Name: נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: למד שיטה לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים באמצעות אולטרסאונד ממוקד ומיקרובועות. הפרוטוקול מאפשר מסירת תרופות יעילה לטיפול בגליומות ומחלות מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי KWF-STW (אספקת סמים על ידי Sonoporation בילדות מפוזרת פנימית פונטין Glioma ו Glioma בדרגה גבוהה). אנו מודים לאליה סקצ'קוב וצ'ארלס מוגנות על תשומת ליבם בפיתוח המערכת.

כל הניסויים ב vivo אושרו על ידי ועדת האתיקה ההולנדית (מספר רישיון היתר AVD114002017841) ואת הגוף לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת Vrije אמסטרדם, הולנד. החוקרים הוכשרו ביסודות מערכת FUS על מנת למזער את אי הנוחות של בעלי החיים.
1. מערכת אולטרסאונד ממוקדת
הערה: ההתקנה המתוארת היא מערכת שיבוש BBB מובנית המבוססת על רכיבים זמינים מסחרית וכוללת חרוט בהתאמה אישית בהדפסה תלת-ממדית ופלטפורמה סטראוטקטית הניתנת להסרה. המערכת מתוכננת מודולרית, המאפשרת שינויים בהתאם לציוד הזמין ושימוש ספציפי. הפרוטוקול מתאר את ההליך עבור sonoporation של שטח גדול יותר באזור פונטין של מוח העכבר. על ידי התאמת מיקום היעד, חלקים שונים של המוח יכולים להיות ממוקדים. במחקר זה נעשה שימוש במתמר מונו-אלמנט של 1 מגה-הרץ באורך מוקד של 75 מ"מ, צמצם של 60 מ"מ ואזור מוקד של 1.5 x 1.5 x 5 מ"מ (FWHM של לחץ שיא). מישור המוקד של המתמר ממוקם דרך הגולגולת של החיה במישור האופקי המצטלב עם מוטות האוזן.
<ol><li>בחר מתמר מתאים לפתיחת BBB במכרסמים. הערה: בהתבסס על המאפיינים של microbubbles ואת התדירות המועסקים, ההגדרות האקוסטיות, במיוחד את האינדקס המכני (MI), כפופיםלשינויים 13,38.</li>
	<li>הנח את המתמר בקונוס המודפס בתלת-ממד.</li>
	<li>השתמש קרום מיילר שקוף אקוסטית בקצה התחתון של החרוט כדי להשיג צימוד אקוסטי של נתיב התפשטות הקרן, ולמלא את הקונוס עם מים degassed.</li>
	<li>הר את המתמר מעל החיה על במה ליניארית ממונעת כפי שמוצג באיור 1 ומאפשר מיקום אנכי אוטומטי של המתמר.</li>
	<li>תכננו פלטפורמה סטראוטקטית נתיקת המבוססת על דרישות המחקר, הכוללת מוטות חימום, ביס ואוזן מווסתים בטמפרטורה, הרדמה וסמנים פידוקאליים רב-מודאליים, כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2. ההרכבה של הפלטפורמה הסטריאוטקטית מורכבת ממערכת שלבים ליניארית דו-מימדית, המאפשרת מיקום אוטומטי מדויק (< 0.1 מ"מ) של החיה מתחת לקורה.</li>
	<li>חבר את המתמר לשרשרת הפליטה האקוסטית המוצגת באיור 1 המורכבת ממתמר, מחולל פונקציות ומגבר חשמל.</li>
	<li>לתכנן צינור עיבוד תמונה כדי לזהות את סמנים fiducial רב מודאלי המאפשר מיקוד sonoporation מדויק של אזור המוח של עניין ואיסוף של נתוני cavitation זוהה על ידי הידרופון המחט.</li>
	<li>כייל את המערכת וקבע את נקודת המיקוד של המתמר בהתכתבות עם מיקום אנכי של החיה בפלטפורמה הסטריאוטקטית.</li>
</ol>2. הכנת בעלי חיים
הערה: הפרוטוקול הבא מצוין עבור עכברים אך ניתן להתאים אותו לחולדות. עבור ניסויים אלה נעשה שימוש בעכברים בעירום אתימי נקבה Foxn1-/- (בן 6-8 שבועות).
<ol><li>אפשרו לבעל החיים להתאקלם לפחות שבוע במתקן החיות ולשקול את החיה באופן קבוע.</li>
	<li>ניהול buprenorphine (0.05 מ"ג /ק"ג) באמצעות הזרקה תת עורית (s.c.) 30 דקות לפני הטיפול FUS כדי להתחיל טיפול משכך כאבים.</li>
	<li>יש להרדים את החיה עם 3% isoflurane, 2 L/min O2 ולוודא כי החיה מורדמת עמוקות. שמור על בעלי החיים מורדמים במהלך כל ההליך ולפקח על תדירות הנשימה ואת קצב הלב כדי להתאים את הריכוז של isoflurane כנדרש.</li>
	<li>יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע עיניים יבשות ולמנוע פגיעה אפשרית.</li>
	<li>הסר שיער על החלק העליון של הראש עם סכין גילוח קרם depilatory לשטוף לאחר מכן עם מים כדי להסיר את כל השאריות, כדי למנוע גירוי על העור.</li>
	<li>לניסויים עם מודלים גידול BLI, להזריק 150 μL של D-לוציפרין (30 מ"ג / מ"ל) תוך-פיטוני (i.p.) עם מזרק אינסולין 29 G עבור BLI תמונה הדרכה.</li>
	<li>הכנס קטטר וריד זנב 26-30 G ורוקן את הקטטר והווריד עם נפח קטן של פתרון הפרין (5 ממשק משתמש / מ"ל). ממלאים את הקטטר בתמיסת הפרין כדי למנוע קרישת דם. הערה: צנתור טוב נראה כאשר יש ריפלוקס של דם לתוך הקטטר. הימנע בועות אוויר בקטטר כדי למנוע emboli. כדי למנוע לחץ הזרקה מוגזם, ודא את אורך הקטטר הוא קצר ככל האפשר.</li>
