Name: החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: למדו כיצד להפעיל גירוי מכני תלת-ממדי בביוריאקטור כדי לגרום לבידול טנוגני של תאי גזע מגידים (TDSCs). שיטה זו מסייעת בחקר טיפולים חדשים לטנדינופתיה ושיקום גידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר בוצע בזמן המחבר היה לקבלה של "אוניברסיטת מערב אוסטרליה מלגת הבינלאומי מלגות ופרס לתואר שני באוניברסיטה באוניברסיטת אוסטרליה המערבית". עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81802214).

השיטות שתוארו אושרו והוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת מערב אוסטרליה.
1. בידוד של עכברים TDSCs
<ol><li>המתת חסד 6-8 בן שבוע-C57BL/6 עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם.</li>
	<li>.וגידים של אכילס25</li>
	<li>לעכל את הגידים מאחד עם 6 מ ל מסוג אני הקולגנאז (3 מ"ג/mL) עבור 3 h. הערה: כמו בגודל של גיד בעכבר קטן, כל הגידים שנקטפו מעכבר אחד יש להשתמש בשלב זה.</li>
	<li>לאסוף את התאים והתרבות בינונית מינימלית Essential מינימלי (Alpha-מזכור) המכיל 10% סרום העוברי (FBS) ו 1% של תערובת סטרפטומיצין ו פניצילין עבור 7 ימים.</li>
	<li>זיהוי TDSCs באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית על-ידי cy, CD90 ו-סקה -1; חוסר הביטוי של CD34 וCD45).</li>
	<li>מעבר והקפאת תאים (מעבר 4 תאים ישמשו לשלבים נוספים).</li>
</ol>2. תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs
הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.
<ol><li>קח את התאים התחממו (עכברים TDSCs, 1,000,000 תאים, מעבר 4, עד 37 ° c).</li>
	<li>הוסף באיטיות 4-5 מ ל של מדיום מינימלי חיוני לחלוטין (Alpha-זיכרון).</li>
	<li>העבירו את התערובת לצינור. צנטריפוגה של 15 מ ל עם פיפטה</li>
	<li>למעלה עם בינוני עד 8 מ"ל סה כ עם פיפטה.<ol>
<li>מדיום לחימום בחממה 37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הציבו את הצינור בצנטריפוגה ובאיזון.</li>
	<li>צנטריפוגה ותאים גלולה ב 347 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>צאו אחרי הצנטריפוגה. ובידקו את הגלולה בתחתית</li>
	<li>Decant בינונית הקפאה, ולהשעות מחדש את התאים בעדינות ב 1-2 mL של בינוני מוחלט (להימנע מלעשות בועות רבות מדי).</li>
	<li>העבר תאים שהושעו מחדש לבקבוקון T-75 באמצעות פיפטה.</li>
	<li>השתמש בפיפטה כדי להוסיף לבקבוק אלפא-מדיום מלא לבקבוקון כדי להגיע לנפח כולל של 10 מ ל עם ריכוז סופי של 13,000 תאים/cm2.</li>
	<li>מניחים את הבקבוקון לתוך החממה והתרבות ב 37 ° c עם 5% CO2.</li>
	<li>. להחליף את המדיום כל 3 ימים</li>
	<li>להתבונן ולנטר את התאים תחת מיקרוסקופ בעת שינוי המדיום עד התאים הם מתורבתים כדי 100% המפגש (כ 40,000 תאים/cm2).</li>
</ol>3. הכנת מדיום לעיבוד תאים
הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.
<ol><li>שופכים 15 מ ל של בינונית אלפא-מלאה להשלים לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 6 μL של חומצה אסקורבית (11 מ"ג/mL) לתוך 15 mL של בינונית עבור ריכוז סופי של 4.4 μg/mL. הערה: בנוסף, הוספת 25 ng/mL מקדם גידול רקמת חיבור במדיום תרבות גירוי יכול להאיץ את כל תהליך הצמיחה והבידול.</li>
	<li>מערבבים בעדינות על ידי היפוך למעלה ולמטה.</li>
</ol>4. היווצרות יריעות תאים על ידי מעגלי גירוי במדיום
הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.
<ol><li>למחוק את המדיום המלא הרגיל אלפא-זיכרון בזהירות, ולהימנע מלגעת התאים המחוברים לתחתית הבקבוקון.</li>
