Name: הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטת הדמיית פלואורסצנציה לניתוח תעבורת נוירופילמנטים בעצבים מיאליניים מבודדים מעכברים טרנסגניים. שיטה זו מאפשרת מדידת כיווניות ומהירות התנועה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות פאולה מונסמה על הדרכה וסיוע עם מיקרוסקופית confocal וניתוק עצב ים ד"ר Atsuko Uchida, קלואי דגר וסאנה Chahande לסיוע עם גידוך העכבר. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן המדע הלאומית השיתופית Grants IOS1656784 ל-A.B. ו- IOS1656765 ל-P.J., והכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 NS038526, P30 NS104177 ו- S10 OD010383 ל-A.B. N.P.B. נתמכו על ידי מלגה מהתוכנית לחקר פוסט-טוטוריאלי של נשיא אוניברסיטת אוהיו.

<ol><li>Hoffman, P. N., Lasek, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+component+of+axonal+transport.+Identification+of+major+structural+polypeptides+of+the+axon+and+their+generality+among+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons.</a> Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).</li>
<li>Brown, A. Slow Axonal Transport. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+A+%22Reference+Module+in+Biomedical+Sciences%22">Reference Module in Biomedical Sciences</a>. , (2014).</li>
<li>Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+movement+of+axonal+neurofilaments+interrupted+by+prolonged+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).</li>
<li>Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+neurofilament+transport+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons.</a> Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).</li>
<li>Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+switch+between+distinct+mobile+and+stationary+states+during+their+transport+along+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).</li>
<li>Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+regulation+of+neurofilament+transport+by+myelinating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).</li>
<li>Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Acceleration+of+Neurofilament+Transport+at+Nodes+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier.</a> Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).</li>
<li>Li, Y., Brown, A., Jung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+axonal+transport+kinetics+of+neurofilaments+using+the+fluorescence+photoactivation+pulse-escape+method%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method.</a> Physical Biology. 11 (2), 026001(2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Breuer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+an+intra-axonal+organelle+traffic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis.</a> Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photoconversion%2C+and+FLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Model, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+calibration+and+flat-field+correction+for+fluorescence+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes.</a> Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).</li>
<li>Schmidt, M. M., Dringen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+iodoacetamide+and+iodoacetate+on+glycolysis+and+glutathione+metabolism+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroenergetics%22%5BJournal%5D)">Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes.</a> Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).</li>
<li>Surre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+increase+in+the+autofluorescence+of+cells+signals+struggle+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12088(2018).</li>
<li>Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Least+Squares+Congealing+for+Unsupervised+Alignment+of+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).</li>
<li>Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy+of+NAD%28P%29H+and+flavoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).</li>
<li>Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kymograph+analysis+with+high+temporal+resolution+reveals+new+features+of+neurofilament+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics.</a> Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).</li>
<li>Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Va+increases+the+efficiency+of+neurofilament+transport+by+decreasing+the+duration+of+long-term+pauses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses.</a> Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).</li>
<li>Xu, Z., Tung, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+Spatial+Variations+in+Slow+Axonal+Transport+Velocity+Along+Peripheral+Motoneuron+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons.</a> Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).</li>
<li>Jung, P., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Slowing+of+Neurofilament+Transport+Along+the+Mouse+Sciatic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve.</a> Physical Biology. 6 (4), 046002(2009).</li>
<li>Cohen, J. The effect size index: d. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+J+%22Statistical+Power+Analysis+for+the+Behavioral+Sciences+2nd+ed%22">Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed</a>. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria in vivo.</a> Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).</li>
<li>Gilley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+axonal+transport+and+locomotor+changes+and+tau+hypophosphorylation+in+a+%22P301L%22+tau+knockin+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse.</a> Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).</li>
<li>Marinkovic, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).</li>
<li>Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+declines+with+age+in+two+distinct+phases+separated+by+a+period+of+relative+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

יש לנקוט טיפול בניתוח של ניסויי פעימה-בריחה והתפשטות פולסים, כי יש פוטנציאל משמעותי להקדמה של שגיאה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד, בעיקר במהלך תיקון שדה שטוח, יישור תמונה ותיקון אקונומיקה. תיקון שדה שטוח הכרחי כדי לתקן את אי אחידות התאורה, מה שופך לירידה בעוצמה על פני שדה הראייה ממרכז לפריפריה. היקף אי-אחידות תלוי אורך הגל ולכן, תמיד צריך להתבצע באורך הגל כי הוא לשמש לרכישת הנתונים הניסיוניים. חשוב לוודא כי אי אחידות בתדמית השדה השטוח מייצגת באמת את אי-אחידות בתמונות שיש לתקן. ניסויי התפשטות הדופק פגיעים במיוחד לטעויות מתיקו...

