסטר כמודל ללמוד פוליפלואידים הנגרמת על ידי פצע (WIP). מודל זה ריפוי הפצע מספק יתרונות רבים על יונקים ומודלים אחרים לטוס של WIP. Polyploidy היה מושרה בקלות על ידי נקב מכני עם סיכת חרק ותאים polyploid נוצרו בתוך פרק זמן קצר (2-3 dpi) (איור 1A, 1B)4. האתגר העיקרי הוא ניתוח של רקמת בטן שלמה ללא כל פרורים לאפיתל. האפיתל D. מלנוגסטר הוא בקלות בטעות נתקל או שרוט עם כלי הניתוב החדים. לכן, יש לתרגל את השלבים של פרוטוקול זה לפני השימוש והניתוח.
ראשית, הפציעה הוגבלה לבטן הנשית הפתחית, המספקת אזור רקמה אטום גדול ושטוח האידיאלי להדמיה. פצעי הדקירה נגרמו באפיתל פלוריט, שנמצא משני צדי החזה האמצעי הגחוני וממוהר בין קטעי טרגט (T) T4-T5(איור 1A-C). מיקום הפצע הזה מספק אזור גלוי גדול שלא משובש על ידי הפירוק. שלבים מאתגרים כוללים את החיתוך והצמדת מספריים בבטן (איור 1D, 1E). צעד חיתוך האביב עבד בצורה הטובה ביותר כאשר הבטן נחתכו בנפח מופחת של הפתרון של גרייס (~ 30 μL) כדי להקטין את תנועת הרקמות. חתך מרוכז היטב לאורך קו האמצע הגב היה הכרחי כדי לספק שטח מספיק על מגני הגב בבטן כדי להצמיד לפתוח על לוח החיתוך(איור 1ג). הבטן חייבת להיות מוצמדת בעדינות בארבע הפינות ללא כוח מוגזם(איור 1E). דחיפת סיכה קשה מדי תעוות את רקמת הבטן ואפילו יכולה לדחוף את הרקמה לתוך צלחת הניתור. אם זה קורה, יש להשליך את הרקמה. לאחר שרקמות הבטן תוקנו, היא נשארה על לוחית הניתוח עד להשלמת כתמי חיסון והבטן הורכבה על כיסוי זכוכית להדמיה(איור 1F).
ריפוי הפצע דורש גיליון אפיתל רציף כדי ליצור, אשר תלוי אנדורפול והיתוך תא4,16. חלבון צומת הספט FasIII, המתייג צמתים של תאים, סיפק אינדיקציה לשאלה אם התרחשו במהלך ההכנה(איור 1גרם, 1H). יש להשליך בטן עם שריטות גדולות (שטח לא מוכתם) המחיטות את אזור הפצע ולא שימשו לניתוח נוסף(איור 1ח').
השלב הבא היה לנתח דגימות שלמות לכל פגמים ב-WIP. פרוטוקול זה כולל תבחינות ברורות לזיהוי היבטים שונים של תגובת WIP (איור 2). תיקון הפצע הושלם כאשר תא מרכזי, גדול ורב-שלושה כיסה את גלד הפצע(איור 3א'). כאן זוהה היתוך התא על ידי כתם עבור FasIII / Grh וכמת את מספר Grh+ גרעין אפיתל הקיף באזור FasIII המתואר4. ליקויים בסגירת פצע או אפיתל מחדש זוהו כאשר נצפו פערים של &gt;10 μm בגיליון האפיתל(איור 3ב',חץ אדום). זה היה המקרה, למשל, כאשר WIP היה מעוכב על ידי ההפעלה של מחזור מיטוטי באמצעות ביטוי של stg, fzrRNAi, כפי שדווח לאחרונה16. במצב גנטי זה, 52% מהפצעים לא הצליחו ליצור גיליון אפיתל רציף מעל גלד הפצע(איור 3B, 3C).
