Name: יישום טיפול Phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: למד כיצד להכין ולנהל קוקטייל פאג'ים נגד Pseudomonas aeruginosa בעוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפול הפאג'ים בחי ובהפחתת זיהום חיידקי במודל סיסטיק פיברוזיס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC#22/2017; אסוציאציה "גלי אצ'י דלה ריטי" קסניגו ו-FFC#23/2019; האו"ם respiro בפיו Onlus La Mano tesa Onlus).

דגי זברה בוגרים(Danio rerio)מזן AB (מרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה EZRC) נשמרים על פי הגנה בינלאומית (הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU) והנחיות לאומיות (צו איטלקי 4מרץ 2014, נ' 26) על הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. תנאים סטנדרטיים מוגדרים במתקן הדגים עם 14 שעות של אור / 10 שעות מחזור כהה וטמפרטורת מים מיכל ב 28 ° C.
1. הכנת פתרונות וכלים
<ol><li>הכן פתרון מניות של 50x ופתרונות עבודה של פי 1 עבור מדיום עובר E3 לגידול עוברי דגי זברה (ראה טבלה 1).</li>
	<li>להפוך את פתרון חסימת פיגמנטציה, כדי לחסום את פיגמנטציה העובר מ 24 שעות לאחר הפריה (24 hpf) (ראה טבלה 1).</li>
	<li>הכן מלאי 25x ו1x עובד Tricane הרדמה פתרון כמתואר בטבלה 1. הערה: כדי למנוע הקפאה חוזרת ונשנית של הפתרון שיכול לפגוע בפתרון המניות, הפוך aliquots של 2 מ"ל של 25x tricaine ולאחסן אותם ב -20 °C.</li>
	<li>להכין מסלולים microinjection העובר על ידי המסת 1 גרם של agarose ב 100 מ"ל של מזוקק H2O בבקבוקון או בקבוק microwavable. מיקרוגל במשך 1-3 דקות עד agarose מומס לחלוטין.</li>
	<li>תבניות מיקרו-אינחזציה של דגי זברה (ראה טבלת חומרים)התהפכו בצלחת פטרי (90 מ"מ x 15 מ"מ) ומכסים את כל פני השטח על ידי שפיכת ג'ל אגרוז נוזלי ברוחב של כ-10 מ"מ.</li>
	<li>הסר את התבנית לאחר שהאגרוז התגבש. ממלאים את צלחת פטרי ב-1 מיובר E3 בינוני. ניתן לאחסן זאת ב- 4°C למשך כשבוע. לפני השימוש, החלף במדיום E3 הטרי המכיל Tricaine. הערה: תבניות ישנות עלולות לפתח פטריות או זיהומים חיידקיים.</li>
	<li>השתמש אש מלוטשת 10 ס"מ borosilicate נימים כדי להכין מחטים microinjection ולאבטח אותם למשוך micropipette על ידי הידוק הידיות. הגדר את המשוך עם ההגדרות הבאות: חום 500, מהירות 100, זמן 150, למשוך 150.</li>
</ol>2. פ. ארוגינוזה (PAO1) הכנה אינוקולום
<ol><li>לחסן 1 מושבה של GFP+P. aeruginosa זן PAO119 ב 5 מ"ל של מרק LB (ראה טבלה 1) ולגדוללילה ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד).</li>
	<li>לדלל את תרבות הלילה לעיל כדי OD600 = 0.1 ב 10 מ"ל של מרק LB ולגדול OD600 = 0.5 ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד).</li>
	<li>צנטריפוגה 2 מ"ל של התרבות במשך 2 דקות ב 4 °C ב 16,100 x g ולתוסת מחדש את גלולת התא כדי OD600 = 1, שווה ערך על 1 x 109 cfu / מ"ל, ב 1 מ"ל של הפתרון הפיזיולוגי (ראה טבלה 1).</li>
	<li>לדלל את מתלי התא על 5 x 107cfu / מ"ל בתמיסה פיזיולוגית ולאחסן ב 4 ° C.</li>
</ol>3. הכנת מניות Phage
<ol><li>לחסן 1 מושבה של P. aeruginosa זן PAO1 ב 5 מ"ל של מרק LB דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. לדלל את תרבות הלילה כדי OD600 = 0.01 ב 500 מ"ל של מרק LB ולגדול ב 37 °C עם רועד OD600 = 0.05, שווה ערך על 2.5 x 107 cfu / מ"ל.</li>
	<li>לתרבות מדוללת של P. aeruginosa, להוסיף על 1.25 x10 7 phages, כדי לקבל את ריבוי הזיהום (M.O.I.) של 10-3. דגירה ב 37 ° C עם רועד עד OD600 יורד על 0.1-0.3 (ב כ 3 עד 5 שעות, בהתאם phage בשימוש). הערה: ארבעה phages נבחרו עבור ניסוי זה להדביק זן PAO1: שני Podoviridae, מספרי גישה GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236, ו vB_PaeP_DEV, MF490238, ושני Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, ו vB_PaeM_E217, MF490240. בצע את השלבים הבאים עבור כל phage בנפרד.</li>
	<li>דגירה lysate עם 1 מ"ג / מ"ל של DNase ו RNase במשך 30 דקות ב 37 ° C. צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° C בזהירות לשחזר את supernatant (SN). סנן את ה-SN עם מסנן בעל קוטר נקבוביות 0.8 μm.</li>
	<li>ל-SN, הוסף 58 ג'/אל של NaCl ו- 105 גרם/ל' של PEG6000. מתמוססים עם ערבוב ב-RT 20 דקות ולאחר מכן לשמור אותו לילה ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 20, 000 x g עבור 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עבור משקעים phage. הסר את ה-SN והמיס בזהירות את גלולת ה-phage ב- 15 מ"ל של מאגר TN (ראה טבלה 1).</li>
	<li>טהר את ה- phages עם מעבר צבע של צפיפות CsCl כמתואר בשלבים שלהלן.<ol>
<li>בצינורות אולטרה-צנטריפוגה פוליאלומרית עבור רוטור SW41, הכינו מעבר צבע של צפיפות צעד CsCl על-ידי שכבות של 2 מ"ל מתוך ארבעת פתרונות CsCl המתוארים בטבלה 1.  להוסיף 3.5 מ"ל של מתלה phage בכל אחד 4 צינורות. הערה: CsCl הוא רעיל, לאמץ נהלי בטיחות נאותים כדי לטפל ולהיפטר ממנו.</li>