	<li>מניחים את החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית המווסתת בטמפרטורה כדי למנוע היפותרמיה. הערה: היפותרמיה מפחיתה את זרימת הדם, אשר יכול להשפיע על הזרקה / זרימת הדם של microbubbles ואת הפרמקוקינטיקה של התרופות39.</li>
	<li>לשתק ולתקן את הראש של החיה על הפלטפורמה הסטריאוטיפית באמצעות מוטות אוזניים ובר ביס. מקובעים את הגופה ברצועה ומדביקים את זנב החיה לרציף.</li>
</ol>3. באולטרסאונד ממוקד מונחה תמונה vivo
הערה: עבור פרוטוקול זה מתמר מונו-אלמנט 1 MHz עם דופק פרץ טון עם משך 10 ms, MI של 0.4 ותדר חזרה על הדופק של 1.6 הרץ עם 40 מחזורים עבור 240 s שימש. הפרוטוקול מותאם למיקרו-בועות המיוצבות על ידי פוספוליפידים המכילים הקספלואוריד גופרית (SF6)כגז בלתי מזיק, לפיו קוטר הבועה הממוצע הוא 2.5 מיקרומטר ויותר מ -90% מהבועות קטנות מ -8 מיקרומטר.
<ol><li>הנח את הפלטפורמה הסטריאוטקטית עם החיה הרכובה במדולי ההדמיה(למשל, BLI או רנטגן) וצלם תמונות של החיה.</li>
	<li>השתמש בסמנים פידוקאליים רב-מודאליים בשילוב עם צינור עיבוד התמונה כדי לסמן את מיקום החיה בהתאם לנקודת המוקד של המתמר.</li>
	<li>קבעו את אזור היעד על ידי הצבת קו מתאר של המוח מעל תמונת הרנטגן הנרכשת או שימוש בתמונות BLI כדי לקבוע את מרכז הגידול (איור 2). המיקום של חלקים מסוימים של המוח מצוינים אטלס המוח Paxinos40 באמצעות סימוני הגולגולת bregma ו lambda כנקודות התייחסות. לדוגמה, ה-pons ממוקם x=-1.0, y=-0.8 ו- z=-4.5 ממבדה.</li>
	<li>להגן על הנחיריים והפה של החיה עם סרט דבק כדי למנוע ג'ל אולטרסאונד להפריע לנשימה.</li>
	<li>החל ג'ל אולטרסאונד על ראשה של החיה.</li>
	<li>לחזור בו מעור צווארם של בעלי החיים, לשמן את המחט הידרופון עם ג'ל אולטרסאונד ומניחים את ההידרופון המחט בסביבה הישירה של עצם העורף.</li>
	<li>הנחה את המתמר למיקום הנכון באמצעות צינור עיבוד התמונה ונקודת המוקד.</li>
	<li>החל את ההגדרות שנקבעו מראש על כל המכשירים המחוברים ולמקד את אזור המוח של עניין. הערה: בהתאם לשאלת המחקר, ניתן לציין אזורי גידול או מוח כמוקד יחיד או כצורה נפחית, כפי שמוצג באיור 2.</li>
	<li>הפעל microbubbles כמתואר על ידי היצרן. להזריק בולוס אחד של 120 μL (5.4 מיקרוגרם) של microbubbles.</li>
	<li>לשטוף את קטטר וריד הזנב עם מלוחים כדי לבדוק את פתיחת הקטטר.</li>
	<li>להזריק את microbubbles ולהתחיל את ההסתבכות.</li>
	<li>הקלט קיבוץ מיקרו-בובל עם ההידרופון של המחט.</li>
	<li>לנהל סוכן ניגודיות תוך וסקולרי או תרופה לאחר sonoporation. המינון, העיתוי והתכנון תלויים במטרת המחקר והתרופה. הערה: כחול אוונס הוא סוכן צבע נפוץ להעריך BBB פתיחת41.</li>
	<li>לפקח על החיה עד לנקודת הזמן שנקבעה מראש או לפני נקודת הקצה ההומנית.</li>
</ol>4. ניתוח של cavitation microbubble
הערה: כאן מתואר ההליך החל, אשר מתאים ניסויים vivo עבור SF6-phospholipid microbubbles עם קוטר ממוצע של 2.5 מיקרומטר (80% של בועות מתחת 8 מיקרומטר) נרגש עם דופק פרץ טון של 10 ms משך בתדירות של 1 MHz, כפי שהוצע במקור על ידי McDannold ואח'.
<ol><li>Fourier-להפוך את אות PCD מוקלט מקבוצת הזמן לתוך תחום התדירות.</li>
	<li>שלב את העוצמה הספקטרלית המתקבלת לגילוי יציבות של cavitation סביבההרמוניה השנייהוהשלישית (± 50 קילו-הרץ), כפי שמוצג באיור 3 (תיבה ירוקה ב- 2 ו- 3 מגה-הרץ).</li>
	<li>שלבו את העוצמה הספקטרלית לגילוי קוויציה אינרציאלי, בין התדר הראשי, ההרמוניה2 nd,3rd, ה- 1 st ו- 2nd ultraharmonic והתת-הרמוני הראשון (± 150 קילו-הרץ), כפי שמוצג באיור 3 (תיבות אדומות).</li>
	<li>שלב את העוצמה הספקטרלית סביב התדר העקרוני (1 מגה-הרץ ± 50 קילו-הרץ) לנורמליזציה של אותות PCD שהושגו בעבר. הערה: אות ה-PCD, עבור מיקרו-בועות SF6-פוספוליפידים בניסויי vivo במהירות של 1 מגה-הרץ, אינו מציג אולטרה-הרמוניה או תת-הרמוניה לפני שההתלכדות האינרטיבית מופיעה, כפי שמוצג באיור 3.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר זה, פיתחנו מערכת FUS מבוססת תמונה חסכונית עבור שיבוש BBB חולף לאספקת תרופות מוגברת לתוך parenchyma המוח. המערכת נבנתה ברובה עם רכיבים מסחריים זמינים בשילוב עם רנטגן ו- BLI. המודולריות של העיצוב המוצע מאפשרת שימוש במספר שיטות הדמיה לתכנון והערכה בתזומות עבודה בעלות תפוקה גבוהה. המערכת יכולה להיות משולבת עם אופנים מקיפים יותר ברזולוציה גבוהה הדמיה תלת-ממדית, למשל MRI ברזולוציה גבוהה או מיקרו-CT, ואילו עבור החלק הארי של המחקר 2D הדמיה אופנים כגון רנטגן 2D ו / או BLI משמשים. רנטגן דו מימדי ו/או BLI הם שניהם הרבה יותר ח...