שיטה נוספת למדוד תיקון הפצע במודל זה הייתה על ידי הדמיית קרום האפיתל עם ביטוי epi-Gal4 של UAS-mCD8-ChRFP4 (איור 2, איור 3D). בפקד, 91% מפצעי האפיתל נסגרו לחלוטין על ידי 3 dpi, אבל עיכוב WIP על ידי חסימת אנדורפול (E2f1RNAi) והיתוך תאים(RacDN)בו זמנית, כפי שדווח בעבר, גרם 92% של פצעי אפיתל להישאר פתוח לחלוטין (איור 3D, 3E)8,,16. ההפעלה של מחזור תא מיטוטי על ידי ביטוי של STG, fzrRNAi גם הביא פגם סגירת פצע אפיתל. עם זאת, על ידי הדמיה קרום תא האפיתל, ניתן לקבוע את היקף פגם האפיתל מחדש. מוטנט WIP (E2f1RNAi, RacDN ) פצעי זבובהיו פתוחים יותר stg, fzrRNAi פצעים (איור 3D, מקווה מקווקו אדום)16. זה פצע ממברנה ריפוי איסוף סיפק מידע נוסף על היקף הפגם תיקון הפצע. כתוצאה מכך, ניתן לקבץ פגמים באפיתל מחדש כפתוחים לחלוטין, סגורים חלקית (כלומר, &gt;פערים של 10 μm), או לסגורלחלוטין (איור 3ד', 3E).
בנוסף היתוך תאים, תאים אפיתל לגדול בגודל על ידי אנדורפול, מחזור תא לא שלם המכפיל את תוכן ה-DNA הגרעיני. אנדורפול היה assayed הן על ידי פעילות מחזור התא ומדידות תחבולה DNA גרעיני ישיר(איור 2 ואיור 4). כאן, פעילות מחזור התא זוהתה על ידי התאגדות של אנלוגי thymidine, EdU (איור 4A, 4B). D. תאים אפיתל מלנוגסטר נמצאו להיכנס אנדוציק, מחזור תא לא שלם כי תנודות בין שלבי S ו- G ללא שלב Mמתערב 4,12. הדיאטה D. מלנוגסטר למבוגרים בתוספת EdU+ מזון לפני פציעה ואת הזבובים נשמרו על EdU+ דיאטה עד הניתור ב 2 dpi(איור 4א'). לאחר מכן זוהה ה- EdU באמצעות פרוטוקול Click-iT של היצרן. EdU זה סיסאי שימש כדי לקבוע איפה, מתי, וכמה גרעין הופעלו כדי להיכנס שלב S בתגובה לפצע. באמצעות מערכת Gal4 / כב"מים, לאחרונה נמצא כי ביטוי ספציפי אפיתל של myc יכול לחסום (mycRNAi) או להחמיר (Myc ביטוי יתר) את היכולת של תאי אפיתל להיכנס שלב S. כתוצאה מכך, זה כבר הראה כי Myc מספיק כדי לגרום אנדוריבטור בתאים postmitotic, גם ללאפציעה 16,22.