	<li>הוסף 10 מ ל של גירוי בינוני לאט להימנע גורם כל הפרעה לתאים באופן מלא.</li>
	<li>תרבות התאים במדיום גירוי 9 ימים (לשנות את המדיום כל 3 ימים) כדי ליצור מספיק את הגיליון התא ב 37 ° c עם 5% CO2. הערה: מטריצת מערות יהיה עבה והווה להיות מעונן כאשר הוא נצפה מהחלק התחתון של הבקבוקון לאחר גירוי על ידי חומצה אסקורבית, כלומר גיליון התא הוא נוצר מספיק.</li>
</ol>5. הכנת מבנה תא גזע של גיד 3D
הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.
<ol><li>. תוציא את הבקבוקון מאינקובטור</li>
	<li>התעלם מאמצעי הגירוי לחלוטין.</li>
	<li>שטוף את גיליון התאים המונאולייר עם תמיסת מלח (PBS) על ידי התערבל הבקבוקון.</li>
	<li>. השמט את הערוץ לגמרי</li>
	<li>השתמש בפיפטה כדי להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין לפינה של הבקבוקון.</li>
	<li>הקש על פינת הבקבוקון כדי לבטל את החיבור של גיליון התא המונאולייר עד שהפינה של גיליון התא תרד מהחלק התחתון של הבקבוקון.</li>
	<li>הוסף מיד 9 מ"ל של מדיום אלפא-מלאה להשלים כדי להפסיק את הטריסינזציה.</li>
	<li>המשך לסדר את הבקבוקון כדי לקלף את הסדין התאי המונאולייר לחלוטין.</li>
	<li>יוצקים את הגיליון הכולל של התא המצורף לצלחת פטרי עם בינוני.</li>
	<li>השתמש פינצטה סטרילי להרים פינה אחת של גיליון התא ולסובב בכיוון השעון עבור 15 פעמים.</li>
	<li>תרימי קצה אחר של גיליון התא ולסובב בכיוון נגד כיוון השעון עבור 10 פעמים כדי ליצור בחוזקה גיד-כמו בניית מבחנה (איור 1A).</li>
</ol>6. הרכבת היחידה-מתיחה מורכבת גירוי מכני ביוריאקטור ייחודי מעוצב
הערה: בצע את כל השלבים במכסה הביובטיחות סטרילי.
<ol><li>לחבר את ווים על ידי החיבור ולהתאים את המרחק הרצוי (2 ס מ) בין שני קרסים.</li>
	<li>בעדינות רוח 3D TDSCs לבנות על קרס מורכב 3 פעמים על כל וו (איור 1B).</li>
	<li>אבטח את הקרסים עם התא לבנות על החדר של ביוריאקטור חקן על ידי הידוק הברגים על שני הקצוות. הערה: החדר כולו, כולל ברגים וקרסים, הוא סטרילי (החיטוי עבור 1.5 h ב 134 ° צ' וקרני אולטרה סגול (UV) לחשוף 24 שעות לפני השימוש). עבור מחזיק המתכת של התאים, אור UV לחשוף עבור 48 שעות לפני השימוש.</li>
	<li>תמלא את החדר עם. מדיום אלפא-מושלם</li>
	<li>חבר את המפעיל לחדר התרבות באמצעות כבל.</li>
	<li>חותכים את הקרסים מחובר על ידי מספריים סטרילי.</li>
	<li>הפעל את העוצמה ואת בקר הערוץ המקביל להתחיל גירוי מכני.</li>
	<li>. שים את המכסה על החדר</li>
	<li>בדוק את נוריות החיווי וודא שהbioreשחקן יכול לתפקד כראוי.</li>
	<li>לשים את ביוריאקטור חקן בחממה ואת נושא תא תלת-ממד מתיחה מכני עבור 6 ימים (6% מתיחה, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה).</li>
</ol>7. הערכת גירוי מכני ברקמות כמו גיד מבחנה
<ol><li>שחרר את הברגים על-ידי מברג והכנס את ההרכבה בזהירות.</li>
	<li>שים את הרקמה כמו גיד לתוך 4% פאראפורמלדהיד עבור קיבוע עבור 15 דקות.</li>
	<li>מניחים את הרקמה כמו גיד קבוע לתוך קלטת ביופסיה עם מגיני קצף ביופסיה.</li>
	<li>תהליך כדי להסודה את המדגם ולבסוף להעריך על ידי כתמים היסטולוגית H & E.</li>
	<li>חזור על הפרוטוקול כולו ולחלץ RNA מן הרקמה כמו גיד להערכת הביטוי של סמנים tenogenic על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). התחל עבור הגנים שנבחרו מפורטים בטבלה 1. הערה: פרוטוקול היסטולוגיה ופרוטוקול qPCR הם סטנדרטיים ובעקבות מחקר קודם21.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