מחסום הדם - מוח (BBB) הוא מכשול מרכזי להעברת סמים לתוך parenchyma המוח. רוב התרופות הטיפוליות שפותחו אינן חוצות את ה- BBB בשל הפרמטרים הפיזיוכימיים שלהן (למשל, ליפופיליות, משקל מולקולרי, מקבלי קשר מימן ותורמים) או אינן נשמרות בשל זיקתן למובילי קולוקס במוח1,2. הקבוצה הקטנה של תרופות שיכולות לחצות את BBB הם בדרך כלל מולקולות ליפופיליות קטנות, אשר יעילים רק במספר מוגבל של מחלות מוח1,2. כתוצאה מכך, עבור רוב מחלות המוח, אפשרויות הטיפול הפרמקולוגי מוגבלות ואסטרטגיות אספקת תרופות חדשות נדרשות3,4.
אולטרסאונד טיפולית היא טכניקה מתפתחת שניתן להשתמש בה עבור יישומים נוירולוגיים שונים כגון הפרעה BBB (BBBD), נוירומודולציה, אבלציה4,5,6,7. על מנת להשיג פתיחת BBB עם פולט אולטרסאונד חוץ גשמי דרך הגולגולת, אולטרסאונד ממוקד (FUS) משולב עם microbubbles. תוצאות FUS בתיווך Microbubble הזמינות הביולוגית מוגברת של תרופות parenchyma המוח5,8,9. בנוכחות גלי קול, microbubbles מתחילים להתנדנד ייזום transcytosis ושיבוש של הצמתים ההדוקים בין תאי האנדותל של BBB, המאפשר הובלה paracellular של מולקולות גדולותיותר 10. מחקרים קודמים אישרו את המתאם בין עוצמת הפליטה האקוסטית לבין ההשפעה הביולוגית על פתיחת BBB11,12,13,14. FUS בשילוב עם microbubbles כבר נעשה שימוש בניסויים קליניים לטיפול גליובלסטומה באמצעות temozolomide או דוסורוביצ'ין ליפוזומלי כסוכן כימותרפי, או לטיפול במחלת אלצהיימר וטרשת לרוחב amyotrophic5,9,15,16.
מאז אולטרסאונד בתיווך BBB תוצאות אפשרויות חדשות לחלוטין עבור פרמקותרפיה, דרוש מחקר פרה-קליני לתרגום קליני כדי להעריך את התגובה הטיפולית של מועמדים נבחרים לתרופות. פעולה זו דורשת בדרך כלל זרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה עם דיוק מרחבי גבוה ועדיף זיהוי cavitation משולב לניטור פתיחת BBB ייעודית עם יכולת רבייה גבוהה. במידת האפשר, מערכות אלה צריכות להיות חסכוניות הן בהשקעה הראשונית והן בעלויות התפעול על מנת להיות מדרגיות בהתאם לגודל המחקר. רוב מערכות FUS פרה-קוליניות משולבות עם MRI להנחיית תמונה ותכנון טיפול15,17,18,19. למרות MRI נותן מידע מפורט על האנטומיה הגידול ונפח, זוהי טכניקה יקרה, אשר מבוצעת בדרך כלל על ידי מפעילים מאומנים / מיומנים. בנוסף, MRI ברזולוציה גבוהה לא תמיד יכול להיות זמין לחוקרים במתקנים פרה-קוליניים ודורש זמני סריקה ארוכים לכל בעל חיים, מה שהופך אותו פחות מתאים למחקרים תרופתיים בתפוקה גבוהה. ראוי לציין כי, עבור מחקר פרה-קליני בתחום הנוירו-אונקולוגיה, במיוחד מודלים של גידולים מסתננים, האפשרות לדמיין ולמקד את הגידול חיונית להצלחת הטיפול20. נכון לעכשיו, דרישה זו מתקיימת רק על ידי MRI או על ידי גידולים transduced עם photoprotein, המאפשר הדמיה עם הדמיה bioluminescence (BLI) בשילוב עם ניהול של מצע photoprotein.
מערכות FUS מונחות MRI משתמשות לעתים קרובות באמבט מים כדי להבטיח התפשטות גלי אולטרסאונד ליישומים טרנס-קרניים, לפיה ראש החיה שקוע בחלקו במים, מה שמכונה מערכות 'מלמטה למעלה'15,17,18. בעוד עיצובים אלה עובדים בדרך כלל היטב במחקרים בבעלי חיים קטנים יותר, הם פשרה בין זמני הכנת בעלי חיים, ניידות ותקנים היגייניים הניתנים לתחזוקה מציאותית במהלך השימוש. כחלופה MRI, שיטות הדרכה אחרות לניווט סטראוטקטי להקיף את השימוש אטלס אנטומי מכרסמים21,22,23, מצביע לייזר סייע ראייהחזותית 24, סיכה בסיוע מכשיר סריקה מכני25, או BLI26. רוב העיצובים הללו הם מערכות "מלמעלה למטה" שבהן המתמר ממוקם על ראשו של בעל החיים, כאשר החיה נמצאת במצב טבעי. זרימת העבודה 'מלמעלה למטה' מורכבת מאמבט מים22,25,26 או חרוט מלא מים21,24. היתרון של שימוש במתמר בתוך חרוט סגור הוא טביעת הרגל הקומפקטית יותר, זמן התקנה קצר יותר ואפשרויות טיהור ישר קדימה המפשטות את זרימת העבודה כולה.