		<li>להכניס את הצינורות לתוך הרוטור ולוודא כי הצינורות מאוזנים (הפרש המשקל בין שני צינורות מול חייב להיות ≤ 0.01g).</li>
		<li>צנטריפוגה ל-2 שעות ב-4°C ו-100, 000 x g (25,000 סל"ד עבור רוטור SW41). לאחר צנטריפוגה, לאט להסיר את הצינורות ולשתק אותם בזהירות על תמיכה. באמצעות מזרק עם מחט 19 G, צייר את הרצועה הלבנה/אופלסנט הממוקמת בדרך כלל בין d = 1.5 לבין אזור הצפיפות d=1.4.</li>
		<li>העבר את המתלים מהמזרק לצינורות פוליאלומר חדשים עבור רוטור SW60 והשתמש בתמיסת d=1.4 כדי לאזן במדויק את הצינורות.</li>
		<li>צנטריפוגה המתלים ב 4 °C ו 150,000 x g (38,000 סל"ד עבור הרוטור SW60) עבור לפחות 16 שעות.</li>
		<li>לאסוף את הרצועה גלוי כאמור לעיל (ראה שלב 3.3.3) ולהעביר אותם לתוך צינורות דיאליזה עם 6,000 Da לחתוך. דיאליזה הלהקה הנראה 2x שהתקבלו במשך 20 דקות נגד 500 מ"ל של מים והלילה נגד 500 מ"ל של מאגר TN. סנן עם מסנן נקבוביות 0.22 μm ולאחסן ב 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת קוקטייל פאג'
<ol><li>הפוך שילוב של ארבעה phages להדביק את הזן PAO1, בעבר מבודד ומאופיין8. לפני ערבוב, להעריך את הטיטר של כל מלאי phage על ידי לוח assay20.</li>
	<li>להרכיב את קוקטייל phage, עם titer הכולל של 5 × 108 pfu / מ"ל, על ידי ערבוב שווה ארבע הכנות phage באותו pfu / מ"ל מיד לפני כל ניסוי, כדי להבטיח titers phage מדויק.</li>
</ol>5. איסוף והכנת עוברי דגי זברה למיקרו-זיקת מופולינוס CFTR
הערה: לאסוף 1-2 עוברי תאים מתוך דגי זברה מסוג בר עבורcftr morpholinos (cftr-MOs) microinjection.
<ol><li>יומיים לפני ניסוי microinjection חיידקי, להגדיר זוגות רבייה ולאסוף עוברים כמתואר קודםלכן 21. דגי זברהבוגרים (דניו רריו)של זן AB נרכשו ממרכז המשאבים האירופי של דגי הזברה, EZRC.</li>
	<li>ביום שאחרי, לאסוף את העוברים מיד לאחר הפריה עם פיפטה פלסטיק או באמצעות מסננת רשת עדינה. מניחים את העוברים שנאספו בצלחת פטרי המכילה בינוני עובר E3 ולהסיר בזהירות את הפסולת עם פיפטה פלסטיק כדי למנוע זיהום שעלול לפגוע בהתפתחות העובר.</li>
	<li>להכין 5 μL של פתרון הזרקת מורפולינו על ידי דילול שני פתרונות מלאי מורפולינו (1 מ"מ) במים סטריליים לריכוז סופי של 0.25 pmol / עובר ATG-MO + 0.25 pmol / עובר splice-MO. כדי לעקוב אחר הזרקת העובר, להוסיף 0.5 μL של פנול אדום לתערובת תמיסת הזרקת מורפולינו.</li>
	<li>לטעון מחט microinjection עם כ 5 μL של פתרון תערובת מורפולינו באמצעות 20 μL micropipette עם קצה טעינת ג'ל פיין. אבטחו את המחט למיקרו-מניהר המחוברים לעמוד ומקם אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. הערה: אין צורך כי הפתרון מגיע לקצה המחט כמו הלחץ של משאבת microinjector ידחוף אותו.</li>
	<li>מהדק את קצה המחט על ידי חיתוך קצה המחט עם פינצטה סטרילית עדינה. למדוד את הקוטר של הטיפה באמצעות סרגל קנה מידה בזווית של המיקרוסקופ. לחלופין, ליצור טיפה של שמן מינרלי על שקופית מיקרומטר ולהגדיר את נפח microinjection על ידי הזרקת הפתרון לתוך השמן-טיפה כדי להעריך את גודל הטיפה. השתמש בטיפה בקוטר 156 μm כדי להזריק נפח של 2 כ"ס.</li>
	<li>הגדר את microinjector על ידי התאמת לחץ הפיצוי 15 hPa, זמן הזרקה 0.5 s, ולחץ הזרקה בין 300 ו 600 hPa כדי לקבל את נפח ההזרקה הנכון בהתאם למחט בשימוש.</li>
	<li>עם פיפטה מפלסטיק מסדרים את העוברים ממדרגה 5.2 לזכוכית הממוקם בצלחת פטרי בקוטר 96 מ"מ. הערה: מדיום E3 יותר מדי ימנע את החדירה הנכונה של מחט microinjection לתוך chorion של העוברים.</li>
	<li>לחדור את chorion ולאחר מכן את החלמון עם המחט להזריק 2 nL לתוך העובר כפי שתואר קודםלכן 22.</li>
	<li>מניחים עוברים מוזרקים לצלחת פטרי עם בינוני E3 ולשים אותם באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להם להתפתח עד היום שאחרי.</li>
</ol>6. מיקרו-זיקת עוברי דגי זברה עם חיידקים וקוקטייל פאג'
הערה: כדי לבצע זיהום מערכתי, העובר חייב להיות זרימת דם כי בדרך כלל מתחיל לאחר 26 hpf.
<ol><li>לאחר 26 hpf (עבור שלבים התפתחותיים של דגי זברה מתייחסים קימל21) עוברים dechorionate עם תמיסת pronase שהוכן על ידי המסת אבקת פרונז ב E3 בינוני בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל. בעדינות פיפטה העוברים לשבור את chorion. בטלו את המדיום pronase/E3 ושונו את המנה מספר פעמים עם E3 טרי כדי להסיר את כל הפרונאז.</li>
	<li>להניא עוברי דגי זברה במדיום E3 המכיל Tricaine כ 5 דקות לפני הזריקות.</li>
	<li>פיפט העוברים המרדמים למסלול שהוכנו בשלב 1. השתמש בקצה טעינת ג'ל פיין כדי לתח רוח לעוברים בתנוחה החוץ.</li>
	<li>לטעון מחט microinjection עם כ 5 μL של הכנת P. aeruginosa כמתואר בחלק 5.</li>