לאחר מכן, תכסיס אפיתל נקבע על ידי מדידה ישירה של תכולת דנ"א גרעינית. גרעין אפיתל זוהו על ידי כתמי חיסון עבור סמן ספציפי אפיתל, Grh(איור 4D). בתוכנה להדמיה פיג'י, גרעין אפיתל זוהה באופן שיטתי ולאחר מכן סף באמצעות כתם גרעיני Grh. לאחר מכן הופרדו הגרעינים וה-ROIs הושתה על תמונת ה- DAPI של ערימות(איור 4D, חץ ירוק). כל גרעין חופף נמחק באופן ידני לפני שהצפיפות המשולבת של הגרעין הנבחר נמדדה(איור 4D,חצים אדומים). שיטה זו, המאומת למחצה, מאפשרת לכמת את ההפצה והתחבולה של רוב הגרעין לאורך אפיתל הבטן הזבוביםהלא פצועים והתוקנו 8. כפי שדווח לאחרונה, גרעין האפיתל המקיף את הפצע היו מורכבים 44% גרעין פוליפלואיד עם תוכן DNA יותר מ 3C ב 3 dpi (איור 4E, 4F)16. כצפוי מתוצאות EdU, נוק-דאון של myc הוביל לבלוק משמעותי באנדורב, כמו רק 9% של גרעין האפיתל היו polyploid, בעוד דיכוי יתר של Myc הביא 100% גרעין אפיתל פוליפלואיד סביב אתר הפצע(איור 4F)16. גודל גרעיני אפיתל הושפע גם באופן ניכר על ידי ביטוי myc עם גרעין מופחת או מוגדל הנוכחי. עם זאת, אזור גרעיני אינו מדד מדויק של השפעות תכסיס ופיזיולוגיות, כי גורמים כגון מתיחת תאים יכולים גם להשפיע על גודל גרעיני מבלי להשפיע על תוכן DNAגרעיני 20.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig1.jpg"> איור 1: פרי בוגר זבובי בטן פציעה, ניתוח, והרכבת רקמות. (א)תרשים של ההתפתלות של פציעת הבטן הבוגרת. זבובים צריכים להיפגע משני צידי הבטן בtergite 4 (T4). (ב)זבוב פירות נקבה בוגרת 3 dpi עם גלד מלנין שנוצר מריפוי פצעים (קופסה לבנה). סרגל קנה מידה = 50 μm.(ג)בטן בוגרת נותח, נוף גב, עם tergites מסומן. הבטן היו פילה דרך קו האמצע של הצד הגב (קו מקווקו לבן). סרגל קנה מידה = 50 μm. (D)ניתח פילה בטן למבוגרים לפני הצמדה. סרגל קנה מידה = 50 μm.(ה)בטן בוגרת מוצמדת על צלחת לנתח. סיכה הונחה בכל אחת מארבע פינות הבטן בצד הגב. הרקמה נפתחה בעדינות אך לא מתוחה, כדי להימנע מקרע. (ו)בטן בוגרת הורכבה והונחה על כיסוי זכוכית כשחלק הפנימי של הבטן פונה כלפי מטה לכיוון כיסוי הכיסוי והציפורן הכוונים לכיוון מגלשת הזכוכית. (ז)כתם FasIII של אזור הפצע שלם ללא סטייה עיבוד וסנכרון מרכזי (קו צהוב מקווקו). סרגל קנה מידה = 50 μm. (H)תמונה של אזור פצע שרוט (*) עם אזור FasIII לא מוכתם שמשבש את הסינכרון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig2.jpg"> איור 2: זרימת עבודה של ניתוח WIP. תרשים הזרימה מתאר את שלושת ההתארים המתוארים במחקר זה וצעדים חופפים ונפרדים כדי לזהות מודד את תגובת WIP. EdU assay מודד פעילות מחזור התא (תיבות כחולות), תכסיס ואפיתל מחדש מזוהים על ידי חיסון Grh /FasIII (תיבות ירוקות), וביטוי של RFP ממברנה מאפשר מדידה של היקף סגירת פצע אפיתל (קופסאות ורודות). השלבים הנפוצים הם בקופסאות אפורות וגנוטיפים של