האינטראקציה של השדה האקוסטי עם microbubbles הוא תלוי בלחץ נע בין תנודות משרעת נמוכה (המכונה cavitation יציב) כדי התמוטטות בועה חולפת (המכונה cavitation אינרציאלי)27,28. יש קונצנזוס מבוסס כי אולטרסאונד-BBBD דורש לחץ אקוסטי הרבה מעל סף cavitation יציב כדי להשיג BBBD מוצלח, אבל מתחת לסף cavitation אינרציאלי, אשר קשורה בדרך כלל עם נזק כלי דם / עצביים29. הצורה הנפוצה ביותר של ניטור ובקרה היא ניתוח של האות האקוסטי המפוזר (האחורי) באמצעות זיהוי cavitation פסיבי (PCD), כפי שהוצע על ידי McDannold ואח'12. PCD מסתמך על ניתוח ספקטרום פורייה של אותות פליטת microbubble, שבו הכוח והמראה של סימני ההיכר cavitation יציב (הרמוניקה, subharmonics, ו ultraharmonics) וסמני cavitation אינרציאלי (תגובת פס רחב) ניתן למדוד בזמן אמת.
"מידה אחת מתאימה לכולם" PCD-ניתוח לבקרת לחץ מדויקת מסובך בשל polydispersity של ניסוח microbubble (משרעת תנודה תלויה מאוד בקוטר הבועה), ההבדלים בתכונות מעטפת בועה בין מותגים, ואת התנודה האקוסטית, אשר תלוי מאוד בתדירות ולחץ30,31,32. כתוצאה מכך, הוצעו פרוטוקולי זיהוי PCD רבים ושונים, אשר הותאמו לשילובים מסוימים של כל הפרמטרים הללו ושימשו בתרחישי יישומים שונים (החל מניסויים במבחנה על פרוטוקולים קטנים של בעלי חיים ועד PCD לשימוש קליני) לגילוי cavitation חזק ואפילו לבקרת משוב רטרואקטיבית של הלחץ11,14,30,31,32,33,34,35. פרוטוקול PCD המועסקים בהיקף של מחקר זה נגזר ישירות מ McDannold ואח'12 ומנטר את הפליטה ההרמונית לנוכחות של cavitation יציב ורעש פס רחב לגילוי cavitation אינרציאלי.
פיתחנו מערכת FUS נוירון מונחה תמונה לפתיחה חולפת של BBB כדי להגדיל את אספקת הסמים לתוך parenchyma המוח. המערכת מבוססת על רכיבים מסחריים זמינים וניתן להתאים אותה בקלות למספר שיטות הדמיה שונות, בהתאם לטכניקות ההדמיה הזמינות במתקן בעלי החיים. מכיוון שאנו זקוקים לזרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה, בחרנו להשתמש בצילום רנטגן ו- BLI להנחיית תמונה ותכנון טיפול. תאים סרטניים שעברו עירוי עם פוטופרוטאין (למשל, לוציפראז) מתאימים להדמיית BLI20. לאחר מתן מצע photoprotein, תאים סרטניים ניתן לפקח vivo וצמיחה הגידול ואת המיקום ניתן לקבוע20,36. BLI הוא מודאליות הדמיה בעלות נמוכה, הוא מאפשר לעקוב אחר הגידול לאורך זמן, יש לו זמני סריקה מהירים והוא מתואם היטב עם צמיחת הגידול נמדד עם MRI36,37. בחרנו להחליף את אמבט המים בקונוס מלא מים המחובר לתמר כדי לאפשר גמישות להזיז בחופשיות את הפלטפורמה שעליה רכוב המכרסם8,24. העיצוב מבוסס על פלטפורמה נתיקת המצוידת בשילוב של (I) סמנים סטריאוטקטיים לבעלי חיים קטנים (II) עם מערכת חימום בעלי חיים מווסתת רנטגן ותמונות אופטיות (III) הניתנת להסרה מהירה, ומערכת חימום בעלי חיים משולבת (IV). לאחר האינדוקציה הראשונית של הרדמה, החיה מותקנת במיקום מדויק על הרציף שבו היא נשארת במהלך ההליך כולו. כתוצאה מכך, האסדה כולה עוברת את כל התחנות של זרימת העבודה של ההתערבות כולה, תוך שמירה על מיקום מדויק וניתן לשחזור והרדמה מתמשכת. תוכנת הבקרה מאפשרת זיהוי אוטומטי של סמני fiducial ורושמת באופן אוטומטי את כל סוגי התמונות ודרכי התמונה (כלומר, מיקרו-CT, רנטגן, BLI והדמיה פלואורסצנטית) למסגרת הייחוס של הפלטפורמה הסטראוטקטית. בעזרת הליך כיול אוטומטי, אורך המוקד של מתמר אולטרסאונד ידוע בדיוק בפנים, המאפשר היתוך אוטומטי של תכנון התערבותי, משלוח אקוסטי וניתוח הדמיה מעקב. כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2, הגדרה זו מספקת רמה גבוהה של גמישות בתכנון זרימות עבודה ניסיוניות ייעודיות ומאפשרת טיפול משולב בבעלי החיים בתחנות שונות, מה שמאפשר ניסויים בתפוקה גבוהה. השתמשנו בטכניקה זו להעברת סמים מוצלחת בקסנוגרפטים של עכברים של גליומה ברמה גבוהה כגון גליומה דו-קוית מפוזרת.