הטרנספורט האקסונלי של neurofilaments הוכח לראשונה בשנות ה-70 על ידי תיוג דופק רדיואיזוטופי1. גישה זו הניבה שפע של מידע על תחבורה neurofilament ב vivo, אבל יש לו רזולוציה מרחבית וזמנית נמוכה יחסית, בדרך כלל על סדר של מילימטרים וימים במקרההטוב 2. יתר על כן, תיוג דופק רדיואיזוטופי היא גישה עקיפה הדורשת הזרקה והקרבה של בעלי חיים מרובים כדי ליצור קורס זמן יחיד. עם הגילוי של חלבוני פלורסנט והתקדמות במיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנות ה-90, לאחר מכן זה הפך להיות אפשרי לתעבורת neurofilament תמונה ישירות נוירונים תרבותיים בקנה מידה של שניות או דקות עם רזולוציה מרחבית תת מיקרומטר, מתן תובנה הרבה יותר גדולה לתוך מנגנוןתנועה 3. מחקרים אלה גילו כי פולימרים neurofilament באקסונים לנוע במהירות לסירוגין הן anterograde ו לאחור כיוונים לאורך מסלולים microtubule, מונע על ידי חלבונים מוטוריים microtubule. עם זאת, neurofilaments הם מבנים מוגבלים iffraction רק 10 ננומטר קוטר כי הם בדרך כלל רווחים מלבד שכניהם על ידי עשרות ננומטר בלבד; לכן, הפולימרים ניתן לעקוב רק נוירונים תרבותיים המכילים neurofilaments מופץ דלילה, כך פולימרים נעים ניתן לפתור משכניהם4. לכן, זה לא אפשרי כיום לעקוב אחר neurofilaments יחיד באקסונים המכילים פולימרים neurofilament בשפע, כגון אקסונים מילינציה.
כדי לנתח את התחבורה האקסונלית של neurofilaments באקסונים עשירים neurofilament באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנטית, אנו משתמשים בשיטת פלומת פעולה פלואורסצנטית שפיתחנו כדי ללמוד את התנהגות השהיה לטווח ארוך של neurofilamentsבתאי עצב מתואורים 4,,5. Neurofilaments מתויג עם חלבון היתוך נוירופילמנט פלואורסצנטי פוטואקטיבי מופעלים בקטע קצר של axon, ולאחר מכן קצב היציאה של נטים אלה מהאזור הפעיל הוא מכמת על ידי מדידת ריקבון פלואורסצנטי לאורך זמן. היתרון של גישה זו הוא שזה ניתוח ברמת האוכלוסייה של תחבורה neurofilament שניתן להחיל על זמן בקנה מידה של דקות או שעות ללא צורך לעקוב אחר התנועה של פולימרים neurofilament בודדים. לדוגמה, השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את הקינטיקה של תעבורת neurofilament בתרבויות מדליה6.
לאחרונה, תיארנו את הפיתוח של עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא רמות נמוכות של חלבון neurofilament מתויג paGFP M (paGFP-NFM) בנוירונים תחת שליטתו של הנוירון האנושי ספציפי Thy1מקדם 7. עכבר זה מאפשר ניתוח של תחבורת neurofilament בסיטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ. במאמר זה, אנו מתארים את הגישות הניסיוניות לניתוח תעבורת neurofilament באקסונים מיאליים של עצבי טיביים מעכברים אלה באמצעות שתי גישות. הראשונה של גישות אלה היא שיטת הבריחה הדופק המתואר לעיל. שיטה זו יכולה ליצור מידע על התנהגות ההשהיה של neurofilaments, אבל הוא עיוור לכיוון שבו הנינים לעזוב את האזור מופעל, ולכן אינו מאפשר מדידה של כיווניות נטו ומהירותתחבורה 8. השנייה של גישות אלה היא שיטת התפשטות פולסים חדשה שבה אנו מנתחים לא רק את אובדן הפלואורסצנטי מהאזור הפעיל, אלא גם את העלייה ארעית בפלואורסצנטיות בשני חלונות איגוף שדרכה נעים הניאורים הפלואורסצנטיים כשהם יוצאים מהאזור הפעיל הן בכיוון אנטרולוגי והן בכיוון הנסיגה. בשתי הגישות, ניתן להשיג פרמטרים של תעבורת נוירופילמנט כגון המהירות הממוצעת, כיווניות נטו והתנהגות השהיה באמצעות ניתוח מתמטי ומידול של השינויים בפלואורסצנטיות בחלונות המדידה. איור 3 ממחיש את שתי הגישות הללו.
פרוטוקול זה מדגים את הניתוח וההכנה של העצב, ההפעלה וההדמיה של הפלואורסצנטיות paGFP, וכמת של תעבורת neurofilament מהתמונות שנרכשו באמצעות חבילת ההפצה FIJI של ImageJ9. אנו משתמשים בעצב הטיבי כי הוא ארוך (כמה ס"מ) ואינו מסתעף; עם זאת, באופן עקרוני כל עצב המביע paGFP-NFM מתאים לשימוש עם טכניקה זו אם ניתן לנתח אותו de-נדן מבלי לפגוע האקסונים.