. הגיד הוא רקמת חיבור סיבי מכונאי על פי המחקר הקודם, הטעינה מכני עודף עלול להוביל הבידול אוסטגניים של תאי גזע גיד, בעוד טעינה מספקת יוביל מבנה סיבים מחוסר סדר קולגן במהלך בידול הגיד21.
השקפה משותפת היא כי המפתח ביוריאקטור אידיאלי הוא היכולת לדמות את הסביבה מיקרו מבחנה תאית תאים בvivo עוברים. לכן, לחקות את הסביבה vivo הלחץ הרגיל בתוך מבחנה הוא המפתח של עירור הבדל יחיד השושלת של TDSCs לתוך תאים גיד. בפרוטוקול הנוכחי, רוחב המבנה TDSC היה 2 ס"מ, ואת טווח התנועה של וו היה 0....

טדינפתיה היא אחת מפציעות הספורט השכיחות. הוא מתבטא בעיקר על ידי כאב, נפיחות מקומית, הופחת מתח שרירים באזור המושפע, ותפקוד לקוי. השכיחות של הטדינופתיה הוא גבוה. הנוכחות של אכילס טאננופתיה היא הנפוצה ביותר עבור רצים באמצע ובמרחק ארוך (עד 29%), בעוד הנוכחות של הפצ'יני טאננופתיה הוא גם גבוה בספורטאים של כדורעף (45%), כדורסל (32%), מסלול ושדה4,5(23%), כדוריד(15%),וכדורגל(13%),2,,3, עם זאת, בשל יכולת הריפוי העצמי המוגבלת של הגיד, והיעדר טיפולים יעילים, הטדינפתיה עדיין משפיע על החיים של המטופלים באופן שלילי6,7. יתר על כן, הפתוגנזה של טדינופתיה נשאר ברור. היו חקירות רבות על הפתוגנזה שלה, בעיקר כולל "תורת הדלקות", "תורת הניוון", "תאוריית שימוש יתר", וכן הלאה8. כיום, חוקרים רבים האמינו כי tendinopathy היתה בשל התיקון העצמי כישלון לפציעות מיקרו מוגברת שנגרמו על ידי מכני מוגזם טוען את חווה9,10.
בתאי גזע נגזר של גיד (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של tendinopathy ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטאננופתיה11,12,13. זה דווח כי גירוי מכני הלחץ יכול לגרום התפשטות והבידול של אוסטאופציטים, אוסטאופתית, תאי שריר החלקה, השרירים, בתאי גזע mesenchymal ותאים אחרים רגישים כוח14,15,16,17,18. לפיכך, TDSCs, כאחד התאים המכניים והחזקים ביותר, ניתן בדומה לגירוי להבדיל19באמצעות טעינהמכנית 19,20.
עם זאת, פרמטרים שונים של טעינה מכנית (כוח טעינת, תדירות טעינת, סוג טעינה ותקופת טעינה) יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים21. לכן, משטר העמסה אפקטיבי ותקף מכני הוא משמעותי מאוד עבור tenogenesis. יתר על כן, ישנם סוגים שונים של ריאקטורים כמו מערכות גירוי המשמשים כיום לאספקת העמסה מכני TDSCs. העקרונות של כל סוג של ביוריאקטור חקן הם שונים, כך הפרמטרים ההעמסה מכני המתאימים ביוריאקטורים שונים הם גם שונים. לכן, פרוטוקול גירוי פשוט, כלכלי ומתכלה הוא ביקוש, כולל סוג הביוריאקטור, מדיום הגירוי המקביל ומשטר ההעמסה המכני.
המאמר הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל רקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית התא, הרכבה של מתיחה מכני מערכת גירוי מכאני, והערכה של גירוי מכני ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות כדי להשיג את המבנה תא תלת-ממד, אשר הרבה פחות מאשר כמה שיטות קיימות22,23. הפרוטוקול הנוכחי הוכח להיות מסוגל לגרום TDSCs להבדיל רקמת גיד, וזה יותר אמין מאשר דו מימדי הנוכחי בשימוש דו-ממדי (2D) מערכת מתיחה21. האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. בקיצור, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

