Name: ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למדו שיטת הזרקת וריד זנב לרוחב לניתוח גרורות ריאתיות בסרטן שד באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלי. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ויעיל של נטל הגידולים הריאתיים במחקר מטסטזות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הנתונים הייצוגית מומנו באמצעות המכון הלאומי לסרטן (K22CA218549 ל- S.T.S). בנוסף לסיועם בפיתוח שיטת הניתוח המקיפה המדווחת כאן, אנו מודים למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת אוהיו ולמשאב המשותף של פנוטיפינג עכבר (מנהל – קריסטה לה פרל, DVM, PhD) על שירותי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה ולליבת ההדמיה הפתולוגית לפיתוח וניתוח אלגוריתמים.

השימוש בבעלי חיים פעל על פי תקנות משאבי בעלי חיים של המעבדה האוניברסיטאית (ULAR) במסגרת הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC)-שאושרה פרוטוקול 2007A0120-R4 (PI: ד"ר ג'ינה סייזמור).
1. הזרקת וריד זנב של תאים סרטניים בשד
<ol><li>הכנת תאים ומזרק להזרקה<ol>
<li>צלחת מספר מתאים של תאים בהתבסס על מספר העכברים וריכוז התאים שיש להשתמש בהם. הערה: מספר התאים המוזרקים והזמן להתפתחות גרורות יהיו תלויים בקו התא המשמש ויהיה צורך למטב אותו. בהדגמה זו, 1 x 106 תאי מד"א-MB-231 מוזרקים תוך ורידי לתוך NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) עכברים, ונגעים ריאות מקרוסקופיים נצפים לא יאוחר מ 24 ימים לאחר הזרקה. עבור קו תא הגידול mVT1 מורין mammary17, 3 x 106 תאים מוזרקים לעכברי FVB / N המוכשרים למערכת החיסון עם גרורות ריאות רבות שנצפו על ידי 14 ימים22,23.</li>
		<li>שאפו מדיה ושטפו לוחות תאים עם PBS 1x. Trypsinize תאים בנפח מינימלי, הוסף נפח מדיה מתאים וספור תאים באמצעות המטוציטומימטר או שיטה מועדפת אחרת. ניתן להשתמש בכחול טריפן (0.4%) או בצבעים אחרים של תאים חיים/מתים כדי לקבוע ספירת תאים בת קיימא.</li>
		<li>כדורי תאים על ידי ספינינג ב 180 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend מספר מתאים של תאים סטרילי 1x PBS כך נפח של 100 μL מוזרק לכל עכבר. שמור על השעיית תא על קרח כדי לשמור על הכדאיות.</li>
		<li>לפני ההזרקה, ביסודיות resuspend תאים עם 200 μL או 1 מ"ל pipette כדי למנוע גושים. צייר 100 μL במזרק אינסולין 28 גרם (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לחסל את כל בועות האוויר על ידי שמירה על המזרק אנכי, הקשה על המזרק, ולאט לאט להתאים את הבוכנה. הזרקת בועות אוויר לווריד עלולה לגרום לתסחיף אוויר/גז שעלול להיות קטלני.</li>
	</ol></li>
	<li>הזרקת וריד זנב לרוחב הערה: לבדיקות גרורות ניסיוניות של סרטן השד, זריקות מבוצעות על > 6 שבועות עכברים נשיים.<ol>
<li>טפל בעכבר בזנב והחלק את החיה לתוך צינור מחורץ / התקן ריסון בגודל מתאים (עיין בטבלת החומרים עבור התקן איפוק המשמש).</li>
		<li>הכנס את חלק התקע של התקן האיפוק והצב את העכבר על צידו כך שווריד הזנב הצדדי שלו יהיה קל לצפייה. לעכבר עורק גחון בהתאם לאיבר המין, וריד גפי ושני ורידים לרוחב.</li>
		<li>נקה את פני השטח של זנב העכבר עם ניגוב אספטי. תפוס את הזנב בין האצבע והאגודל ביד לא דומיננטית והחל מתח קל.</li>
		<li>החל בחלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט במקביל לווריד עם שיפוע בסופו של דבר.</li>
		<li>אם מותר, בזהירות לסכם את המחט ולהתכופף לזווית של 20-30°. מומלץ מאוד לגשת לבד או להתקן סיכום מחטים. הערה: אין צורך לשאוף כמו זה עלול לגרום לווריד לקרוס. עם זאת, הבזק קטן של דם ניתן לראות כאשר הוצב לראשונה. המחט תתקדם בצורה חלקה לתוך הווריד עם מיקום נכון.</li>
		<li>לאט לאט לחלק את הנפח המלא לתוך הווריד. לא צריכה להיות התנגדות כאשר הבוכנה נדחפת.</li>
		<li>אם כל התנגדות מורגשת, מיד להסיר את מחט המזרק. במידת הצורך, הכנס מחדש את המחט (באופן אידיאלי לא יותר מ 3 ניסיונות) נע לכיוון הקצה הפרוקסימלי של הזנב או וריד לרוחב מנוגד.</li>
		<li>סביר להניח שנפח קטן של דם ייעקר לאחר ההזרקה. יש למרוח לחץ עדין עם גזה סטרילית ולנגב עם מגבון אספטי.</li>
		<li>יש להיפטר מיד ממזרק במיכל חדות מתאים.</li>
		<li>החזר את העכבר לכלוב נקי ומאוורר ופקח על סימני מצוקה.</li>
		<li>לפקח על עכברים 2-3x/שבועי לסימנים של היווצרות גרורות (נשימה מאומצת, יציבה כפופה, ירידה במשקל) ומצוקה כללית. הזמן להתפתחות גרורות יהיה תלוי קו התא ומתח העכבר.</li>
		<li>אם משתמשים במכשיר הדמיה חיה חיה של in vivo, עכברי תמונה מיד לאחר הזרקת וריד הזנב כדי לאשר הזרקה מוצלחת של תאים ולקבל נתוני זמן "אפס" (פרטים ספציפיים על הדמיית ביולומינציה של vivo אינם כלולים כאן, אלא מתוארים על ידי יאנג ואח '24).</li>
	</ol></li>
</ol>2. קיבוע רקמת ריאה וניתוח נטל גידול ריאות גרורתי
<ol><li>אינפלציית רקמת ריאה כדי לשמור על הפורמט המבני של הריאות עבור היסטופתולוגיה<ol>
<li>לאחר נהלי המתת חסד מאושרים (למשל פחמן דו חמצני ב 30 - 70% תזוזה של נפח התא / דקה) הם אחריו, לאבטח את פגר העכבר ללוח ניתוח עם סיכות. או לרסס או להחיל 70% אתנול כדי לשמור על פרוות העכבר מהדרך במהלך הניתוח. הערה: חנק דו תחמוצת הפחמן יכול לגרום לדימום ריאתי כמו נגע רקע צפוי, במיוחד בקצבי זרימה איטיים יותר.</li>
		<li>פתחו את בית החזה עם חתך בקו האמצע, הרחיבו את החתך באופן קרני/קאודלי דרך הציפק, וחתכו את הסרעפת על ידי אחיזת תהליך הקסיפיד.</li>