<table><tbody><tr><td>אטם מלבן 14 x 22 0.1 מ"מ</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>אטם פנימי</td></tr><tr><td>2-deoxy-D-glucose</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>אטם עגול 30 מ"מ עם חורים</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>אטם חיצוני</td></tr><tr><td>35 x 10 מ"מ צלחת</td><td>תרמו פישר</td><td>153066</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>40 מ"מ כיסויים עגולים</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 60 מ"ל - קצה Luer-lock</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD מערכת קונפוקלית של דיסק מסתובב</td><td>Andor</td><td></td><td>מצויד במערכות Perfect Focus ו-FRAPPA</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>עבור שקופית פלואורסצאין</td></tr><tr><td>D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חיתוך</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לדיסקציה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11251-30</td><td>מלקחיים בעלי קצה עדין</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>מחבת חיתוך עם שעווה</td><td>גינסברג</td><td>568859</td><td></td>מדעי</tr><tr><td>מספריים</td> כלי <td>מדע עדינים</td><td>14061-09</td><td>ראשוני מספריים לדיסקציה</td></tr><tr><td>FCS2 תא זלוף</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין נתרן</td><td>פלוקה</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>מחמם תמיסה מוטבע</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים למינקטומיה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>מלקחיים לדיסקציה ראשונית</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרואקוודוקט</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר</td><td>12-544-3</td><td>לשקופיות פלואורסצאין</td></tr><tr><td>הכנסת שלב מיקרוסקופ</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>מערכת חימום אובייקטיבית</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko מגע עם צווארון אובייקטיבי</td></tr><tr><td>שמן אובייקטיבי - סוג</td><td>A ניקון</td><td>הופסק</td><td></td></tr><tr><td>התוכנית Apo VC 100x 1.40 NA יעד</td><td>ניקון</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>נתרן</td><td>כלורי סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן iodoacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Sage Instruments</td><td>דגם 355</td><td></td></tr><tr><td>מתאם צינורות - נקבה</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1005109 מתאם צינורות - זכר</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1005012 Tygon צינורות</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16 אינץ' ID, 1/32 אינץ' עובי דופן</td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15018-10</td><td>מספריים עדינים</td></tr></tbody></table>

הדמיה וניתוח של תעבורת neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

פולימרים חלבון Neurofilament לנוע לאורך אקסונים ברכיב איטי של תחבורה אקסונלית במהירויות ממוצעות של ~ 0.35-3.5 מ"מ ליום. עד לאחרונה המחקר של תנועה זו ב situ היה אפשרי רק באמצעות תיוג דופק רדיואיזוטופי, המאפשר ניתוח של תחבורה אקסונלית בעצבים שלמים עם רזולוציה זמנית של ימים ורזולוציה מרחבית של מילימטרים. כדי ללמוד תחבורה neurofilament בסיטו עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה יותר, פיתחנו עכבר טרנסגני hThy1-paGFP-NFM המבטא חלבון neurofilament M מתויג עם GFP פוטואקטיבית בנוירונים. כאן אנו מתארים פלואורסץ פוטו-הפעלה פולס-לברוח ושיטות התפשטות דופק לנתח תחבורה neurofilament באקסונים מיאליים יחיד של עצבי השוקה מעכברים אלה ex vivo. קטעי עצב מבודדים נשמרים על שלב המיקרוסקופ על ידי עירוי עם תמיסת מלח מחומצנת ותמונה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנס דיסק ספינוד ספינוד. אור סגול משמש להפעלת הפלואורסצנס בחלון קצר. הפלואורסצינטיות באזורים הפעילים והמאגפים מנותחת לאורך זמן, מה המאפשר את המחקר של תעבורת נוירופילמנט עם רזולוציה זמנית ומרחבית בסדר של דקות ומיקרונים, בהתאמה. מידול מתמטי יכול לשמש כדי לחלץ פרמטרים קינטיים של תעבורת neurofilament כולל המהירות, הטיה כיוונית והתנהגות ההשהיה מהנתונים המתווברים. שיטות הבריחה הדופק והתפשטות הדופק ניתן גם להתאים כדי לדמיין את התחבורה neurofilament בעצבים אחרים. עם התפתחותם של עכברים טרנסגניים נוספים, שיטות אלה יכול לשמש גם כדי למצוא תמונה ולנתח את ההובלה האקסונלית של חלבונים ציטוסקאלטיים וציטוסוליים אחרים באקסונים.