<table><tbody><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>PHR1008-2G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco&auml; מאת Life Technologies</td><td>מעבד</td> היסטולוגיה 1908361 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (אלפא-MEM)</td><td>Gibco&auml; מאת Life Technologies</td><td>2003802</td><td></td></tr><tr><td>תאי</td><td></td><td></td> <td>גזע שמקורם בגיד עכברמבודד מגידי אכילס של עכברי C57BL/6 בני 6 עד 8 שבועות. לאחר מכן עוכל עם קולגנאז מסוג I (3 מ"ג/מ"ל; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) למשך 3 שעות ועבר דרך מסננת תא 70 כדי להניב תרחיפים חד-תאיים.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>תערובת סטרפטומיצין ופניצילין</td><td>Gibco&auml; by Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ביו-ריאקטור לגירוי מכני חד-צירי תלת מימדי</td><td>המרכז למחקר תרגומי אורתופדי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת מערב אוסטרליה</td><td></td><td>זמין מהמחבר המקביל על פי בקשה. או להכין אותו לפי העיצוב שלנו* *וואנג טי, לין זי, דיי רה ואחרים. גירוי מכני הניתן לתכנות משפיע על הומאוסטזיס גידים במערכת ביו-ריאקטור. ביוטכנולוגיה ביואנג. 2013; 110(5):1495&ndash;1507. doi:10.1002/bit.24809</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco&auml; מאת Life Technologies</td><td>1858331</td><td></td></tr></tbody></table>

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

טדינופתיה היא מחלת גיד כרונית נפוצה הנוגעת לדלקת וניוון באזור אורתופדיות. עם תחלואה גבוהה, יכולת לתיקון עצמי מוגבל, והכי חשוב, אין טיפולים מוחלט, הטדינפתיה עדיין משפיע על איכות החיים של המטופלים שלילית. גיד-בתאי גזע נגזר (TDSCs), כמו התאים הראשוניים העיקרי של תאים גיד, לשחק תפקיד חיוני הן בפיתוח של הטדינפתיה, ושחזור פונקציונלי ומבניים לאחר הטנופתיה. כך, שיטה שיכולה בתוך מבחנה לחקות את הבידול vivo של TDSCs לתוך תאים גיד יהיה שימושי. כאן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המבוססת על תלת מימדי (3D) מערכת מתיחה uniaxial כדי לעורר את TDSCs להבדיל לרקמות כמו גיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי: בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת התרבות גירוי בינונית עבור היווצרות הגיליון התא, גיליון התא היווצרות על-ידי culturing במדיום גירוי, הכנת תא גזע 3D בניית תאים, הרכבה של מתיחה uniaxial מותח מורכב גירוי מכני, הערכה של האפקטיביות הוכח על ידי היסטולוגיה. ההליך כולו לוקח פחות מ 3 שבועות. כדי לקדם את התצהיר של מטריקס מטריתאי, 4.4 mg/mL חומצה אסקורבית שימש במדיום תרבות גירוי. חדר מופרד עם מנוע לינארי מספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד ומותאם בקלות, אשר מוחל על הביוריאקטור. משטר ההעמסה בפרוטוקול הנוכחי היה 6% זן, 0.25 Hz, 8 h, ואחריו 16 h מנוחה עבור 6 ימים. פרוטוקול זה יכול לחקות בידול התא בגיד, אשר מועיל לחקירה של התהליך הפתולוגי של הטדינופתיה. יתר על כן, הרקמה כמו גיד משמש פוטנציאל לקדם ריפוי גיד בפגיעת גיד כשתל אוטוולוגי הנדסה. כדי לסכם, הפרוטוקול הנוכחי הוא פשוט, כלכלי, מתוכולל ותקף.