		<li>באמצעות קבוצה נפרדת של מספריים כדי לא לעמעם את הלהבים, לחתוך את הצלעות לאורך כל צד של בעצם החזה ולהסיר בזהירות כלוב צלעות משאיר מקום לריאות להתרחב.</li>
		<li>לבודד את קנה הנשימה על ידי הסרת בלוטות רוק תת-קרקעיות ושרירים אינפרהיואידים. הצבת סיכות משני צדי קנה הנשימה יכולה למנוע תנועה לא רצויה במהלך החדרת מחט.</li>
		<li>מלא מזרק 26 G עם 2-3 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי ולהכניס לתוך קנה הנשימה.</li>
		<li>לאט להזריק פורמלין ולצפות הריאות להתרחב (בדרך כלל דורש ~ 1.5 מ"ל של פורמלין).</li>
		<li>ברגע שפורמלין מתחיל לדלוף מהריאות (הימנעו מאינפלציה יתר), צבוטו את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים, הסירו מחט מזרק וניתקו את כל מערכת הנשימה. מניחים ריאות, לב וכו 'ישירות לתוך פורמלין כמו גיזום נוסף של רקמות יכול להיעשות לאחר קיבעון.</li>
		<li>עיבוד מלא, הטבעה, חתך של רקמות, המטוקסילין ו- eosin (H&E) מכתימים בשיטות סטנדרטיות.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי<ol>
<li>סרוק מקטעי ריאות מוכתמים H&E בסורק שקופיות ברזולוציה גבוהה בהגדלה של פי 40 (איור 3).</li>
		<li>יבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונה (לדוגמה, Visiopharm Image Analysis) לכימות גרורות ריאות. הערה: אנו ממליצים למשתמשים חדשים לקבל הדרכה באתר או באינטרנט כדי להשתמש בתוכנת ניתוח התמונות. סמינרים מקוונים רבים זמינים גם דרך דף האינטרנט המסחרי.</li>
		<li>בחר את אפליקציית גרורות הריאות של Visiopharm 10118 מתוך ספריית היישומים של התוכנה. הערה: מטרת אפליקציה זו היא לתייג ולכומת גרורות ריאות בשקופיות מוכתמות ב- H&E. כחלק מאפליקציית גרורות הריאות H&E 10118, שלב עיבוד התמונה הראשון מפלח את רקמת הריאה באמצעות אפליקציית זיהוי הרקמות. שלב עיבוד התמונה השני משתמש ביישום זיהוי גרורות המזהה את גרורות בתוך רקמת הריאה. גרורות מזוהות באמצעות צורה יחד עם אזורים שהם מעוותים מדי, אדומים מדי או דלילים מדי לזיהוי כגרורות.</li>
		<li>התאם את הפרמטרים המגדירים צורה ודלילות כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לתמונות מייצגות. אזורים מקוטעים של גרורות גידול ורקמת ריאה רגילה ניתן להציג באמצעות תוויות צבע שונות עבור כל סוג רקמה. הערה: במקרה שהאפליקציה אינה יכולה להפריד במדויק גרורות מרקמת ריאה רגילה, ייתכן שיהיה צורך לכתוב אפליקציה מותאמת אישית המשתמשת בתוכנית Visiopharm Decision Forest כפי שנעשה עבור הניסויים (ראה איור 2 ואיור 3). להלן פרטים לכתיבת אלגוריתם מותאם אישית. אחרת, המשך לשלב 2.2.9.</li>
		<li>פתח את תוכנית יער ההחלטות, הפועלת על ידי אימון שיעורים מרובים [כלומר, רקמת ריאה (לא ניאופלאסטית), גרורות, תאי דם אדומים, אפיתל ו/או חלל לבן] על תמונה רצויה. באיור 2, גרורות הגידול הן כחולות, רקמה רגילה ירוקה ואפיתל הסימפונות צהוב. כמו כן, תאי דם אדומים נמצאים בחללים אדומים ואוויר בוורוד.</li>
		<li>בצע את הסדרה המתבקשת של שאלות כן או לא כדי לאמן כראוי כל כיתה לתמונה. הדיוק של האלגוריתם יקבע את מספר שאלות כן/לא. לצורך הניתוח, האלגוריתם/האפליקציה המותאמים אישית נכתבו בדיוק מוגדר ל- 50 (טווח 0-100).</li>
		<li>התאם תכונות עבור כל מחלקה על-ידי החלת מסננים כדי לחדד, לטשטש, למיין לפי צורה וכו' כדי לשפר את הדיוק של האלגוריתם/אפליקציה. Visiopharm מציג כל מחלקה דרך עדשות אחת או מרובות המכונות תכונות. התכונות משנות את האופן שבו הכיתה רואה את התמונה כדי להוציא צבעים או עוצמות מסוימים. הערה: עבור האלגוריתם המותאם אישית, גרורות מדידה 8500 μm2 ומעלה מסומנות ונמדדות כגרורות. זה מסביר את סטיית הגודל והגרורות קטנות מכדי לזהות. אזורים קטנים מעוותים ואזורים גרורתיים קטנים מתחת 8500 מיקרומטר 2 נכללו כימות הרקמה הרגיל.</li>
		<li>שמור את ההגדרות שהשתנו מהאפליקציה או מהאלגוריתם המותאם אישית ולאחר מכן, החל את האלגוריתם/אפליקציה על ערכה שלמה או סדרה של רקמות מוכתמות ב- H&E.</li>
		<li>לבסוף, יצא את כל משתני הפלט, הכוללים את משתני הפלט המפורטים בטבלה 1. שטח במיקרונים בריבוע (μm2) ניתן לכמת עבור כל סוג רקמה ואחוזים נגזרים מדגם שטח רקמה נטו הכולל (כלומר, רקמה כוללת פחות שטח אוויר).</li>
		<li>בעת יצירת אלגוריתם מותאם אישית, סקור סימוני רקמות בהתייעצות עם לוח פתולוגים וטרינריים המאושר על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים כדי להבטיח מדידות מדויקות ולהבדיל בין סוגי רקמות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting metastasis.</a> Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).</li>
<li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li>
<li>Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+discovery+and+development+of+therapies+for+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).</li>
<li>Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+metastasis%3A+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of metastasis: progress and prospects.</a> Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Schoenenberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+c-myc+gene+expression+in+mammary+glands+of+transgenic+mice+induces+mammary+tumours+with+constitutive+milk+protein+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription.</a> EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).</li>