איור 3 מציג תמונות מייצגות מניסויים בפעימה והתפשטות פולסים. פרסמנו מספר מחקרים המתארים נתונים שהושגו בשיטת הבריחה מהדופק והשיטות שלנו לניתוחנתונים אלה 5,,6,,7,,8,,17. להלן, אנו מראים כיצד נתוני התפשטות הדופק יכולים להניב מידע על הכיווניות והמהירות של תעבורת נוירופילמנט, שלא דיווחנו על כך בעבר.
תעבורת נו...

אנו מתארים שיטות פוטואקטיביות פלואורסצינטיות כדי לנתח את ההובלה האקסונלית של neurofilaments באקסונים מינרטיים בודדים של עצבים היקפיים מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון neurofilament פוטואקטיבי.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ישירה של אוכלוסיית הנוירופילמנטים באקסונים שעברו מיאלין מעכברים צעירים או בוגרים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ומאפשר למדוד את הכיווניות והמהירות של הובלת נוירופילמנט במקטעי עצב מבודדים. שיטה זו תלויה בזמינותם של עכברים המבטאת היתוך פלואורסצנטי פוטואקטיבי של חלבון העניין, אך ניתן להתאים אותה לשימוש בכל עצב שניתוח בקלות. כדי להתחיל, יוצקים מלוחים מחומצן לתוך מזרק 60 מיליליטר ולהבטיח כי יש אוויר מינימלי שנותר במזרק.חבר את המזרק לאמבטיה, ולאחר מכן למקם את צינור הזרימה לתוך בקבוק פסולת. מניחים את אטם החיצוני לתוך דיור תא זלוב, להבטיח כי נכנס זרימה והודעות שקע מיושרים עם החורים באטם, ולאחר מכן להניח את אטם הפנימי על מספר 1.5 כיסוי מעגלי בזהירות להחליק את כל הקמטים באטם כדי להבטיח אטם הדוק. מניחים את הכיסוי ואת אטם על מגבת נייר או לנגב את המשימה עם אטם פונה כלפי מעלה.השתמש זוג מספריים ניתוח גדול לעשות חתך הגבי בעור ליד אמצע עמוד השדרה ולהמשיך לחתוך סביב ההיבט הגחוני של החיה. לאט למשוך את העור מן השריר לחתוך את fascia. לאחר מכן, השתמש מספריים microdissection לעשות חתך בשרירי הירך באמצע הדרך בין הזנב והברך כדי לחשוף את העצב הסיאטי.ודא כי העצב, אשר נראה דרך השריר, לא נחתך. להאריך את החתך dorsally ו ventrally כדי להסיר את השריר, ולאחר מכן להסיר את השרירים של העגל, שמירה על חתכים רדודים וקצרים, כדי למנוע פגיעה בעצבים. המשיכו להסיר את השרירים עד שעצב הטיביאלי ייחשף במלואו מהנקודה שבה הוא מסתעף מהעצב הסיאטי לעקב.אחוז בעצב הטיביאלי בקצה הפרוקסימלי של עמוד השדרה עם זוג מלקחיים וגזור אותו עם זוג מספריים microdissection, הקפד לא להחיל יותר מדי מתח על העצב. בזהירות להרים אותו מן השריר לחתוך את כל ההחזקות, דואג לא לשים מתח על העצב. חותכים את הקצה הדיסטלי של עמוד השדרה של עצב הטיביאלי ומעבירים אותו לצלחת פטרי קטנה של תמיסת מלח מחומצן בטמפרטורת החדר.החל מהקץ הפרוקסימלי של העצב, תופסים בעדינות את קצות האקסון החשופים בזוג מלקשי קצה עדיפים מאוד. עם זוג שני של מטלפים, לתפוס את נדן העצב proximally ולאט לאט למשוך לכיוון הקצה הדיסטלי של העצב לוודא כי אין מתח מיותר מוחל במהלך תהליך זה. לתפוס את הקצה הפרוקסימלי של העצב לאט להניח אותו על כיסוי, ואז ליישר אותו תחת מתח עדין.מניחים את החלקת המיקרו-מים מעל העצב עם החלקה מחורצת כלפי מטה וממקמים את כיוון הזרימה במקביל לעצב. הופכים את הכיסוי ואת הרכבת המיקרו-אוורור ומ מניחים אותו בתא הזלולה עם המגלשה המתנגדת לאגם החיצוני. כדי לאבטח את תא ההתבוללות, מקם אותו בדיור המתכת וסובב את טבעת הנעילה.לאט לאט לדכא את הבוכנה מזרק מלוחים ולמלא את תא חליטה. שמור את שקע ושקע צינורות, בקבוק שקע, מזרק מוגבה מעל התא עצמו בכל עת במהלך ההתקנה והדמיה. מעבירים את מכלול ההתנפחות לשלב מיקרוסקופ הפוך והרו את מזרק התמיסת מלח לתוך משאבת המזרק, ואז התחילו את המנוע והתאיימו את המהירות לקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה.חבר את תנור התותב בתוך השורה והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. חבר את התנור האובייקטיבי והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. החל שמן על המטרה ולהכניס את תא שפע לתוך הר הבמה.