לפני גירוי מכני, TDSCs גדלו ל-100% המפגש במדיום המלא והציג מורפולוגיה בעלת מבנה לא מאורגנת (איור 2A). לאחר 6 ימים של מתיחה uniaxial העמסה טעינה מכנית, מטריצה החילוץ (ECM) ו התאים להתאים היו היטב (איור 2B). תאים היו מאוכלסים היטב העטוף ECM לאחר טעינת מכני. מורפולוגיה התא הוצגה להיות מוארך היה דומה יותר לתא גיד נורמלי לעומת אחד ללא מתיחה (איור 2C). צפיפות התא בבניית תאים עם טעינה היתה גבוהה יותר מאשר באחד ללא טעינה. תוצאות ה-QPCR הראו כי השיטה הנוכחית הגבירה את ביטוי הסמני...

תלת-מימדי גירוי מכני מכאני מערכת ביוריאקטור הוא ביווריקטור אידיאלי עבור הבחנה מסוימת של הבידול בתאי גזע הנגזר גיד והיווצרות גיד ניאו.

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

פרמטרי טעינה מכניים שונים עלולים לגרום לתאי STEM הנגזרים מגידים להבדיל לתאים שונים. אנו מציגים תהליך מפורט של החלת מערכת ביו-ריאקטור גירוי מכני תלת מימדי זה כדי לגרום בידול טנוגני של תאי STEM שמקורם בגיד. טנדינופתיה היא אחת מפציעות הספורט הנפוצות במחלקה האורתופדית.הנוכחות של נטיות אכילס שכיחה ביותר עם עד 29% עבור רצים באמצע ובזמן רב, בעוד הנוכחות של נטינופתיה פתלה הוא גם גבוה ספורטאים של כדורעף, כדורסל, מסלול ומגרש, כדוריד, וכדורגל. עם זאת, בשל יכולת ריפוי עצמית מוגבלת של גיד וחוסר טיפול יעיל, גיד עדיין יש השפעה שלילית משמעותית על איכות החיים של חולים. תאי STEM שמקורם בגיד, הידועים בשם TDSCs כתאי מבשר חשובים של תאי גידים, ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות נטינופתיה, כמו גם בשיקום התפקודי והמבני שלהם לאחר גידים.עם זאת שונה פרמטרי טעינה מכניים, כגון עומס מתח, תדירות טעינה, סוג טעינה, ות תקופת טעינה יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים. לכן, משטר טעינה מכני יעיל ותקף הוא משמעותי מאוד עבור בראשית הגיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי, כולל בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת תרבות גירוי בינוני להיווצרות גיליון התא, היווצרות גיליון התא על ידי culturing בינוני גירוי, הכנת מבנה תאי STEM גיד 3D, הרכבה של תאים יוניאקסיאליים מתיחת קומפלקס גירוי מכני, והערכת מכני מגורה ברקמה דמוית גיד גידים.בידוד של עכברים TDSCs. משמש בעכברים כי הם שישה עד שמונה שבועות עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם. גידים פאטלה קציר וגידים אכילס.לעכל גיד עם שישה מיליליטר סוג 1 קולגן במשך שלוש שעות. לאסוף את התאים ולתרבות אותו MEM אלפא מלא המכיל 10% של FBS ו 1% של תערובת סטרפטומיצין ופניסילין במשך שבעה ימים. זהה TDSCs באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות לפי ציטומטריית זרימה, ביטוי של סמני משטח תאים, כולל CD44, CD90 ו- Sca-1.אין את הביטוי של CD34 ו- CD45. מעבר והקפאת תאים. תאים מעבר ישמשו לצעדים נוספים.תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs. קח את העכברים מחוממים גיד תאי STEM. לאט להוסיף עוד ארבעה עד חמישה מיליליטר של MEM אלפא מלא.מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר על ידי פיפטה. למעלה עם בינוני עד 8 מיליליטר בסך הכל על ידי פיפטה. מניחים את הצינור לתוך צנטריפוגה איזון טוב.תאי צנטריפוגה ב 347 גרם במשך חמש דקות. תוציא צינור מהצנטריפוגה. תבדוק את הכדור בתחתית.דקאנט המדיום החופשי. השהה מחדש תאים בעדינות במדיום שלם של מיליליטר עד אחד עד שני מיליליטר. הימנע עושה בועות רבות מדי.העבר תאים מושעים מחדש לבקבוק T75 על-ידי פיפטה. השתמש פיפטה להוסיף מלא אלפא MEM בינוני לבקבוק כדי להגיע לנפח כולל של 10 מיליליטר עם הריכוז הסופי של 13, 000 תאים לס"מ מרובע. מניחים את הבקבוק באינקובטור ומתרבים אותו ב-37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני.שנה את המדיום כל שלושה ימים. התבונן ונטר את התאים תחת מיקרוסקופ בעת שינוי המדיום עד שתאים תותבו ל- 100%confluence. הכנת תרבות גירוי בינוני להיווצרות יריעות תאים.יוצקים 15 מיליליטר להשלים את מדיום אלפא MEM לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר. מוסיפים שש חומצה אסקורבית מיקרוליטר לתוך 15 מיליליטר בינוני לריכוז הסופי של 4.4 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך למעלה ולמטה.היווצרות גיליון תאים על ידי culturing במדיום גירוי. השלך בזהירות מדיום אלפא MEM שלם לא רגיל. הימנע מנגיעה בתאים המחוברים לתחתית הבקבוק.מוסיפים 10 מיליליטר גירוי בינוני לאט. הימנע מגרימת הפרעה לתאים המבלבלים לחלוטין. תרבו את התאים במדיום הגירוי במשך תשעה ימים ושנה את המדיום כל שלושה ימים כדי ליצור מספיק גיליון תאים ב 37 מעלות עם 5% של פחמן דו חמצני.הכנת מבנה תאי STEM גיד 3D. תוציא את הבקבוק מהאס אינקובטור. השלך את מדיום הגירוי לחלוטין.לשטוף את גיליון תא monolayer עם PBS על ידי מערבולת הבקבוק. השלך את PBS לחלוטין. השתמש פיפטה כדי להוסיף מיליליטר אחד, 0.25% טריפסין לפינת הבקבוק.הקש על הפינה של הבקבוק כדי לנתק את גיליון התא monolayer עד הפינה של גיליון התא שוטף את החלק התחתון של הבקבוק. מיד להוסיף תשעה מיליליטר להשלים אלפא MEM בינוני כדי לעצור את התגובה של טריפסיניזציה. המשך מערבל את הבקבוק כדי לקלף לחלוטין את גיליון התא monolayer.יוצקים את הסכום הכולל כדי לחבר את גיליון התא לתוך צלחת פטרי עם בינוני. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להרים פינה אחת של גיליון התא ולסובב בכיוון השעון במשך 15 פעמים. להרים קצה אחר של גיליון התא ולסובב בכיוון נגד כיוון השעון במשך 10 פעמים כדי לנסח מבנה במבחנה דמוי גיד.הרכבה של קומפלקס גירוי מכני מתיחה uniaxial ב bioreactor מעוצב ייחודי. חבר את הקרסים על-ידי המחבר ולאחר מכן התאם לשני סנטימטרים בין שני ווים. בעדינות רוח TDSCs 3D לבנות על וו הדגמה במשך שלוש פעמים על כל וו.אבטח את הקרסים עם מבנה התא על תא הביוריקטור על ידי הידוק הברגים בשני קצוות. מלאו את התא במדיום אלפא MEM מלא. חבר את המאיץ לתא התרבות באמצעות כבל.