זן מלנוגסטר D מפורטים לעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig3.jpg"> איור 3: שיטות לזיהוי אפיתל מחדש במהלך WIP. האפיתל מחדש היה מוטרד כאשר WIP היה מעוכב גנטית. תמונות אימונופלורסנט של שליטה ( A )ו stg, fzrRNAi (B) ב 3 dpi. גרעיני האפיתל וצמתים ספט היו מוכתמים ב-Grh (ירוק) וב-FasIII (מג'אנטה), בהתאמה. (א' וב') כתמי FasIII לבד הראו כי אפיתל מחדש היה לקוי (חץ אדום) ב STG, fzrRNAi אפיתל. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ג)כימות של פגמים אפיתלציה מחדש (%) ב- 3 dpi (אפור): פקד (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). קווי שגיאה מציינים שגיאה רגילה; משמעות סטטיסטית נמדדה באמצעות מבחן T של סטודנט, **P &lt; 0.01. אפיתל מחדש במהלך תיקון הפצע יכול להיות מזוהה גם על ידי ביטוי של RFP מקושר ממברנה באמצעות epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (ד)תמונות אימונופלורסנט של שליטה, E2F1RNAi, RacDN, ו stg, fzrRNAi ב 3 dpi. סרגל קנה מידה = 20 μm. גלד פצע (קו מתאר צהוב) ופתוח אזור פצע אפיתל (קווי מתאר אדומים). (ה)כימות סגירת הפצע ב- ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13) ו- stg, fzrRNAi (n = 13). עיבוד מגרנדלר ואח '16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig4.jpg"> איור 4: שיטות לזיהוי אנדורפול במהלך WIP. (A)ציר הזמן של EdU הודעה: דרוסופילה למבוגרים האכילו 75 μL של 5 mm שמרים-EdU כל יום 2 ימים לפני הפציעה והמשיך עד 2 dpi. (ב)תמונות אימונופלורסנט של תווית EdU בזני זבובים המבוטאים עם מערכת epi-Gal4 / כ"כים ב 2 dpi. גלד פצע (W). סרגל קנה מידה = 50 μm. (C) מספר ממוצע של גרעין אפיתל EdU + לזבוב ב 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi #1 (n = 10), ו Myc (n = 8). קווי שגיאה מציינים שגיאה רגילה; משמעות סטטיסטית נמדדה באמצעות מבחן T של סטודנט, *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01. (ד)סכמטי של איתור ומדידה של תכסיס גרעיני אפיתל. גרעיני אפיתל זוהו וסף על ידי הכתם נגד Grh בפיג'י. גרעיני אפיתל חופפים הופרדו (ראשי חץ ירוקים) או הוסרו (ראשי חץ אדומים) אם הם מכוסים על ידי גרעין לא פיתל. הצפיפות המשולבת והתור הגרעיני של תמונת הגרעין המוכתמת של DAPI נמדדו. (ה)גודל גרעיני אפיתל (Grh) שונה על ידי ביטוי myc ב 3 dpi. (ז)תחבולה גרעינית אפיתל (%) ב- 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6) ו- Myc (n = 3). עיבוד מגרנדלר ואח '16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

פוליפואידציה הנגרמת על-ידי פצע היא אסטרטגיה של תיקון רקמות שוחמרות שבה תאים גדלים בגודל במקום לחלק כדי לפצות על אובדן תאים. הנה פרוטוקול מפורט על איך להשתמש בזבוב הפירות כמודל למדוד תכסיסה ויסות גנטי שלה בתיקון פצעים אפיתל.

מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר פוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי פצע. תהליך תיקון רקמות לחסוך, שבו תאים לגדול במקום לחלק זבוב פירות למבוגרים. פצע דקירה פשוט יכול להתבצע כדי לגרום polyploidy באפיתל זבוב בתוך יומיים בלבד.גודל תא אפיתל, תכסיס וארגון, לאחר מכן ניתן להעריך בקלות. התחל על ידי איסוף שני בקבוקונים, המכיל 10 עד 15 זבובי פירות נקבה שנסגרו לאחרונה של זן העניין. והזדקנות הזבובים בבקבוקוני מזון טריים, עם כחמישה זבובים זכרים לבקבוקון ב-25 מעלות צלזיוס, עד גיל שלושה עד חמישה ימים.לפצעי בטן, בסוף הדגירה, השתמשו בסיכה אחת של נירוסטה באורך 0.1 מילימטר כדי להרכיב מספר מחזיקי סיכות, כאשר הקצה החד של כל סיכה צועד החוצה. הרדמה זבובי הפירות הנשיים המבוגרים על משטח זבוב פחמן דו חמצני תחת מיקרוסקופ סטריאו. ולהשתמש במברשת צבע כדי לסדר את הזבובים לתוך שורה.מרכיבים משקפי בטיחות, עם מחזיק סיכה ביד אחת ומדפים ביד השנייה, להשתמש במדפים כדי למקם את הזבובים עם הבטן הגחוני שלהם פונה כלפי מעלה. ואז לנקב את הנקבה הבוגרת זבובים בתוך האזור הימני הכחול האפיתל של היעד A4 משני צדי קו האמצע הגחוני מערבבים לילות ומחזירים את הזבובים הפצועים לבקבוקון המזון עד לנקודת הזמן הניסיונית הרצויה לאחר הפציעה. בנקודת הקצה הניסיונית, בדקו את נוכחות הפצע והצלקות בכל זבוב הרדמה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ומלאו באר אחת מתוך תשעה תבשילי זכוכית עם הפתרון של גרייס.באמצעות זוג מדפים, לתפוס זבוב נקבה פצועה על ידי הצד הגבי של בית החזה ולטביע את הזבוב באר של פתרון. עם היד השנייה, להשתמש בזוג שני של מלקחיים כדי לנקב ולהסיר את קוטיקל הגב מתחת למטרה A6, בחלק האחורי של זבוב הפירות. אם האיברים הפנימיים אינם מופצים, להחיל לחץ על הצד הגבי של הבטן כדי לסחוט את האיברים הנותרים.השתמש במדפים כדי לשבור את הבטן המלאה בצומת בית החזה מעל היעד A2 ולהעביר את הבטן ל הבאר המכילה כ 100 microliters של הפתרון של גרייס. כאשר כל הבטן נאספה, להפחית את נפח הפתרון של גרייס באוסף היטב ל 30 microliters. השתמש מדפים ביד אחת כדי להחזיק את הצד הגבי של הבטן למטה ולהשתמש ביד השנייה כדי להכניס את הלהב התחתון של מספריים האביב ונציה לתוך חלל הבטן של כל בטן לחתוך לאורך קו האמצע הגבי עד הבטן פתוחה לחלוטין.הוסיפו 30 מיקרוליטרים של הפתרון של גרייס לכל אזור הרכבה של צלחת ניתוח יבשה עם 4.1 מילימטר סיכות לכל אזור הרכבה בבטן והכנסו את הבטן הפילה לתוך טיפת הפתרון. כאשר כל הבטן כבר פילה והניח, להצמיד את הבטן על המנה על ארבע פינות הגב. טיפול כי הרקמות שוכבות שטוחות מבלי לקרוע או overstretching רקמת הבטן.לאחר מכן החלף את הפתרון של גרייס ב-30 מיקרוליטרים פתרון מתקן לכל אזור הרכבה. וממקם תווית קלטת בתחתית כל מנה כדי לסמן כל פקד וקבוצה ניסיונית. כדי להרכיב את דגימות רקמת הזבוב.לאחר הכתם, השתמש במטלפים כדי לפרוק את הבטן מהצלחת המ לנתח תחת מיקרוסקופ הסטריאו. ולהשתמש במטסים כדי להעביר כל דגימה על ידי האגף הגבי שלה לתוך כ 30 microliters של מדיום הרכבה על תלושי כיסוי זכוכית בודדים. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו מכוונים את רקמת הבטן כך שהחלק הפנימי פונה כלפי מטה לכיוון תלוש הכיסוי ולהשתמש במטחנים כדי למשוך את הבטן המכוונת לקצה כל טיפת מדיה.