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק luer-lock</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309628</td><td>פלסטיפאק</td></tr><tr><td>19 גרם מחט</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>23 G מחט</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M סרט כירורגי Transpore מדע</td><td>מיושם על חיים</td><td>7000032707</td><td>או דומה</td></tr><tr><td>מחולל צורות גל שרירותי</td><td>Siglent</td><td>n.a.SDG1025</td><td>, 25 מגה-הרץ, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>סטריאוטאקט אוטומטי</td><td>נבנה בבית</td><td>n.a.Stereotact</td> <td>עם כל האלמנטים נבנו בבית</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.כולל</td> <td>תוכנה</td></tr><tr><td>Buffered NaCl solution</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride</td><td>Indivior UK מוגבל</td><td>n.a.0.324</td> <td>מ"ג</td></tr><tr><td>העשרה בכלוב: עיסת נייר בית חכם</td><td>שירותי ביו</td><td>n.a.מסנן</td><td></td></tr> <tr><td>פחמן</td><td>ביקפורד</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>כף קרמיקה</td><td>n.a.a.צמר</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>גפן</td> n.a.n.a.D-לוציפרין<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, מלח אשלגן</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VUmc בית מרקחת</td><td>n.a.70</td><td>%</td></tr><tr><td>אוונס בלו</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0.9%</td> <td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.NaCl</td> <td>0.9%, 1000 מ"ל</td></tr><tr><td>היסטואקריל</td><td>בראון כירורגי</td><td>n.a.Histoacryl</td> <td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>הידרופון</td><td>אקוסטיקה מדויקת</td><td>n.a.מזרק</td><td></td></tr> <tr><td>אינסולין</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>324825/324826</td><td>0.5 מ"ל ו-0.3 מ"ל</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 מ"ל</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>אלפסן</td><td>n.a.10%,</td> <td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>מזון עכברים: Teklad גלובלית 18% חלבון דיאטת מכרסמים</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>קטטר ניאופלון</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>391349</td><td>26 GA 0.6 x 19 מ"מ</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>טכנולוגיות Keysight</td><td>n.a.InfiniiVision</td> <td>DSOX024A</td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>210261</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>מגבר כוח אלקטרוניקה</td><td>& חדשנות בע"מ</td><td>210L</td><td>דגם 210L</td></tr><tr><td>קדם מגבר DC מצמד</td><td>אקוסטיקה מדויקת</td><td>n..</td><td>מספר סידורי: DCPS94</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>או דומה</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.2</td><td>%</td></tr> <tr><td>SonoVue microbubbles</td><td>Bracco</td><td>n.a.8</td> <td>&micro; l/ml</td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.1000</td> <td>mL</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>n.a.n.a.a.ניתן</td><td></td> <td>להשתמש במזרקים שונים</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK מוגבל</td> <td>n.a.0.3 mg/ml</td><td></td></tr> <tr><td>מתמר</td><td>אקוסטיקה מדויקת</td><td>n.a.1</td> <td>MHz</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>או</td></tr><tr><td>ג'ל אולטרסאונד</td> דומה<td>מעבדות פרקר בע"מ</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic gel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.a.10</td> <td>גרם</td></tr></tbody></table>