החל שמן על כרית תנור התא ולחבר אותו לתא חליטה, ולאחר מכן לחבר אותו ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. נעל את תא ההתווספה לתוך מתאם הבמה והכנס את השמן האובייקטיבי למגע עם המכסה בצד התחתון של התא. השתמש בתאורה של Brightfield כדי להתמקד בשכבת האקסונים על פני השטח התחתונים של העצב הקרוב ביותר למשטח הכיסוי.אקסונים מירליים ניתן לזהות על ידי נוכחות של נדן מירלין אשר נראה תחת תאורת אור משודרת Brightfield ללא שיפור ניגודיות. לרכוש תמונת התייחסות Brightfield, הקלטת הכיווניות של העצב, ולאחר מכן לרכוש תמונה confocal באמצעות לייזר ננומטר 488 ומסנן פליטה מתאים GFP photoactivatable. הגדר את כוח הלייזר לכוח הדמיה תקין בערך פי חמישה ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של שלוש עד ארבע דקות, ולאחר מכן רכוש תמונה קונפוקנטית נוספת כדי לתעד את השפע האוטומטי לפני ההפעלה לאחר שלב ההלבנה.צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל הרצוי של חלון ההפעלה של התמונה של ברייטפילד. באמצעות קו זה כמדריך, צייר אזור מלבני של עניין לאורך שדה התצוגה בניצב אל האקסונים. הפעל את פלואורסצנטיות GFP באזור זה על ידי גירוי דפוס עם אור 405 ננומטר, לוודא כי תמונה נרכשת רק לפני ומיד לאחר ההפעלה.עם סיום ההפעלה, התחל שעון זמן של דקה אחת. כאשר הוא יוצא לדרך, התחל רכישה של סדרת timelapse. מוסיפים 250 מיליגרם של אבקת פלואורסין ל-0.5 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ומערבבים עד שאין חלקיקים נראים לעין, ואז מסובבים את הפתרון במשך 30 שניות בצנטריפוגה על השולחן כדי להזרים כל חומר בלתי פתור.הוסף שמונה microliters של פתרון פלואורסצין לשקופית ולהחיל מספר 1.5 coverslip. מחקים את הנוזל העודף, אוטמים את הכיסויים בלק, ומאפשרים לשקופית להתייבש. מניחים את צד המכסה של השקופית על שלב המיקרוסקופ ההפוך ומתאימים את ההתמקדות במישור הדק של הפלואורסצנטיות על פני השטח של הכיסוי.הזז את השקופית מסביב כדי למצוא שדה מבט שאינו מכיל בועות אוויר או חלקיקי פלואורסצין גדולים ולרכוש מחסנית Z המשתרעת על פני שישה מיקרומטר במרווחי מיקרומטר של 0.2 כך שהתמונה האמצעית היא מישור המיקוד המקורי. סגור את כל תריסי נתיב האור כולל תריס המצלמה והגדר את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה לאפס שניות. רכוש ערימה של 100 תמונות עם הגדרות אלה, אשר יהיה ממוצע כדי ליצור את תמונת השדה הכהה.תמונות מייצגות מניסויי בריחה דופק והתפשטות דופק מוצגות כאן. עבור שיטת בריחת הדופק, קינטיקה ריקבון פלואורסצנטי באזור מופעל יכול להניב מידע על התנהגות השהיה לטווח ארוך וקצר. האזור המופעל יכול להיות קצר עבור ניסויים אלה.אזור פעיל יותר משמש לשיטת התפשטות הדופק על מנת לספק מאגר גדול יותר של נוירופילמנטים פלואורסצנטיים. זה מאריך את הזמן שבו עליית הפלואורסצנטיות באזורי האגף נשארת ליניארית. 15 חלונות אגף מיקרומטר משמשים כאן.הפלואורסצנטיות המוחלטת מחלון המדידה כומתה. הריקבון הוא דו-פאסי לשיטת בריחת הדופק עם ריקבון אקספוננציאלי ראשוני המייצג את עזיבתם של נוירופילמנטים על המסלול וריקבון מעריכי איטי יותר שני ב 10 עד 20 דקות המייצג את עזיבתם של תריסים מחוץ למסלול. עבור אסטרטגיית התפשטות הדופק, חישובי המהירות והכיוון של התנועה תלויים רק במדרונות בחלונות האגף.עבור אורכי החלון המשמשים כאן, השלב ליניארי נמשך כחמש דקות. timelapse מ עצב מעוכב גליקוליט מוצג כאן, המדגים ירידה לכאורה בתחבורה מחוץ לאזור הפעיל. ואכן, המדרונות הדיסטליים וה ופרוקסימליים נמוכים משמעותית בעצבים המטופלים במעכבים.כמו כן חלה ירידה משמעותית במהירות האוכלוסייה בין שני תנאים אלה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי חיוני להיות חפוז בניהול החלקים ניתוח הרכבה התא כמו בריאות העצבים יורדת בעקבות הקרבת החיה. תרבות תאים עצביים יכולה לאפשר מדידה וניתוח של התנועה של neurofilaments בודדים, אשר ישלים את הנתונים בקנה מידה האוכלוסייה שנאספו באמצעות פרוטוקול זה.