<li>Nusse, R., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+tumors+induced+by+the+mouse+mammary+tumor+virus+contain+a+provirus+integrated+in+the+same+region+of+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome.</a> Cell. 31 (1), 99-109 (1982).</li>
<li>Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+induction+of+mammary+adenocarcinoma+in+transgenic+mice+bearing+the+activated+c-neu+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene.</a> Cell. 54 (1), 105-115 (1988).</li>
<li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li>
<li>Green, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C3%281%29%2FSV40+T-antigen+transgenic+mouse+model+of+mammary+cancer%3A+ductal+epithelial+cell+targeting+with+multistage+progression+to+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma.</a> Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).</li>
<li>Iorns, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse+model+for+the+study+of+human+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis.</a> PloS One. 7 (10), 47995(2012).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+Number+of+Women+Living+with+Metastatic+Breast+Cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+survival+outcomes+in+patients+with+breast+cancer+and+lung+metastasis%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).</li>
<li>Smid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+breast+cancer+show+preferential+site+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse.</a> Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Soni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+subtypes+predispose+the+site+of+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases.</a> American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).</li>
<li>Leone, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+impact+of+metastatic+pattern+in+stage+IV+breast+cancer+at+initial+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).</li>
<li>Pei, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant-cell+culture+of+primary+mammary+tumors+from+MMTV-c-Myc+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology%3A+Animal%22%5BJournal%5D)">Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).</li>
<li>Mathsyaraja, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF1-ETS2-induced+microRNA+in+myeloid+cells+promote+metastatic+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth.</a> Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>La Perle, K. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Pathologists%3A+Ultimate+Control+Freaks+Seeking+Validation%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation.</a> Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).</li>
<li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+of+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+immune+system+in+cancer%3A+from+tumor+initiation+to+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression.</a> Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).</li>
<li>Borowsky, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+mouse+mammary+carcinoma+cell+lines%3A+two+closely+related+cell+lines+with+divergent+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+mouse+allograft+models+for+development+of+therapies+to+target+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis.</a> Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).</li>
<li>Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+tail-vein+injection+in+mice+using+a+modified+anaesthesia+induction+chamber+versus+a+common+restrainer+without+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia.</a> Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+for+treating+brain+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer.</a> Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).</li>
<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ככל שהחוקרים ממשיכים להשתמש בהזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים כמודל ניסיוני לגרורות, חסרים פרקטיקות סטנדרטיות לניתוח נטל הגידול גרורתי שנוצר. במקרים מסוימים, הבדלים משמעותיים בנטל הגידול גרורתי על מניפולציה של קווי תאים מסוימים ו /או שימוש בתרכובות כימיות ניתן לראות מקרוסקופית. עם זאת, במקרים אחרים, הבדלים עדינים זריעה גרורתית וצמיחה ניתן להתעלם או לפרש לא נכון ללא ניתוח פתולוגי יסודי. מחקר זה מקדם פרוטוקולי הזרקת ורידים זנב שפורסמו בעבר על ידי הכללת שיטה מקיפה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי. חשוב לציין, שיטה זו של ניתוח...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