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

מחסום הדם - מוח (BBB) היה משוכה גדולה לטיפול במחלות מוח שונות. תאי אנדותל, המחוברים באמצעות צמתים הדוקים, יוצרים מחסום פיזיולוגי המונע ממולקולות גדולות (>500 Da) להיכנס לרקמת המוח. אולטרסאונד ממוקד בתיווך Microbubble (FUS) יכול לשמש כדי לגרום לפתיחת BBB מקומית חולפת, המאפשרת לתרופות גדולות יותר להיכנס לפרנצ'ימה במוח.
בנוסף למכשירים קליניים בקנה מידה גדול לתרגום קליני, מחקר פרה-קליני להערכת תגובה טיפולית של מועמדים לתרופות דורש הגדרות ייעודיות של אולטרסאונד לבעלי חיים קטנים לפתיחת BBB ממוקדת. רצוי, מערכות אלה מאפשרות זרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה הן עם דיוק מרחבי גבוה והן עם ניטור משולב של cavitation, ועדיין להיות חסכוני הן בהשקעה הראשונית והן בעלויות התפעול.
כאן, אנו מציגים ביולומינציה ורנטגן מונחה מערכת FUS בעלי חיים קטנים סטראוטקטיים המבוססת על רכיבים זמינים מסחרית וממלאת את הדרישות הנ"ל. דגש מיוחד הושם על רמה גבוהה של אוטומציה המאפשרת את האתגרים בדרך כלל נתקל במחקרים בנפח גבוה להערכת תרופות פרה-קוליניות. דוגמאות לאתגרים אלה הן הצורך בתקינה על מנת להבטיח שחזור נתונים, להפחית את השונות הפנים-קבוצתית, להקטין את גודל המדגם ובכך לעמוד בדרישות אתיות ולהפחית עומס עבודה מיותר. מערכת BBB המוצעת אומתה בהיקף של BBB פתיחת ניסויים אספקת תרופות הקלה על מודלים קסנוגרפט שמקורם בחולה של גליובלסטומה multiforme ו glioma קו בינוני מפוזר.

מערכת FUS המתוארת (איור 1 ואיור 2) וזרימת העבודה המשויכת שימשו ביותר מ-100 בעלי חיים והפיקו נתונים הניתנים לשחזור הן על עכברים בריאים והן על עכברים הנושאים גידולים. בהתבסס על cavitation נרשם ואת הצפיפות הספקטרלית בהרמוניה ברגע השיא של הזרקת בולוס microbubble, הכוח הספקטרלי של כל תדר ניתן לחשב באמצעות ניתוח פורייה כפי שהוסבר בשלב 4 של הפרוטוקול. בהתבסס על הפרוטוקול האקוסטי (1 מגה-הרץ, משך פעימה של 10 אלפיות השנייה) עם MI של 0.4 בשילוב עם microbubbles, ספקטרום הכו...

מחסום הדם - מוח (BBB) יכול להיות משובש באופן זמני עם אולטרסאונד ממוקד microbubble בתיווך (FUS). כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לפתיחת BBB בתפוקה גבוהה ב vivo באמצעות מערכת FUS מודולרית נגישה למומחים שאינם אולטרסאונד.

