מודל Drosophila לחקר פוליפלואידים הנגרמים על ידי פצע

פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר פוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי פצע. תהליך תיקון רקמות לחסוך, שבו תאים לגדול במקום לחלק זבוב פירות למבוגרים. פצע דקירה פשוט יכול להתבצע כדי לגרום polyploidy באפיתל זבוב בתוך יומיים בלבד.

גודל תא אפיתל, תכסיס וארגון, לאחר מכן ניתן להעריך בקלות. התחל על ידי איסוף שני בקבוקונים, המכיל 10 עד 15 זבובי פירות נקבה שנסגרו לאחרונה של זן העניין. והזדקנות הזבובים בבקבוקוני מזון טריים, עם כחמישה זבובים זכרים לבקבוקון ב-25 מעלות צלזיוס, עד גיל שלושה עד חמישה ימים.

לפצעי בטן, בסוף הדגירה, השתמשו בסיכה אחת של נירוסטה באורך 0.1 מילימטר כדי להרכיב מספר מחזיקי סיכות, כאשר הקצה החד של כל סיכה צועד החוצה. הרדמה זבובי הפירות הנשיים המבוגרים על משטח זבוב פחמן דו חמצני תחת מיקרוסקופ סטריאו. ולהשתמש במברשת צבע כדי לסדר את הזבובים לתוך שורה.

מרכיבים משקפי בטיחות, עם מחזיק סיכה ביד אחת ומדפים ביד השנייה, להשתמש במדפים כדי למקם את הזבובים עם הבטן הגחוני שלהם פונה כלפי מעלה. ואז לנקב את הנקבה הבוגרת זבובים בתוך האזור הימני הכחול האפיתל של היעד A4 משני צדי קו האמצע הגחוני מערבבים לילות ומחזירים את הזבובים הפצועים לבקבוקון המזון עד לנקודת הזמן הניסיונית הרצויה לאחר הפציעה. בנקודת הקצה הניסיונית, בדקו את נוכחות הפצע והצלקות בכל זבוב הרדמה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ומלאו באר אחת מתוך תשעה תבשילי זכוכית עם הפתרון של גרייס.

באמצעות זוג מדפים, לתפוס זבוב נקבה פצועה על ידי הצד הגבי של בית החזה ולטביע את הזבוב באר של פתרון. עם היד השנייה, להשתמש בזוג שני של מלקחיים כדי לנקב ולהסיר את קוטיקל הגב מתחת למטרה A6, בחלק האחורי של זבוב הפירות. אם האיברים הפנימיים אינם מופצים, להחיל לחץ על הצד הגבי של הבטן כדי לסחוט את האיברים הנותרים.

השתמש במדפים כדי לשבור את הבטן המלאה בצומת בית החזה מעל היעד A2 ולהעביר את הבטן ל הבאר המכילה כ 100 microliters של הפתרון של גרייס. כאשר כל הבטן נאספה, להפחית את נפח הפתרון של גרייס באוסף היטב ל 30 microliters. השתמש מדפים ביד אחת כדי להחזיק את הצד הגבי של הבטן למטה ולהשתמש ביד השנייה כדי להכניס את הלהב התחתון של מספריים האביב ונציה לתוך חלל הבטן של כל בטן לחתוך לאורך קו האמצע הגבי עד הבטן פתוחה לחלוטין.

הוסיפו 30 מיקרוליטרים של הפתרון של גרייס לכל אזור הרכבה של צלחת ניתוח יבשה עם 4.1 מילימטר סיכות לכל אזור הרכבה בבטן והכנסו את הבטן הפילה לתוך טיפת הפתרון. כאשר כל הבטן כבר פילה והניח, להצמיד את הבטן על המנה על ארבע פינות הגב. טיפול כי הרקמות שוכבות שטוחות מבלי לקרוע או overstretching רקמת הבטן.

לאחר מכן החלף את הפתרון של גרייס ב-30 מיקרוליטרים פתרון מתקן לכל אזור הרכבה. וממקם תווית קלטת בתחתית כל מנה כדי לסמן כל פקד וקבוצה ניסיונית. כדי להרכיב את דגימות רקמת הזבוב.

לאחר הכתם, השתמש במטלפים כדי לפרוק את הבטן מהצלחת המ לנתח תחת מיקרוסקופ הסטריאו. ולהשתמש במטסים כדי להעביר כל דגימה על ידי האגף הגבי שלה לתוך כ 30 microliters של מדיום הרכבה על תלושי כיסוי זכוכית בודדים. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו מכוונים את רקמת הבטן כך שהחלק הפנימי פונה כלפי מטה לכיוון תלוש הכיסוי ולהשתמש במטחנים כדי למשוך את הבטן המכוונת לקצה כל טיפת מדיה.

מקם כל החלקת כיסוי רכובה על מגלשת זכוכית המסומת. ולהשתמש ברקמת מעבדה כדי להסיר כל מדיום הרכבה עודף. לאחר מכן לאטום את הקצוות של להחליק את המכסה עם לק ציפורניים ברור ולאחסן את השקופיות בתיבת השקופית בארבע מעלות צלזיוס עד ההדמיה שלהם.

חלבון צומת ספיט מהיר שלוש אשר תוויות צמתים תא, מספק אינדיקטור אם כל הפרעות עיבוד התרחשו במהלך ההכנה. בטן עם שריטות גדולות של שטח לא מוכתם המטורפים את אזור הפצע, חייבת להיות מושלכת ולא כלולה בניתוח. תיקון הפצע הושלם כאשר תא מרכזי רב-גרעיני גדול מכסה את גלד הפצע.

פערים של יותר מ-10 מיקרומטרים על יריעת האפיתל נחשבים לפגמים בסגירת פצעים ובאפיתליזציה מחדש. בניתוח מייצג זה באמצעות זבובים עם הפעלת תאים מיתוטיים מעוכבים, 52% מהפצעים לא הצליחו ליצור יריעת אפיתל רציפה מעל גלד הפצע. מאמר זה לריפוי פצעי קרום מספק מידע נוסף על היקף הפגם בתיקון הפצע המאפשר לקבץ פגמים באפיתליזציה מחדש כפתוחים לחלוטין, סגורים חלקית או סגורים לחלוטין.

לדוגמה, בניסוי זה העיכוב של הפוליפלואידיזציה הנגרמת על ידי חסימה בו זמנית של שכפול אנדו והיתוך תאים, נגרם ב 92% מפצעי האפיתל להישאר פתוח לחלוטין. בעוד ההפעלה של מחזור התאים המיטוטיים הביאה לפגם בסגירת פצע אפיתל. בנוסף, פעילות מחזור התא זוהתה על ידי שילוב של EDU אנלוגי thymidine ו תכסיס אפיתל נקבע על ידי מדידה ישירה של תוכן ה-DNA הגרעיני.

בעת ניתוח אפיתל הבטן, יש לדאוג לא לגעת ברקמה עם כל כלי ניתוח כמו זה יהיה לגרד את המדגם. לאחר ניתוח, התפשטות תאים, מוות תאי, גודל חתך אובדן תאים או הערכות תוכן DNA גרעיני ניתן לבצע כדי להבין טוב יותר את הפצע המושרה פוליפלואידיזציה. או תהליכים אחרים בתוך האפיתל.