	<li>הכנס את המחט במשבר לנקודת ההתחלה של צינור האוורור של Cuvier שבו הוא מתחיל להתפשט על שק החלמון. הזרק נפח של 1-3 nL ולהבטיח כי עוצמת הקול מתרחבת ישירות בתוך צינור האוורור ונכנס למחזור הדם.</li>
	<li>כ אחרי כל 50 מוזרק-עובר, להזריק טיפה של החיידקים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל עם 100 μL של PBS סטרילי כדי לבדוק אם נפח ההזרקה נשאר אותו הדבר. לוח inoculum על LB אגר (ראה טבלה 1)ב 37 ° C לילה כדי להעריך את CFU.</li>
	<li>מעבירים את העוברים המיקרו-אינטג'ים בשתי מנות פטרי נקיות עם E3 בינוני טרי + PTU ותדגירה ב-28°C.</li>
	<li>בשתי נקודות זמן נבחרות: 30 דקות או 3 שעות לאחר ההזרקה החיידקית, להוציא את אחת המנות פטרי עם עוברים מוזרקים חיידקים מהאינקובטור וליישר אותם במסלול כמתואר 6.3 עבור הזרקת קוקטייל phage.</li>
	<li>טען מחט microinjection עם כ 5 μL של קוקטייל phage (מוכן בשלב 4) עם קצה טעינת ג'ל בסדר ולתקן אותו microinjector (ראה שלב 5).</li>
	<li>להזריק את קוקטייל phage בתעלות של Cuvier של העוברים שהוזרקו בעבר עם חיידקים.</li>
	<li>מעבירים את העוברים המיקרו-אינטג'ים בשתי מנות פטרי נקיות עם E3 בינוני טרי + PTU ותדגירה ב-28°C.</li>
</ol>7. הערכת הנטל החיידקי של עוברים מוזרקים PAO1 ו phages
<ol><li>ב 8 hpi, פיפטה 15 עוברים מנומים מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.</li>
	<li>להחליף את תמיסת ההרדמה עם 300 μL של 1% Triton X-100 ב PBS (PBSTritonX) ו homogenize העוברים על ידי העברתם לפחות 15x דרך מזרק אינסולין עם מחט סטרילית 27-G.</li>
	<li>להכין דילול סדרתי של homogenates PBS סטרילי על ידי העברת 100 μL של homogenate מדולל לתוך 900 μL של PBS סטרילי.</li>
	<li>כדי לבחור עבור זן PAO1 עמיד באופן טבעי, צלחת 100 μL של דילול על LB אגר הוסיף עם אמפוצילין (100 μg / מ"ל), ומדגר ב 37 ° C במהלך הלילה.</li>
	<li>יום לאחר מכן, לספור את מספר המושבות, להכפיל על ידי גורם דילול כדי לקבוע את המספר הכולל של CFU, ולחלק על ידי מספר העוברים homogenized כדי לקבל את המספר הממוצע של CFU / עובר נגוע.</li>
</ol>8. הערכת הקטלניות של עוברים המוזרקים PAO1 ו phages
<ol><li>כדי להעריך את הקטלניות של זיהום PAO1, ציון העוברים המוזרקים ב 20 hpi תחת stereomicroscope ולספור עבור העוברים המתים (לבן / לא שקוף).</li>
	<li>לחשב את הריכוז הקטלני חצי מקסימום 50 (LD50) מנה של PAO1 הקובע את מותו של 50% של עוברים מוזרקים ב 20 hpf.</li>
</ol>9. הכנת העובר להדמיית זמן-לשגות סטריאומיקרוסקופ של GFP+ PAO1 זיהום
<ol><li>הכנת התבנית להדמיית עובר חי על ידי המסת 1.5% agarose התכה נמוכה ב 100 מ"ל של פתרון E3.</li>
	<li>הוסף 1% טריקין (ראה טבלה 1)כדי להנות את העוברים.</li>
	<li>ב 4 hpi להעביר עובר אחד עם פיפטה פלסטיק בצלחת תחתית זכוכית ולהוסיף את תמיסת agarose נקודת התכה נמוכה חמה.</li>
	<li>מקם את צלחת הזכוכית התחתונה מתחת לסטריאומיקרוסקופ ועם מיקום קצה העובר בכיוון הרצוי. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להוסיף בזהירות טיפה של agarose על העובר.</li>
	<li>מניחים לאגרוז להתקרר במשך 5-10 דקות ולמלא בעדינות את צלחת התחתון של הזכוכית ב-E3 המכילה את תמיסת ההרדמה כדי לשמור על העובר לח.</li>
	<li>מניחים את הצלחת התחתונה זכוכית עם העובר תחת סטריאומיקרוסקופ פלורסנט עם מסנן פלורסנט (ערוץ 488 ננ"מ) עבור GFP+ חיידקים. אין להסיר את צלחת פטרי עד לרכישות נוספות עם אותם פרמטרים ב- 9, 14 ו- 18 hpi.</li>
</ol>10. ניתוחי ביטוי של ציטוקינות פרו דלקתיות
<ol><li>ב 20 hpi להנימה העוברים עם תמיסת tricaine 1x ולהעביר אותם מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל.</li>
	<li>תחת מכסה המנוע אדים להסיר את תמיסת ההרדמה ולהחליף עם 200 μL של גאנידיום הידרוכלוריד רייגנט.</li>
	<li>הומוגניזציה עוברים על ידי pipetting אותם שוב דרך 200 μL פיפטה ראשון ולאחר מכן לפחות 15x עם מזרק אינסולין עם מחט סטרילית 27 G.</li>
	<li>לחלץ RNA הכולל של עוברי דגי זברה הומוגניים באמצעות reagentים הידרוכלוריד גואנידיום זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>לטפל 1 μg של כל מדגם של RNA עם 2 μL של 1U/μL של DNase I (RNase-free), בעקבות הוראות היצרן.</li>
	<li>השתמש 1 μg של DNase אני טיפלתי RNA לתגובה תמלול הפוך (RT) באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים),בנפח כולל של 20 μL על פי הוראות היצרן.</li>
	<li>בצע RT qPCR תגובה בנפח כולל של 10 μL המכיל 1x SYBR ירוק mastermix באמצעות 1.5 μL של דילול 1:6 של תגובת RT. למטרות נורמליזציה, השתמש פריימרים עבור הגנים שמירת הבית rpl8 ולציטוקינות פרו דלקתיות, להשתמש פריימרים עבור TNF-α ו IL-1β (ראה טבלה 2). פרוטוקול qPCR היה: מחזור 1 שלב 1: 95 °C, 2 דקות, חזור פעם אחת; מחזור 2: שלב 1 95 °C, 10 s, שלב 2 55 °C, 30 s, חזור 40x; מחזור 3: שלב 1 72 °C, 15 דקות.</li>
</ol>