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

גליומות בדרגה גבוהה כגון גליומה פונטינית פנימית מפוזרת הן גידולים פולשניים ביותר עם תמותה גבוהה. למרות שנים של מחקר מקיף, מחסום הדם-מוח הוא היבט חשוב מכיוון שכימותרפיה אינה מסוגלת להגיע ביעילות למוח. למרבה המזל, אולטרסאונד ממוקד מסוגל לפתוח באופן זמני ומקומי את מחסום הדם-מוח לטיפולים יעילים.פיתחנו מערכת אולטרסאונד ממוקדת קטנה וחסכונית לשיבוש מחסום הדם-מוח. מערכת זו בנויה עם רכיבים זמינים מסחרית ועם רמה גבוהה של אוטומציה, היא מאפשרת מחקרי הערכת תרופות פרה-קליניים. רפואה מדויקת מוגדרת כתרופה הנכונה במינון הנכון לחולה הנכון בזמן הנכון.כדי להשיג זאת, יש לבדוק תרופות רבות שנבחרו מראש. מערכת האולטרסאונד הממוקדת הקומפקטית שלנו לתפוקה גבוהה לשיבוש מחסום הדם-מוח מאפשרת לנו לעשות בדיוק את זה. ידגימו את ההליך ריאן האומן ואלווין טי הארט, שני דוקטורנטים מקבוצת המחקר שלי.זרימת העבודה עבור אולטרסאונד ממוקד ניווט נוירולוגי סטריאוטקטי מונחה תמונה כוללת הדמיה התערבותית וצימוד אקוסטי לסונופורציה בפלטפורמת האולטרסאונד. לאחר מכן, ניתן לבצע הדמיית מעקב. בחר מתמר מתאים על פי דרישות הניסוי המתוכנן.הנח אותו בקונוס מודפס בתלת מימד מלא במים נטולי גז וסגור בתחתיתו עם קרום מיילר שקוף אקוסטית. חבר את המתמר למחולל פונקציות ולכוח ampחיים יותר. התקן את המתמר על שלב ליניארי ממונע למיקום אנכי אוטומטי וחבר אותו למגבר ההספק.השתמש בפלטפורמה סטריאוטקטית ניתנת להסרה הכוללת חימום מווסת טמפרטורה, מוטות נשיכה ואוזניים, הרדמה וסמני נאמנות רב-מודאליים. חבר את הפלטפורמה לשלב הליניארי הדו-ממדי. לפני שניתן יהיה להשתמש במערכת FUS, כייל אותה וקבע את נקודת המיקוד של המתמר.נקודת המיקוד תואמת את המיקום האנכי של החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית. התאקלמו במתקן לפחות שבוע לאחר הגעתם ושקלו אותו באופן קבוע. ביום הניסוי יש לתת בופרנורפין בזריקה תת עורית 30 דקות לפני הטיפול ב-FUS.לאחר הרדמת העכבר, יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בעיניים. במידת הצורך, הסר את השיער בחלק העליון של ראש החיה בעזרת סכין גילוח וקרם אפילציה. שטפו את העור במים כדי להסיר שאריות.לניסויים במודלים של גידול BLI, יש להזריק 150 מיקרוליטר של D-luciferin תוך צפקי עם מזרק אינסולין בגודל 29. למתן מיקרו-בועות לפתיחת BBB, הכנס קטטר וריד זנב בגודל 26 עד 30 ושטוף את הווריד בנפח קטן של תמיסת הפרין. אבטח את הקטטר עם סרט טישו כדי למנוע ניתוק.אם הצנתור הצליח, מלאו את הקטטר בתמיסת הפרין כדי למנוע קרישת דם. הנח את החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית המווסתת את הטמפרטורה כדי למנוע היפותרמיה. תקן את ראש החיה באמצעות מוט נשיכה ומוטות אוזניים והדביק את הזנב והצנתר לפלטפורמה.תקן את גוף העכבר בעזרת רצועה. מקם את הפלטפורמה הסטריאוטקטית עם העכבר המותקן בשיטת ההדמיה וצלם תמונות של החיה. קבע אם החיה ממוקמת נכון על הרציף.סמן את מיקום החיה באמצעות סמני הנאמנות הרב-מודאליים בשילוב עם צינור עיבוד התמונה בהתאם לנקודת המיקוד של המתמר. קבע את אזור המטרה על ידי הצבת מתאר מוחי מעל תמונת הרנטגן הנרכשת או על ידי שימוש בתמונות BLI כדי לקבוע את מרכז הגידול. לפני מיקום המתמר, הגן על הנחיריים והפה של החיה באמצעות סרט כדי למנוע מג'ל אולטרסאונד להפריע לנשימה.מרחו ג'ל אולטרסאונד על גבי ראש העכבר להולכת קול תקינה. הקלט קוויטציה של מיקרו-בועות עם הידרופון המחט, הממוקם בסביבה הישירה של העצם העורפית. בהתבסס על ערכי הכיול, הנח את המתמר למיקום הנכון מעל החיה.החילו הגדרות מוגדרות מראש על כל המכשירים המחוברים כדי להתמקד באזור המוח המעניין. לאחר הצבת המתמר במיקום הנכון, ממיסים והפעל את המיקרו-בועות כמתואר על ידי היצרן. לפני הזרקת מיקרו-בועות, שטוף את קטטר וריד הזנב במי מלח כדי לאשר גישה לווריד הזנב.התחל את מסלול הסוניקציה והזריק בו זמנית את המיקרו-בועות. במקביל, הידרופון המחט יזהה ויאמת קוויטציה של מיקרו-בועות בזמן אמת. אם תרצה, יש לתת חומר ניגוד תוך-וסקולרי או תרופה לאחר סונופורציה.עקוב אחר החיה עד לנקודת זמן שנקבעה מראש. לחץ אקוסטי עם אינדקס מכני של 0.4 בשילוב עם מיקרו-בועות סיפק אמצעי רגיש ואמין מאוד לזיהוי קוויטציה יציבה בהשוואה לאי זיהוי תת-הרמוניות כאשר לא הוזרקו מיקרו-בועות או תצפית על קוויטציה אינרציאלית כאשר הופעל MI של 0.6. בעוד שלחץ אקוסטי עם MI של עד 0.6 לא הביא לנזק מקרוסקופי, נזק מיקרוסקופי הוכח היסטולוגית ב-MI של 0.6.משרעת לחץ עם MI של 0.8 הביאה לדימום מוחי מקרוסקופי של כלי דם גדולים יותר וליזיס רקמות נרחב עם אקסטרוואזציה של אריתרוציטים. אוונס כחול תוך ורידי הוזרק כדי לאמת את פתיחת ה-BBB באזור הפונטין. אקסטרוואזציה של אלבומין מצומד כחול של אוונס נצפתה ברמת הפונס והמוח הקטן בעכבר שטופל ב-FUS ומיקרו-בועות המדגימות מיקוד מדויק של אזור העניין.השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הם המיקום הנכון של קטטר וריד הזנב, מיקום ומיקוד החיה, והזרקת מיקרו-בועות עם אולטרסאונד ממוקד עם זיהוי קוויטציה. מערכת אולטרסאונד ממוקדת מתוצרת עצמית זו ניתנת להתאמה ולעיצוב מחדש לשאלות מחקר מרובות, זאת תוך היותה חסכונית ובעלת זרימת עבודה אוטומטית, מה שהופך אותה למתאימה לחוקרים חסרי ניסיון יחסית.