imaging-analysis-neurofilament-transport-excised-mouse-tibial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

בדו"ח זה אנו מתארים שיטה למחוץ העצב העכבר הנשה. שיטה זו משתמשת מלקחיים עוצר דמום זמינים ובקלות reproducibly מייצרת העצב המלא למחוץ הנשה. בנוסף, אנו מתארים שיטה להכין mounts שרירים שלמים מתאימים לניתוח של התחדשות עצבים אחרי למחוץ גיד הנשה.

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לדמיין את העצב הפגוע, אשר מציג עלייה פרוגרסיבית נפיחות אקסונלית ניתוקים.

אנליזה מיקרוסקופית אלקטרונית של נזק אקסונלי בעצב הראייה של עכברים עם פגיעה מוחית

מקור:  Boyer, N. P. et. al., הדמיה וניתוח של הובלת נוירופילמנטים בעצב השוק של עכבר שנכרת. J. Vis. exp.} (2020)}{{}}}סרטון זה מדגים את שיטת הפוטו-אקטיבציה הפלואורסצנטית לניתוח הובלת נוירופילמנטים באקסונים מיאליניים של עצבים היקפיים. על ידי מעקב אחר נוירופילמנטים ירוקים מתויגים בפלואורופור, הטכניקה מספקת תובנות לגבי הובלה אקסונלית במחלות ניווניות.

הדמיית פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית של הובלת נוירופילמנטים באקסונים של עכברים עם מיאלין 

הפרוטוקול להדמיה אורך דינמית ונגע לייזר סלקטיבית של קצות עצבים בעכברים מהונדסים כתב מוצג.

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

הפרוטוקול מראה שיטה לבחינת קורלציה מרחבית בין ההדקים הקדם-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים ותאי שוואן הפרי-סינפטיים בשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם סמנים ביולוגיים שונים, כלומר נוירופילמנט 200, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי, אלפא-בונגארוטוקסין ו-S100.

הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

למד שיטת הדמיית פלואורסצנציה לניתוח תעבורת נוירופילמנטים בעצבים מיאליניים מבודדים מעכברים טרנסגניים. שיטה זו מאפשרת מדידת כיווניות ומהירות התנועה בזמן אמת.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

גלה סרטונים נוספים