למרות היותו תהליך מורכב מאוד ולא יעיל1, גרורות הוא תורם משמעותי לתחלואה ותמותה של חולי סרטן2. למעשה, רוב מקרי המוות הקשורים לסרטן מיוחסים להתפשטות גרורתית של מחלות3,4. על מנת שתאי הגידול יצאו גרורות בהצלחה, עליהם להתנתק מהאתר הראשי, לפלוש דרך סטרומה סמוכה, לחדור למחזור הדם או ללימפטיקה, לנסוע למיטה נימית של אתר משני, להזרים לרקמה המשנית, ולהתרבות או לגדול כדי ליצור נגעים גרורתיים5. השימוש במודלים של עכברים היה קריטי לקידום ההבנה של המנגנונים המולקולריים האחראים על זריעה גרורתית וצמיחה6,7. כאן, אנו מתמקדים גרורות סרטן השד, אשר הן מודלים עכבר מהונדסים גנטית, כמו גם שיטות השתלה משמשים לעתים קרובות – כל אחד עם סט משלהם של יתרונות ומגבלות.
מודלים של גידולי החלב מהונדסים גנטית עושים שימוש ביזמים ספציפיים לבלוטת החלב, כולל MMTV-LTR (חוזרים על טרמינל ארוך של וירוס החלב של העכבר) ו- WAP (חלבון חומצי מי גבינה), כדי להניע ביטוי של טרנסג'נים באפיתל החלב8. אונקוגנס כולל אנטיגן T בינוני פוליומה (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1, ווירוס simian 40 (SV40) באו לידי ביטוי באופן זה9,10,11,12,13, ובעוד מודלים גנטיים אלה שימושיים לחקר חניכת גידול ראשוני והתקדמות, מעטים בקלות גרורות לאיברים רחוקים. יתר על כן, מודלים אלה של עכבר גנטי הם לעתים קרובות יותר זמן ועלות אוסרת מאשר מודלים גרורות ספונטניות או ניסיוניות. בהתחשב בהגבלתם של רוב המודלים של גידולי האם מהונדסים גנטית לחקר גרורות, טכניקות השתלה הפכו לשיטות אטרקטיביות לחקר תהליך מורכב זה. זה כולל אורתוטופיה, וריד זנב, תוך לב, הזרקה תוך גולגולתית של קווי תאים מתאימים.
למרות מספר שורות תא סרטן השד בקלות גרורות בעקבות הזרקה אורתוטופית לתוך כרית שומן חלב14,15, עקביות ושחזור של נטל הגידול גרורתי יכול להיות אתגר, ואת משך המחקרים האלה יכול להיות בסדר של מספר חודשים. להערכת גרורות ריאות, בפרט, הזרקה תוך ורידי לתוך הווריד הזנב היא לעתים קרובות שיטה לשחזור ויעילה יותר עם התפשטות גרורתית המתרחשת בדרך כלל בתוך טווח של כמה שבועות. עם זאת, מאז מודל הזרקה תוך ורידי עוקף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי, יש לנקוט זהירות בפירוש התוצאות של מחקרים אלה. בהדגמה זו, אנו מראים הזרקת וריד זנב של תאי גידול מאמרי יחד עם שיטת ניתוח מדויקת ומקיפה.
למרות שקהילת המחקר התקדמה משמעותית בהבנת התהליך המורכב של גרורות סרטן השד, ההערכה היא כי מעל 150,000 נשים יש כיום סרטן שד גרורתי16. מתוך אלה עם סרטן השד בשלב IV, >36% מהחולים יש גרורות ריאות17; עם זאת, התבנית הספציפית לאתר והשכיחות של גרורות יכולות להשתנות בהתאם לתת-סוג מולקולרי18,19,20,21. חולים עם גרורות ריאות הקשורות לסרטן השד יש הישרדות חציונית של רק 21 חודשים המדגיש את הצורך לזהות טיפולים יעילים סמנים ביולוגיים חדשניים עבור מחלה זו17. השימוש במודלים גרורתיים ניסיוניים, כולל הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים, ימשיך לקדם את הידע שלנו על אתגר קליני חשוב זה. בשילוב עם פתולוגיה הדמיה דיגיטלית ואת השיטה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי המתואר בפרוטוקול זה, זריקות וריד זנב הם כלי רב ערך לחקר גרורות סרטן השד.