מקם כל החלקת כיסוי רכובה על מגלשת זכוכית המסומת. ולהשתמש ברקמת מעבדה כדי להסיר כל מדיום הרכבה עודף. לאחר מכן לאטום את הקצוות של להחליק את המכסה עם לק ציפורניים ברור ולאחסן את השקופיות בתיבת השקופית בארבע מעלות צלזיוס עד ההדמיה שלהם.חלבון צומת ספיט מהיר שלוש אשר תוויות צמתים תא, מספק אינדיקטור אם כל הפרעות עיבוד התרחשו במהלך ההכנה. בטן עם שריטות גדולות של שטח לא מוכתם המטורפים את אזור הפצע, חייבת להיות מושלכת ולא כלולה בניתוח. תיקון הפצע הושלם כאשר תא מרכזי רב-גרעיני גדול מכסה את גלד הפצע.פערים של יותר מ-10 מיקרומטרים על יריעת האפיתל נחשבים לפגמים בסגירת פצעים ובאפיתליזציה מחדש. בניתוח מייצג זה באמצעות זבובים עם הפעלת תאים מיתוטיים מעוכבים, 52% מהפצעים לא הצליחו ליצור יריעת אפיתל רציפה מעל גלד הפצע. מאמר זה לריפוי פצעי קרום מספק מידע נוסף על היקף הפגם בתיקון הפצע המאפשר לקבץ פגמים באפיתליזציה מחדש כפתוחים לחלוטין, סגורים חלקית או סגורים לחלוטין.לדוגמה, בניסוי זה העיכוב של הפוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי חסימה בו זמנית של שכפול אנדו והיתוך תאים, נגרם ב 92% מפצעי האפיתל להישאר פתוח לחלוטין. בעוד ההפעלה של מחזור התאים המיטוטיים הביאה לפגם בסגירת פצע אפיתל. בנוסף, פעילות מחזור התא זוהתה על ידי שילוב של EDU אנלוגי thymidine ו תכסיס אפיתל נקבע על ידי מדידה ישירה של תוכן ה-DNA הגרעיני.בעת ניתוח אפיתל הבטן, יש לדאוג לא לגעת ברקמה עם כל כלי ניתוח כמו זה יהיה לגרד את המדגם. לאחר ניתוח, התפשטות תאים, מוות תאי, גודל חתך אובדן תאים או הערכות תוכן DNA גרעיני ניתן לבצע כדי להבין טוב יותר את הפצע המושרה פוליפלואידיזציה. או תהליכים אחרים בתוך האפיתל.

a-drosophila-model-to-study-wound-induced-polyploidization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטון מדגים את השימוש בפוטו-המרה לחקר דינמיקה של תאים דלקתיים בגלמים של דרוזופילה. המוציטים ירוקים נמשכים לאפיתל הפגוע, ואחריו הגירה רחוקה. Photoconversion מעביר המוציטים מסוימים מירוק לאדום, ומקל על מעקב התנועה שלהם.

טכניקת הפוטו-המרה לחקר דינמיקה של תאים דלקתיים בגלמי חרקים

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

שיטה זו מאפשרת לדור של נמטודות Caenorhabditis tetraploid ו- triploid של כל זן דיפלואידי. זני polyploid שנוצר על ידי שיטה זו השתמשו ללמוד אינטראקציות כרומוזום ב- meiotic prophase, שיטה זו שימושית לבחינת שאלות בסיסיות חשובות תא, התפתחותית, אבולוציונית, וביולוגיה סרטן.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את ההכנה וההדמיה של רקמה קבועה של נוטום דרוזופילה פופאל. זה יכול לשמש עבור רקמה שלמה או פצועה, ואת הארכיטקטורה המקורית של הרקמה נשמרת. ההליכים לניתוח, תיקון וצביעה מתוארים כולם במאמר זה.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

חקור פוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי פצוע באפיתל של זבובי הפירות Drosophila. שיטה זו מאפשרת למדוד גודל תאים, רמת פלואידיות וארגון רקמה לתיקון פצעים אפיתליים ביולוגיים.

מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

גלה סרטונים נוספים