באתר דגימה וחילוץ של גידולים במוח עבור מטבולומיקה וניתוח Lipidomics

כתב היד מציג באתר דגימה של גידולים במוח האנושי עם מיקרו-ארכה שלב מוצק ואחריו פרופיל ביוכימי שלהם לקראת גילוי סמנים ביולוגיים.

פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע חילוץ מגידולים במוח או ליד שרת באמצעות סיבי microextraction שלב מוצק. טכניקה זו מאפשרת מיצוי של מולקולות קטנות ישירות מגידולים מכופתרים ומספקת הזדמנות לאבחון תוך ניתוחי מהיר על ידי צימוד התקני מיצוי ישירות למכשור אנליטי. כדי להכין את התקן microextraction שלב מוצק, לקצץ את הקידוד של כל בדיקה מכשיר microextraction שלב מוצק עם מצב מעורב או ציפויים C18 לאורך המתאים בהתאם לגודל הגידול.

ולהשרות את הבדיקות ו 50 50 פתרון מים מתנול לפחות שעה אחת לפני איסוף המדגם. פרוטוקול זה מתמקד בגידולים במוח אך ניתן ליישם את האסטרטגיה לאבחון סוגי סרטן רבים ושונים. הטכנולוגיה ניידת לחלוטין, כך שאין צורך במכשירים נוספים.

בהקדם האפשרי לאחר הסרת הגידול לטבול את סיבי בדיקה עם מים כיתה LCMS במשך חמש שניות לפני החדרת הסיבים ככל האפשר לתוך מדגם רקמת הגידול במוח, כדי להבטיח כי שלב החילוץ כולו ממוקם בתוך הגידול. השאירו את הבדיקות בתוך הרקמה בדיוק 30 דקות כדי לחסל מקורות שגיאה בשל נוכחותם של חפצים ממקורות אחרים מאשר הגידול מדגם, למקם סיבי בדיקה מותנה על השולחן במשך אותה תקופה של זמן. במהלך החילוץ, תווית בקבוקונים HPLC לשמש לאחסון בדיקה לאחר החילוץ.

בסוף החילוץ, לטבול את הסיבים במים כיתה LCMS במשך שלוש שניות כדי להסיר את כל פסולת הדם או התא ולהכניס כל בדיקה דרך החלק התחתון של הספטה של כובע בקבוקון HPLC יחיד כדי לשתק את הסיבים. לאחר מכן מכסים את הבקבוקונים עם הסיבים משותקים ומ מניחים את הבקבוקונים לתוך מיכל תחבורה מתאים. עם הגעת המעבדה, מיד הניח את הבקבוקונים לתוך מינוס 30 או מינוס 80 מעלות צלזיוס מקפיא לא יותר משלוש או חמש שנים בהתאמה.

לאחר שנאספו כל הדגימות מניסוי אחד, מניחים את הבקבוקונים המכילים את סיבי המצב המעורב בטמפרטורת החדר. ולתייג שני בקבוקונים מיליליטר עבור desorption מקום זכוכית להוסיף לתוך כל בקבוקון ולהוסיף 300 microliters של 80 20 פתרון מים אצטוניטריל מוכן טרי לכל הכנס. שקוע לחלוטין את הקידוד של כל בדיקה בבקבוקונים בודדים של ממס desorption ולהסעיר את הבקבוקונים במשך 120 דקות ב 1, 200 מהפכות לדקה על מערבולת.

לאחר desorption הושלם, להסיר את הכובעים מן הבקבוקונים ולהניח בצד 10 aliquots microliter מכל קובץ המכיל תמצית מהגידול כדי להכין דגימת בקרת איכות. לאחר מכן לסגור את הבקבוקונים עם כובעים חדשים ולהמקם את הבקבוקונים לתוך ארבע מעלות צלזיוס מדגם אוטומטי של ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית. כדי להכין את הדגימות לניתוח ליפידומי למקם את הבקבוקונים המכילים את C 18 סיבים בטמפרטורת החדר תווית שני בקבוקונים HPLC מיליליטר עבור מקום ההפרעה זכוכית סילנית מכניס לתוך הבקבוקונים ולהוסיף 200 microliters של 50 50 פתרון מתנול isopropanol מוכן טרי לכל הכנס.

לטבול באופן מלא כל ציפוי בדיקה לתוך הממס להתסיס את הדגימות במשך 50 דקות ב 1, 200 מהפכות לדקה על מערבולת. בסוף הזמן, לעצור את desorption על ידי הסרת הכובעים ולאחר מכן להפריש 10 aliquots microliter מכל קובץ המכיל תמצית מהגידול כדי להכין את דגימת בקרת איכות ולסגור את הבקבוקונים עם כובעים חדשים. לאחר מכן, מניחים את הבקבוקונים לתוך ארבע מעלות צלזיוס מדגם אוטומטי של ספקטרומטר מסה כרומטוגרפיה נוזלי ברזולוציה גבוהה.

הרבייה של הניתוח האינסטרומנטלי נקבעה כטובה מאוד בהתבסס על הקיבוץ ההדוק של דגימות בקרת האיכות על חלקת ניתוח הרכיבים העיקרית. נתונים אלה lipidomics עבור דגימות שנאספו מחולים עם gliomas ו meningiomas להדגיש את היכולת של דגימות הגידול להיות מכובד על פי מוצא היסטולוגי שלהם ממאירות. כפי שמודגם עם נתונים מטבולומיים אלה, gliomas ניתן לחלק עוד יותר על סמך מידת הממאירות שלהם או על פי נוכחות או היעדר מוטציות של עניין.

ניתוח סטטיסטי מאפשר גם בחירת תרכובות ספציפיות בתוך הקבוצות הנחקרות. זה חיוני כדי לשלוט בזהירות את זמן החילוץ ולשמור על תנאים לשחזור עבור כל הדגימות. לחלופין, ניתן להמיס דגימות מהסיבים ישירות לגב ' ללא הפרדה כרומטוגרפית המאפשרת ניתוח ממוקד של סמנים ספציפיים וקיצור ההליך כולו למספר דקות.