<table><tbody><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-750</td><td><חזק>לניקוי זנב לפני הזרקה</מספריים חזקים></td></tr><tr><td>דיסקציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-951-5</td><td><חזק>לדיסקציה של עכבר וניפוח רקמת ריאה</חזק></td></tr><tr><td>DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT10013CV</td><td>בסיס מדיה לתרבית תאים עבור קווי תאים MDA-MB-231 ו-MVT1</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>המשמשת להשעיית תאי גידול להזרקת</td></tr><tr><td>אתנול (תמיסה של 70%)</td> <td>OSU</td><td></td><td>המשמש למזעור פרוות העכבר במהלך הדיסקציה; היזהר - צבע כחול דליק</td></tr><tr><td>של אוון</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>משמש ב-1% ב-PBS סטרילי לתרגול בשיטת הזרקת וריד זנב; היזהר - מגיב מסוכן</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>תוסף מדיה לתרבית תאים; משמש ב-10% במלקחיים DMEM</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-270</td><td>לדיסקציה וניפוח רקמות ריאה</td></tr><tr><td>עכברי FVB/NJ</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>001800</td><td>זן עכבר סינגני לתאי MVT1</td></tr><tr><td>המציטומטר (Bright-Line)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>Z359629</td><td>לשימוש בתרבית תאים להשגת ספירת תאים</td></tr><tr><td>מזרק אינסולין (28 גרם)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-829-1B</td><td>להזרקות וריד זנב (BD 329424)</td></tr><tr><td>תאי MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td></td><td>קו תאי סרטן שד אנושי</td></tr><tr><td>MVT1 תאי</td><td></td><td></td><td>גידול עכבר מחטי תאי גידול חלב</td></tr><tr><td>(26 גרם)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-826-15</td><td>המשמש לניפוח העכבר ריאות</td></tr><tr><td>פורמלין ניטרלי בופר (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>משמש כמקבע רקמות ולניפוח רקמת ריאה; היזהר - מגיב מסוכן</td></tr><tr><td>NOD. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td></td><td>005557 מתוחזקת על ידי OSUCCC Target Validation Shared</td></tr><tr><td>Resource Penicillin Streptomycin 100x</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>15140163 תוסף מדיה לתרבית תאים גזה</td></tr><tr><td>סטרילית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9379092</td><td>למריחת לחץ על זנב העכבר אם מתרחש דימום</td></tr><tr><td>מזרק (5 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-955-458</td><td>משמש לניפוח רקמת ריאות של עכבר</td></tr><tr><td>מסנן וריד זנב</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>המשמש לריסון עכבר להזרקות וריד זנב</td></tr><tr><td>טריפן כחול (0.4%)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>משמש בתרבית תאים להערכת כדאיות</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0.25</td>% <td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td><td>משמש בתרבית תאים לניתוק תאי גידול מהצלחת</td></tr></tbody></table>