חותכים את מחבר הקרסים על-ידי פינצטה סטרילית. הפעל את בקר החשמל והתעלה כדי להתחיל גירוי מכני. שים את המכסה על התא, לעקוב אחר נוריות החיווי, ולהבטיח bioreactor יכול לתפקד כראוי.שים את bioreactor באינקובטור ולחשוף את מבנה התא 3D מתיחה מכנית. משטר ההעמסה הוא 6% זן, תדר הרץ 0.25, שמונה שעות ואחריו מנוחה של 16 שעות במשך שישה ימים. הערכה של רקמה מכנית מגורה במבחנה דמויי גיד.לשחרר את הברגים על ידי מברג ולהוריד את ההרכבה בזהירות. מכניסים את הרקמה דמוית הגיד ל-4%PFA למשך 15 דקות, מכניסים את הרקמה הקבועה דמוית הגיד לקלטת ביופסיה עם ביופסיה של חיות מחמד. תהליך לייבש דגימה.ולבסוף, להעריך על ידי מעמד היסטולוגי HD. חזור על כל הפרוטוקול ולחלץ RNA מן הרקמה דמוית הגיד להערכת הביטוי של סמנים tenogenic על ידי qPCR. לפני גירוי מכני, TDSCs יגדלו ל 100% confluence במדיום מלא ולהציג מורפולוגיה מבנית לא מאורגנת כלפי חוץ.לאחר שישה ימים ראית מתיחות, טעינה מכנית, מטריצה תאית נוספת ויישורי התאים היו אוריינטציה טובה. התאים היו מאוכלסים היטב ועטפו היטב ב- ECM לאחר טעינה מכנית. מורפולוגיה של התא הוצגה להיות ממוקם והיה דומה יותר לתאי גידים נורמליים בהשוואה לזה עם ללא מתיחה.צפיפות התאים בבניית תאים עם טעינה הייתה גבוהה יותר מהצפיפות ללא טעינה. תוצאות qPCR הראו כי הנושאים הנוכחיים הגדילו את הביטוי של סמנים tenogenic, כולל scleraxis, מוהוק, tenomodulin, ו קולגן מסוג 1 לעומת אלה שטופלו על ידי התרבות המוצהרת. במונחים של מערכת bioreactor גירוי מכני, תא מופרד עם מנוע ליניארי שימש בפרוטוקול הנוכחי שלנו.מכיוון שהוא יכול לספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד וקל לתנוכה בהשוואה לאופן שבו גיליון התאים הדו-מימדי המסורתי והמתיחה הדו-מרחבית, מבנה התאים תלת-מימדיים דומה יותר לצורה האמיתית של הגיד. והמתיחה יוניאקסיאלית דומה יותר למאפייני החוזקות של תאי הגיד. זה מספק בסיס תיאורטי של שימוש במערכת 3D uniaxial מתוח כדי לעורר את ההידול של TDSCs.לפיכך, גיליון תא דו-מימדי נותב לבסוף לתוך מבנה תא תלת-מימדי ועבר ניתוח חד-קרן בפרוטוקול הנוכחי. על פי מערכת הביו-ריאה שלנו, משטר הטעינה שלנו הוא 6% זן, תדר הרץ 0.25, שמונה שעות ואחריו מנוחה של 16 שעות במשך שישה ימים. לבסוף, האפקטיביות של הפרוטוקול הוכח על ידי מורפולוגיה ואת רמת הביטוי של סמנים tenogenic.תהליך הפעולה כולו הוא פשוט, אבל המפעיל צריך להיות שם לב כדי לשמור על הסביבה של TDSC מעוקר בכל עת. ישנם יישומים רבים של הפרוטוקול שלנו. התהליך של גירוי TDSCs לחקות התברואה ב vivo הוא מועיל לחקירה של תהליך פתולוגי של גידים.חוץ מזה, פרוטוקול זה מספק שיטה לשחזור עבור בידול מכוון של TDSCs לתוך רקמה דמוית גיד. אז זה יכול לשמש בפשטות וביעילות עבור תרבות גידים מהונדסים פוטנציאליים. לסיכום, החלת מערכת ביוריאקטור גירוי מכני Uniaxial 3D היא פשוטה, כלכלית, ניתנת לשחזור, ושיטה תקפה כדי לגרום בידול tenogenic של TDSCs.הפרוטוקול שלנו מספק את כל התהליך בפרטים.