a-high-throughput-image-guided-stereotactic-neuronavigation-focused

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Microbubble בתיווך הפרעה אולטרסאונד ממוקד של מחסום דם מוח (BBB) ​​היא טכניקה מבטיחה למסירה פולשני התרופה ממוקדת...

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

סרטון זה מתאר שיטה לשיבוש זמני של מחסום הדם-מוח (BBB) על ידי יצירת פתחים חולפים באמצעות אולטרסאונד ממוקד בתיווך מיקרו-בועות (FUS). פתחי BBB מקומיים ארעיים אלה יכולים בסופו של דבר לשמש להעברת מולקולות תרופה גדולות יותר ישירות לתוך פרנכימה במוח.

מיקוד מבוסס אולטרסאונד מיקרו-בועות בתיווך מחסום דם-מוח: טכניקה ליצירת פתחים ארעיים מקומיים במחסום דם-מוח של עכבר על ידי סונופורציה

אולטרסאונד ממוקד עם סוכני microbubble יכול לפתוח את מחסום הדם מוח מוקדי חולף. טכניקה זו שימשה כדי לספק מגוון רחב של סוכנים על פני מחסום הדם מוח. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור מסירה מקומית למוח מכרסמים עם או בלי הדרכה MRI.

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.

אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

מחקר זה מתאר הדמיית תהודה מגנטית משולבת (MRI) ופרוטוקול אולטרסאונד ממוקד פועם בעוצמה נמוכה (FUS), תוך שימוש בחולדות חיות עם צנתור וריד צוואר כדי לנטר את פתיחת מחסום הדם-מוח (BBB).

ניטור פתיחת מחסום דם-מוח בחולדות באמצעות מערכת אולטרסאונד ממוקדת פרה-קלינית

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

בדו"ח זה, אנו מציעים מערכת אוטומטי לחלוטין תכליתי מאוד המסוגל בו זמנית בדיקות רב קוגניטיביים התנהגויות ורישום הפעילות העצבית של מכרסמים.

מערכת אוטומטי לחלוטין תכליתי מאוד עבור בדיקת ריבוי פונקציות קוגניטיביות ורישום פעילות עצבית במכרסמים

הטכניקה מתוארת בהרחבה על פתיחת מחסום דם מוח של עכבר באמצעות microbubbles ו אולטרסאונד. באמצעות טכניקה זו, מנגן יכול להינתן למוח עכבר. כי הוא מנגן חומר ניגוד MRI שמצטבר בנוירונים depolarized, גישה זו מאפשרת הדמיה של הפעילות העצבית.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

למד שיטה לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים באמצעות אולטרסאונד ממוקד ומיקרובועות. הפרוטוקול מאפשר מסירת תרופות יעילה לטיפול בגליומות ומחלות מערכת העצבים המרכזית.

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

גלה סרטונים נוספים