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

גרורות, הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה עבור רוב חולי הסרטן, יכול להיות מאתגר למודל פרה-אקליני בעכברים. מעט מודלים ספונטניים של גרורות זמינים. לכן, מודל גרורות ניסיוני מעורבים הזרקת וריד זנב של קווי תאים מתאימים הוא עמוד התווך של מחקר גרורות. כאשר תאים סרטניים מוזרקים לווריד הזנב לרוחב, הריאה היא האתר המועדף עליהם של קולוניזציה. מגבלה פוטנציאלית של טכניקה זו היא כימות מדויק של נטל גידול הריאות גרורתי. בעוד כמה חוקרים לספור macrometastases של גודל מוגדר מראש ו / או לכלול micrometastases בעקבות חתך של רקמות, אחרים קובעים את האזור של נגעים גרורתיים ביחס לאזור הרקמה הרגיל. שתי שיטות הכימות האלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר הנטל גרורתי גבוה. להלן, אנו מדגימים מודל הזרקה תוך ורידי של גרורות ריאות ואחריו שיטה מתקדמת לכימות נטל הגידול גרורתי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תהליך זה מאפשר לחקור פרמטרים מרובים של נקודת קצה, כולל גודל גרורות ממוצע, מספר גרורות כולל ואזור גרורות כולל, כדי לספק ניתוח מקיף. יתר על כן, שיטה זו נבדקה על ידי לוח פתולוג וטרינרי מוסמך על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים (SEK) כדי להבטיח דיוק.

אם משתמשים בתאים לא מתובלים להזרקת ורידים בזנב, ייתכן שיהיה קשה לאשר קולוניזציה של ריאות עד (1) זמן הנמק אם ניתן לצפות במקרומטסטאזים או (2) בעקבות ניתוח היסטולוגי אם קיימים גרורות מיקרוסקופיות. עם נטל גידול גרורתי נרחב בריאות, לעכברים תהיה נשימה מאומצת. כמו בכל מחקר גידול, עכברים צריכים להיות במעקב קפדני לאורך כל המחקר. השימוש בתאים מסומנים הוא דרך קלה לאשר הזרקת וריד זנב מוצלחת; מכאן השימוש בתאי מד"א-MB-231 מתויגים לוציפראז בהדגמה. עם זאת, בהדמיית vivo לא תמיד אפשרי או הכרחי בהתאם לעיצוב הניסיוני וגורמים אחרים. <strong ...