applying-three-dimensional-uniaxial-mechanical-stimulation-bioreactor

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הוא הבין נרחב כי כוחות מכניים בגוף יכול להשפיע על התמיינות תאים ושגשוגם. כאן אנו מציגים פרוטוקול וידאו הממחיש את השימוש bioreactor שהותקן עבור אספקת המתח uniaxial מתיחה מחזורית לתאי גזע בתרבית על מצעים גמישים micropatterned.

גירוי מכני של גזע תאים באמצעות מסננים uniaxial מחזורי

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.

יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי

כאן, אנו מציגים מערכת מודל אסמבלואיד המחקה את ההצלבה התאית של הגידים בין רקמת הליבה של הגיד נושא העומס לבין תא חיצוני המכיל אוכלוסיות תאים המופעלות על ידי מחלה ופציעה. כמקרה שימוש חשוב, אנו מדגימים כיצד ניתן לפרוס את המערכת כדי לחקור הפעלה רלוונטית למחלה של תאי אנדותל חיצוניים.

הנדסת מכלולי גידים לבדיקת הצלבה תאית במחלה ותיקון

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

גירוי מגנטי Transcranial (TMS) הוא כלי פולשני לקבל תובנות על הפיזיולוגיה והתפקוד של מערכת העצבים האנושית. כאן, אנו מציגים טכניקות TMS שלנו ללמוד רגישות קליפת המוח של הגפה העליונה שרירי הגב התחתון.

ניצול גירוי מגנטי Transcranial לחקר מערכת Neuromuscular האדם

השיטה מתוארת בידוד ואפיון של תאי גזע אנושיים שיניים זולות (hDPSCs) באמצעות...

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

אנו חוקרים את השימוש בגירוי מגנטי Transcranial חוזר על עצמו (rTMS) כדי לשפר את יכולות שפה בחולים עם שבץ כרוני ואפזיה שאינם שוטפת. לאחר זיהוי אתר ברכס החזיתי הנכון עבור כל מטופל שמגיב בצורה אופטימלית לגירוי, אנחנו למקד את האתר הזה בעשרת ימים של טיפול rTMS.

ניצול גירוי מגנטי Transcranial חוזר כדי לשפר את תפקוד שפה בחולי שבץ עם אפזיה ללא רהוטה הכרונית

בשיטות סטנדרטיות תרבות תאים נלקחים מתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם וגדלו על משטח הפלסטיק של מנה. כדי לחקור את התנהגותם של תאים במח עצם אנושיים ראשוניים שיצרנו מערכת תרבות 3-D בו תאים גדלים בתנאים משחזרים microenvironment יליד הרקמות.

דגם תרבות רקמות תלת ממדי למחקר עיקרי עצם אדם מח וממאיר שלו

למדו כיצד להפעיל גירוי מכני תלת-ממדי בביוריאקטור כדי לגרום לבידול טנוגני של תאי גזע מגידים (TDSCs). שיטה זו מסייעת בחקר טיפולים חדשים לטנדינופתיה ושיקום גידים.

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

גלה סרטונים נוספים