<ol><li>Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Therapy+in+Bacterial+Infections+Treatment%3A+One+Hundred+Years+After+the+Discovery+of+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages.</a> Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).</li>
<li>Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+phage+therapy+in+cystic+fibrosis%3A+Essential+human-bacterial-phage+interactions+and+delivery+considerations+for+use+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).</li>
<li>Pacios, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+combat+multidrug-resistant+and+persistent+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases.</a> Antibiotics. 9 (2), 65(2020).</li>
<li>Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplication+of+bacteriophage+in+vivo+and+its+protective+effect+against+an+experimental+infection+with+shigella+dysenteriae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae.</a> Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).</li>
<li>Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+therapeutically+administered+bacteriophages+in+Pseudomonas+aeruginosa+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients.</a> Burns. 32 (5), 644-656 (2006).</li>
<li>Heo, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+efficacy+of+phages+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+mice+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646(2009).</li>
<li>McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+a+mouse+burn+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028(2007).</li>
<li>Forti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+broad-range+bacteriophage+cocktail+that+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+and+treats+acute+infections+in+two+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573(2018).</li>
<li>Jault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+tolerability+of+a+cocktail+of+bacteriophages+to+treat+burn+wounds+infected+by+Pseudomonas+aeruginosa+%28PhagoBurn%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind+phase+1%2F2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial.</a> Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).</li>
<li>Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+resistance+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+zebrafish+is+mediated+by+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).</li>
<li>Clatworthy, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+of+zebrafish+involves+both+host+and+pathogen+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants.</a> Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).</li>
<li>Bernut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Protects+against+Mycobacterium+abscessus+Infection+by+Fine-Tuning+Host+Oxidative+Defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses.</a> Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).</li>
<li>Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+phage+therapy+efficacy+in+Burkholderia+cepacia+complex+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388(2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Doring, G., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+innate+immunity%3A+how+chloride+channel+mutations+provoke+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease.</a> Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).</li>
<li>Navis, A., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cftr+function+leads+to+pancreatic+destruction+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish.</a> Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).</li>
<li>Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cftr+controls+lumen+expansion+and+function+of+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 140, 1703-1712 (2013).</li>
<li>Balloy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+cystic+fibrosis+human+bronchial+epithelial+cells+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+exhibit+distinct+gene+activation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns.</a> PLoS One. 10, 0140979(2015).</li>
<li>Cafora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+therapy+against+Pseudomonas+aeruginosa+infections+in+a+cystic+fibrosis+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model.</a> Science Reports. 9, 1527(2019).</li>
<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

בכתב יד זה, תיארנו את הפרוטוקול לבצע P. aeruginosa (PAO1) זיהום בעוברי דגי זברה ואיך ליישם טיפול phage עם קוקטייל של phages שזוהו בעבר כמסוגל להדביק PAO1 כדי לפתור את זה. השימוש bacteriophages כחלופה לטיפולים אנטיביוטיים כבר עניין גובר מאז השנים האחרונות. זה בעיקר בשל דיפוזיה של זיהומים חיידקיים עמידים לתרופות מרובות (MDR), המהווים בעיה רצינית לבריאות הציבור. כמובן, היקף העבודה הזו מוגבל ליישום של טיפול בפאג' למודל של בעלי חיים ולא לבני אדם. עם זאת, יצרנו מודל זברה סיסטיק פיברוזיס עם הזרקת מורפולינו מיקוד הג...

טיפול Phage, השימוש באויבים הטבעיים של חיידקים להילחם בזיהומים חיידקיים, הוא צובר עניין מחודש כמו עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה הופךנפוץ 1,,2. טיפול זה, המשמש במשך עשרות שנים במזרח אירופה, יכול להיחשב טיפול משלים לאנטיביוטיקה בריפוי דלקות ריאות בחולים עם CF וחלופה טיפולית אפשרית עבור חולים נגועים בחיידקים עמידים בפני כל הנוכחי בשימושבאנטיביוטיקה 2,3. היתרונות של טיפול אנטיביוטי הם bacteriophages להכפיל באתר הזיהום, בעוד אנטיביוטיקה הם מטבוליזם ומבוטלמהגוף 4,5. אכן, ניהול קוקטיילים של phages ארסי מבודד במעבדות שונות הוכיח להיות יעיל בטיפול בזיהומים aeruginosa פסאודומונס במודלים של בעלי חיים שונה כמו חרקים ויונקים6,7,8. טיפול Phage הוכח גם להיות מסוגל להפחית את הנטל החיידקי בפצעי כוויות נגוע P. aeruginosa ו Escherichia קולי בניסוי קליני אקראי9.
דגי זברה (דניו rerio) לאחרונה התגלה כמודל יקר לחקר זיהומים עם מספר פתוגנים, כולל P. aeruginosa10,,11, מורסה Mycobacterium ו Burkolderia cepacia12,13. על ידי microinjecting חיידקים ישירותלתוך מחזור הדם העובר 14 קל להקים זיהום מערכתי כי הוא מנוטרל על ידי מערכת החיסון המולדת של דגי הזברה, אשר אבולוציונית שמר עם נויטרופילים ודור מקרופאג דומה המקביל האנושי. יתר על כן, במהלך החודש הראשון של החיים, עוברי דגי זברה חסרים את התגובה החיסונית אדפטיבית, מה שהופך אותם מודלים אידיאליים ללימוד החסינות המולדת, שהוא מנגנון ההגנה הקריטי בדלקותריאות אנושיות 15. דגי זברה הופיעו לאחרונה כמערכת מודל גנטי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את תחילת CF ולפתח טיפוליםתרופתיים חדשים 10,16,17. מודל דגי הזברה CF של CFTR נוק-דאון שנוצר עם הזרקת מורפולינו בדעי זברה הציג תגובה התפרצות נשימתית לחה והגירהנויטרופיל מופחתת 10, בעוד נוק אאוט CFTR מוביל לתום איברים פנימי לקוי והרס של הלבלב האקסוקריני, פנוטיפהמשקף מחלה אנושית 16,17. העניין הגדול ביותר היה הממצא כי הנטל החיידקי P. aeruginosa היה גבוה באופן משמעותי בעוברים cftr-אובדן של פונקציה מאשר בפקדים ב 8 שעות לאחר הזיהום (hpi), אשר מקביל את התוצאות שהתקבלו עם עכברים ותאי אפיתל הסיפונותהאנושיים 2,,18.
בעבודה זו, אנו מדגימים כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa בעוברי דגי זברה.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט של דולבקו PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>886-86-2</td><td>שם נפוץ טריקאין</td></tr><tr><td>Femtojet Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>פלמינג/חום P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>נמס נמוך אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>מתיל כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מיקרו-הזרקה</td> מכשיר <td></td><td></td><td>הרווארד</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea >=98%</td><td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Morpholino</td><td>Gene Tools</td><td></td><td>שתוכננו על ידי החוקר</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>פרונאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי מגיב ACS, &ge; 99.0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS מיקרו-הזרקה</td><td>Word מכשירים מדויקים</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יישום טיפול phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

עמידות מיקרוביאלית, תוצאה גדולה של אי-ודאות אבחונית ויתור יתר מיקרוביאלי, היא גורם מוכר יותר ויותר לזיהומים חמורים, סיבוכים, ותמותה ברחבי העולם עם השפעה עצומה על החברה שלנו ועל מערכת הבריאות. בפרט, חולים עם מערכות חיסוניות בסכנה או פתולוגיות קיימות וכרוניות מראש, כגון סיסטיק פיברוזיס (CF), נתונים לטיפולים אנטיביוטיים תכופים כדי לשלוט בזיהומים עם המראה ופיזור של מבודדים עמידים multidrug. לכן, יש צורך דחוף לטפל טיפולים חלופיים כדי לנטרל זיהומים חיידקיים. שימוש bacteriophages, האויבים הטבעיים של חיידקים, יכול להיות פתרון אפשרי. הפרוטוקול המפורט בעבודה זו מתאר את היישום של טיפול phage נגד זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה CF. עוברי דגי זברה נדבקו P. aeruginosa כדי להוכיח כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa כפי שהוא מפחית קטלניות, נטל חיידקי ותגובה חיסונית פרו דלקתית בעוברי CF.

תוצאות ונתונים המוצגים כאן מכונים עוברי CF שנוצרו באמצעות הזרקת cftr morpholinos כמתוארקודם לכן 10 ובצעד 5. כדי לאמת את פנוטיפ CF, המיקום הלקויה של איברים פנימיים כגון לב, כבד, ולבלב כפישתואר קודם לכן 17 (איור 1) נחשבו. תוצאות דומות הושגו במקרה של עוברי WT כפי שדווח בפרסום הקודם שלנו19.
נטל חיידקים הופחת על ידי טיפול phage בעוברי CF נגוע PAO1. יתר על כן, הערכנו את הנטל החיידקי ב 8 hpi...

מוצג כאן פרוטוקול עבור זיהום Pseudomonas aeruginosa ויישום טיפול phage בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (CF).

יישום טיפול Phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

פרוטוקול זה מקל על הכנה ומינהל של קוקטייל ויראלי ופאג ' נגד פסאודומונס aeruginosa בעוברים זברה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה in vivo של יעילות הפאג ' בניתוח הזיהום החיידקי. קוקטייל הפאג' יעיל הן בדגמי זברה-דגי סיסטיק פיברוזיס והן בדגמי זברה.פתיחת האפשרות ליישם את הטיפול פאג' לזיהומים חיידקיים בחולים סיסטיק פיברוזיס. טיפול פאג' יכול להיות מיושם גם כדי לנטרל זיהומים חיידקיים ספציפיים במערכות מודל אחרות. כדי להכין מלאי פאג' לניסוי.הוסף 1.25 פעמים 10 כדי פאג'ים השביעי OD 600 של 0.05 P.aeruginosa תרבות ריבוי של זיהום של פעם אחת 10 כדי שלילי שלוש דגירה התרבות במשך שלוש עד ארבע שעות עם רועד עד OD 600 יורד ל 0.1 כדי 0.3. בסוף הדגירה דגירה את הליזט עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של DNAse ו RNAse במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.בסוף מסנן הצנטריפוגה העל-טבעית בקוטר של 0.8 מיקרו מטר ומוסיפים 58 גרם לליטר נתרן כלורי ו-105 גרם לליטר PEG 6000. דגירה הפתרון בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לזרז את הפאג' על ידי צנטריפוגה.בסוף centrofugation להסיר את supernatant בזהירות להמיס את גלולת פאג ב 15 מיליליטר של חיץ נתרן כלורי טריס. כדי לטהר את הפאג'ים על ידי שיפוע צפיפות צסיום כלוריד, תחילה לשכבות שני מיליליטר של ארבעה פתרונות שונים צסיום כלוריד בצינורות אולטרהצנטריפוגה פוליאלומר עבור SW 41 רוטור ולהוסיף 3.5 מיליליטר של השעיית פאג 'לכל צינור. צסיום כלוריד רעיל.תמיד לאמץ נהלי בטיחות נאותים בעת טיפול והשליכה של מתחם זה. כאשר כל הצינורות נטענו, מניחים את הצינורות לתוך הרוטור דואג כי הצינורות מאוזנים. וצנטריפוגה הדגימות במשך שעתיים ב100, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.בסוף הצנטריפוגה, השתמש במזרק עם מחט 19 מד כדי לשאוף את השכבה הלבנה בין D שווה 1.5 ו D שווה 1.4 אזורי צפיפות. ולהעביר את המתלים לצינורות פוליאלומר חדשים בגודל SW 60. צנטריפוגה ההשעיות לפחות 16 שעות ב 150, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.ולהעביר את הלהקות הנראות לעין לצינורות דיאליזה עם ניתוק של 6,000 דלטון. ואז דיאליזה הדגימות שנאספו פעמיים נגד 500 מיליליטר של מים במשך 20 דקות לדיאליזה ולינה נגד 500 מיליליטר של חיץ נתרן כלורי טריס. למחרת בבוקר, לסנן את מלאי פאג וכתוצאה מכך עם מסנן נקבוביות 0.22 מיקרו מטר ולאחסן את המלאי בארבע מעלות צלזיוס.ביום של הזרקת מיקרו לדלל שני פתרונות מלאי morpholinos micromolar אחד במים סטריליים לריכוז סופי של 0.25 picomolar לכל עובר כדי לקבל פתרון הזרקת מורפולינו חמישה מיקרוליטר. ולהוסיף 0.5 microliters של פנול אדום לכל פתרון. לאחר מכן השתמש micropipette 20 microliter עם קצה טעינת ג'ל עדין לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כל נפח של פתרון מעורב מורפולינו ולאבטח את המחט למיקרו מניפולטור מחובר לעמוד תחת מיקרוסקופ סטריאו.ואז עם תא אחד או שניים, עוברי דגי זברה מסודרים על מגלשת זכוכית הממוקמת בתוך צלחת פטרי בקוטר 96 מ"מ, חודרים את הצ'וריון והחלמון עם קצה מחט הזרקת המיקרו ומזריקים שני ננוליטרים של תערובת המורפלינו לעובר. ב 26 שעות לאחר ההפריה, לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כחמישה microliters של P.aeruginosa inoculum ולהכניס את המחט dorsally לנקודת ההתחלה של הצינור של קובייה שבו הצינור מתחיל להתפשט על שק החלמון. להזריק אחד עד שלושה nanoliters של PAO1 inoculum לתוך העובר לוודא כי נפח מתרחב ישירות בתוך הצינור ונכנס לתוך זרימת הדם.לאחר ההזרקה מעבירים את העובר לאחת משתי מנות פטרי חדשות המכילות מדיום E3 טרי בתוספת פנילטוריה במשך 30 דקות או שלוש שעות דגירה ב 28 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטעון מחט הזרקת מיקרו עם כחמישה microliters של קוקטייל פאג 'ולתקן את המחט למזרק מיקרו. ואז להזריק אחד עד שלושה nanoliters של קוקטייל פאג ' לתוך הצינור של קובייה של כל עובר שהוזרק בעבר עם חיידקים ולמקום את העוברים לתוך אחת משתי מנות פטרי חדש המכיל טרי E3 בינוני בתוספת phenylthiourea ב 28 מעלות צלזיוס.בארבע שעות לאחר ההדבקה, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר עובר הרדמה לצלחת תחתונה מזכוכית. ולמלא את המנה עם תמיסת נקודת התכה נמוכה וחמה. כאשר אגרוז קר, בעדינות למלא את המנה עם E3 בינוני בתוספת פתרון הרדמה.מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ולהשתמש קצה פיפטה כדי למקם את העובר בכיוון הרצוי. לאחר מכן מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם מסנן פלואורסצנטי עבור חיידקים חיוביים GFP עד 18 שעות לאחר ההדבקה ודמיין את העובר להתקדמות ביטוי GFP בגיל תשע, 14 ו -18 שעות לאחר ההדבקה. כדי לקבוע את הנטל החיידקי בשמונה שעות לאחר ההדבקה, להעביר 15 עוברים מוזרקים מיקרו הרדמה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולהחליף את הפתרון ההרדמה עם 300 microliters של 1% טריטון X-100 ב PBS.להעביר את המחטים דרך מחט סטרילית 27 מד של מזרק אינסולין לפחות 15 פעמים כדי הומוגניזציה העוברים. והכן דילול סדרתי של הומוגניט על ידי העברת 100 microliters של התערובת וכתוצאה מכך לתוך 900 microliters של PBS סטרילי לכל דילול. כדי לבחור עבור זן P.aeruginosa עמיד באופן טבעי, צלחת 10 microliters של דילול על LB אגר בתוספת אמפיצילין דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת לספור את מספר המושבות. כדי לאפשר חישוב של המספר הכולל של יחידות יוצרות המושבה ואת המספר הממוצע של יחידות יוצרות מושבה לכל עובר נגוע. כדי להעריך את הקטלניות של זיהום P.aeruginosa ציון העוברים מוזרק ב 20 שעות לאחר זיהום תחת מיקרוסקופ סטריאו על ידי ספירת מספר עוברים אטומים לבנים מתים.ואז לחשב את הריכוז הקטלני חצי מקסימלי 50 מנה של P.aeruginosa שהביא למוות של 50% של העוברים מוזרק ב 20 שעות לאחר ההדבקה. כדי לאמת את פינוטיפ סיסטיק פיברוזיס את המיקום לקוי של איברים פנימיים כגון כבד הלב והלבלב ניתן להעריך. הנטל החיידקי מצטמצם על ידי טיפול פאג' בעוברים סיסטיק פיברוזיס נגוע P.Aeruginosa.ב 48 שעות לאחר הפריה סיסטיק פיברוזיס עוברים נגועים GFP חיובי P.Aeroginosa חיידקים 30 מושבה להרכיב יחידות לכל מינון העובר מדגים קטלניות 50% ב 20 שעות לאחר ההדבקה. טיפול פאג' יעיל באותה מידה ב 20 שעות לאחר ההדבקה כאשר נמסר 30 דקות או שבע שעות לאחר הזרקת חיידקים. כאן, סיסטיק פיברוזיס ו GFP חיובי P.Aeruginosa מוזרק עובר בארבע, תשע, 14 ו 18 שעות לאחר ההדבקה מוצג.לעומת זאת, סיסטיק פיברוזיס בתוספת P.Aeruginosa בתוספת פאג' מוזרק עובר מדגים פלואורסצנטיות מופחתת עקב פעולת פאג 'נגד החיידקים. התגובה הדלקתית שנוצרת על ידי זיהום P.aeruginosa בעוברים סיסטיק פיברוזיס גדל באופן משמעותי כפי שנחשף על ידי הביטוי של ציטוקינות פרו דלקתיות, אלפא TNF ו interleukin 1 בטא בעקבות הזרקת P.aeruginosa לעומת שליטה מוזרק זברה. הביטוי של שני ציטוקינות דלקתיות מצטמצם בקוקטייל פאג' במשותף בעלי חיים עם זאת.יש לטהר את הפאג'ים בזהירות כדי להסיר כל אנדוטוקסין מזהם שעשוי להישמר במהלך ההכנה. ההכנות פאג ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים כדי להעריך את מורפולוגיה virion. זה יהיה מעניין לבדוק אם הזיהום בחולים אנושיים על ידי חיידקים אחרים מאשר pseudomonas aeruginosa ניתן לרפא עם טיפול פאג 'במודל סיסטיק פיברוזיס זברה.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

הסרטון מדגים את טכניקת הטיפול בפאגים המכוונת לזיהום Pseudomonas aeruginosa בעוברים של דגי זברה סיסטיק פיברוזיס. טיפול בפאגים מפחית ביעילות את עומס החיידקים וממתן תגובות חיסוניות מעודדות דלקת בעוברים של דגי זברה CF הנגועים בחיידקים, מה שמוביל לירידה בקטלניות של עוברי CF.

טיפול בפאגים נגד זיהום Pseudomonas aeruginosa בעוברים של דגי זברה

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

in vivo אינטראקציות מרחביות-זמניות של פתוגן והגנות חיסוניות ברמת הרירית אינן ניתנות להדמיה בקלות במארחים קיימים של בעלי חוליות. השיטה המוצגת כאן מתארת פלטפורמה רב-תכליתית לחקר קנדידה רירית בבעלי חוליות חיים תוך שימוש בכיס השחייה של דג הזברה הצעיר כאתר זיהום.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

עוברי דג זברה שקופים אופטית נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור ולדמיין בזמן אמת את האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים פתוגניים לתאי החיסון המולדים. מיקרו-הזרקה של Mycobacterium abscessus, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית, משמשת לבחינת מאפיינים פתוגניים חיוניים כגון היווצרות חבל בעוברי דג זברה.

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

פרוטוקול זה מתאר את השימוש sump מטליות וניתוח בוצה של דג זברה מערכות, מה שמוביל גילוי מוגברת בהשוואה לשימוש הבלעדי של זקיפים לזהות פתוגנים כגון Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp.  Pseudocapillaria tomentosa. מערכת לפקח tomentosa פ ביצים בהסגר גם מוצע.

הקרנת איכות הסביבה של Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa במערכות דג זברה

כאן נתאר החיסונים של הבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) עם חיסון מבוסס DNA עבור פרוטוקול להדגים את האימות של אירוע מוצלח חיסון. שיטה זו מתאימה להקרנה פרה של החיסון מועמדים במודלים שונים של זיהום.

חיסונים של דג זברה בוגרת להקרנה פרה של חיסונים מבוסס DNA

פרוטוקול זה מספק הוראות שלב אחר שלב ליצירה ופתרון בעיות של השתלות קסנוגרפים של לוקמיה לימפובלסטית חריפה אנושית (ALL) מקווי תאים וחומר מטופל טרי בעוברי דג זברה מדוכאי חיסון חולפים, יחד עם הנחיות להערכת תגובה לתרופות באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן להתאים את צינור הניסוי גם לגידולים מוצקים.

חיזוי מהיר של תגובת תרופות in vivo באמצעות שתלי תאי לוקמיה בעוברי דג זברה

כיום חסרים מודלים in vivo המתאימים לבדיקת תרופות נגד זיהומים חיידקיים כרוניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהום פצע על ידי מבודד קליני של Pseudomonas aeruginosa כדי ליצור זיהום מתמשך בזחלי דג הזברה.

מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

למד כיצד להכין ולנהל קוקטייל פאג'ים נגד Pseudomonas aeruginosa בעוברי דגי זברה. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפול הפאג'ים בחי ובהפחתת זיהום חיידקי במודל סיסטיק פיברוזיס.

יישום טיפול Phage כדי לנטרל זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס

גלה סרטונים נוספים