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

כיום אין תקן זהב לניתוח עומסי גידול ריאה גרורתי הנגרמת על ידי הזרקת וריד זנב. השתמשנו בניתוח תמונה דיגיטלי כדי לכמת באופן מדויק וניתן לשחזור גרורות ריאה בצורה יעילה ביותר. שיטה זו חסכונית בזמן ובעלות.ובשילוב עם ניתוח תמונה דיגיטלית, מאפשר ניתוח מדויק ומקיף ביותר של עומס הגידול הגרורתי בריאה שנוצר. כדי להכין תאי סרטן שד אנושיים להזרקה, ראשית, יש למקם מספר מתאים של תאים במדיום תרבית תאים מתאים, בהתבסס על מספר העכברים וריכוז התאים שיש להשתמש בהם. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80 עד 90%, שטפו את הצלחות עם PBS, ונתקו את התאים בנפח מינימלי של טריפסין, על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים.כאשר התאים התנתקו, השעו מחדש את התאים במדיום תרבית טרי לספירה, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים בריכוז המתאים ב-100 מיקרוליטר PBS לעכבר, על קרח. רגע לפני ההזרקה, השעו מחדש את התאים על הקרח כדי למנוע התגבשות והעמיסו 100 מיקרוליטר מהתאים למזרק אינסולין בגודל 28.שמור על המזרק אנכי, הקש על הפיר תוך כוונון איטי של הבוכנה כדי להסיר בועות. אם מותר, כסום בזהירות את המחט וכופף את קצה המחט לזווית של 20 עד 30 מעלות. רסנו עכבר נקבה בת יותר משישה שבועות במרסנת עכבר מפלסטיק ומקמו את העכבר על צדו כך שניתן יהיה לראות בקלות את וריד הזנב הצדדי שלו.אתר את עורק הגחון בקו אחד עם איברי המין, וריד גבי ושני ורידי זנב לרוחב, והשתמש במגבון אספטי כדי לנקות את משטח הזנב. אוחזים בזנב בין האצבע המורה לאגודל של היד הלא דומיננטית, מפעילים מתח קל, ומתחילים בחלק הדיסטלי של הזנב, מכניסים את המחט, הצד המשופע כלפי מעלה, במקביל לווריד. העבירו לאט את כל נפח התאים לווריד.סביר להניח שנפח קטן של דם ייעקר לאחר ההזרקה. הפעל לחץ עדין עם גזה סטרילית על מקום ההזרקה. לאחר מכן השליכו את המזרק למיכל חד מתאים, והניחו את העכבר בכלוב נקי ומאוורר עם ניטור.תוך לא יותר משעה מהזרקת וריד הזנב, בצע הדמיה חיה חיה in vivo כדי לאשר הזרקת תאים מוצלחת, ולקבל נתוני זמן אפס. כדי לשמור על הפורמט המבני של הריאות להיסטופתולוגיה, אבטח את העכבר ללוח חיתוך והרטיב את הפרווה עם 70% אתנול. פתח את בית החזה עם חתך בקו האמצע, האריך את החתך גולגולת וזנב דרך הצפק, ותפס את תהליך ה-xiphoid כדי לאפשר הסרת הסרעפת.בעזרת מספריים שני, חותכים את הצלעות לאורך כל צד של עצם החזה ומסירים בזהירות את כלוב הצלעות כדי להשאיר מקום לריאות להתרחב. כדי לבודד את קנה הנשימה, הסר את בלוטות הרוק התת-לסתית ואת השרירים האינפרהואידים, והנח סיכות משני צידי קנה הנשימה כדי למנוע תנועה לא רצויה במהלך החדרת המחט. טען מזרק של שלושה מיליליטר, מצויד במחט בגודל 26, עם שניים עד שלושה מיליליטר של פורמלין ניטרלי של 10%, והכנס את המחט לקנה הנשימה.הזרקו לאט את הפורמלין, תוך צפייה בהתרחבות הריאות. ברגע שהפורמלין מתחיל לדלוף מהריאות, השתמש במלקחיים כדי לצבוט את קנה הנשימה ולהסיר את המחט. לאחר מכן נתק את כל מנגנון הנשימה והנח את האיברים ישירות למיכל של פורמלין טרי.לניתוח העומס של גידול ריאה גרורתי, סרוק קטעי רקמת ריאה מוכתמים של H&E בסורק שקופיות ברזולוציה גבוהה בהגדלה של פי 40, וייבא את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה. התאימו את הפרמטרים המגדירים את הצורה והדלילות כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לתמונות. כדי להציג את האזורים המפולחים של גרורות גידול ורקמת ריאה תקינה, תוך שימוש בתוויות צבעוניות שונות עבור כל סוג רקמה, פתח את תוכנית יער ההחלטות, ועקוב אחר סדרת השאלות המתבקשות כן או לא כדי לאמן כראוי כל מחלקה לתמונה.כדי להתאים את התכונות עבור כל מחלקה, החל מסננים כדי לחדד, לטשטש או למיין לפי צורה כדי לשפר את הדיוק של האלגוריתם. בניתוח זה, גרורות הגידול מופיעות בכחול. הרקמה הרגילה ירוקה, ואפיתל הסימפונות צהוב.ניתן להבחין בתאי דם אדומים באדום, וחללי אוויר מופיעים בוורוד. לאחר שכל התכונות הוגדרו, שמור את ההגדרות ששונו והחל את האלגוריתם על כל הסט או הסדרה של רקמות מוכתמות H&E. לאחר מכן ייצא את כל משתני הפלט כדי לאפשר לכמת את השטח במיקרון בריבוע עבור כל סוג רקמה, ולאפשר חישוב של האחוזים משטח הרקמה נטו הכולל של הדגימה.נוכחות של אות ביולומינסנציה בתוך חלל בית החזה פחות משעתיים לאחר הזרקת וריד הזנב של תאי סרטן שד אפיתל אנושיים מתויגים בלוציפראז יכולה להיחשב כאישור להזרקה מדויקת. בניסוי זה, ספירת הפוטונים באזור בית החזה גדלה עם הזמן ואות ביולומינסנציה חזק עדיין היה נוכח ביום ה-24 לאחר ההזרקה. בזמן הנתיחה נצפו נגעי ריאות מקרוסקופיים רבים בעכברים אלה.באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ואלגוריתם מותאם אישית כפי שהודגם, ניתן לפלח רקמת ריאה שלמה לפי תכונות רקמה שונות. על ידי פילוח רקמת הריאה באופן זה, התוכנה יכולה לכמת פרמטרים שונים. כאן מוצגים נתונים גולמיים מניתוח שבוצע על רקמת ריאה מעכברים שהוזרקו להם תאי סרטן שד אפיתל אנושיים ואחריו טיפול בתרופה שנועדה לחסום קולוניזציה גרורתית.כפי שמודגם בתמונות אלה, ניתן היה להתעלם בקלות מהבדל בעומס הגידול הגרורתי בין קבוצות הטיפול הללו, מכיוון שהמספר הכולל של קשריות הריאות אינו שונה. עם זאת, ניתוח מקיף של כל הפרמטרים הצביע על הבדל משמעותי באחוז שטח הגרורות הריאתיות נטו, מה שמדגיש את הצורך בגישה יסודית לניתוח עומס גידול ריאה גרורתי השעיה מחדש של תאים ללא בועות אוויר היא קריטית למניעת תסחיפים ריאתיים, וניפוח ריאות מוצלח מסייע בשמירה על שלמות מבנה הרקמה לניתוח תמונה מדויק. ניתן לבצע צביעה חיסונית של רקמת הריאה כדי לקבוע את נוכחותם של תאים או חלבונים מעניינים בתוך נגעי הריאה או סביבת המיקרו של הריאות.

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

גרורה ניסויית Assay

סרטון זה מתאר טכניקה של הזרקת תאים סרטניים מסומנים באמצעות הזרקת ורידים בזנב למודל עכבר. אנו עוקבים גם אחר היווצרות גרורות וגדילה של סרטן השד באמצעות הדמיית בעלי חיים חיים בזמן אמת in vivo.

הזרקת ורידים בזנב: שיטה למתן תאים סרטניים למחקרים גרורתיים במודל עכבר

בסרטון זה, תאי מלנומה מוזרקים דרך וריד הזנב במודל העכבר. תאי המלנומה ממשיכים לנוע במערכת הדם, מסתגלים למיקרו-סביבה הרחוקה וגורמים לגרורות באיברים כמו ריאות.

מודל ניסיוני של עכבר מלנומה גרורתי: פלטפורמה לחקר הפוטנציאל הגרורתי של תאי מלנומה בריאות

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

גרורות ממלאת תפקיד משמעותי באלימות הסרטן, ומהווה כ-90% ממקרי המוות.  אנו מדווחים על פרוטוקול למודל מלנומה גרורתית בעכברים השימושי לקביעת יעילותם של חומרים טיפוליים כנגד תופעה קלינית זו.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

פותח הליך כירורגי להעברת תאי גידול חלב לכבד העכברים באמצעות הזרקת וריד פורטלי. מודל זה מאפשר לחקור שלבים מאוחרים של גרורות בכבד במארח בעל יכולת חיסונית מלאה, כולל אקסטרוואזציה של תאי גידול, זריעה, הישרדות וצמיחה גרורתית בכבד.

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

למדו שיטת הזרקת וריד זנב לרוחב לניתוח גרורות ריאתיות בסרטן שד באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלי. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ויעיל של נטל הגידולים הריאתיים במחקר מטסטזות.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים