דיגום וטיפוח בצורה מפושטת של לאראקא הקוסמופוליטן, אויקולאורה דיואיקה
16 ביוני 2020
דיוקולורה היא אורגניזם מודל מטונלי בתחומי הביולוגיה השונים. אנו מתארים שיטות דגימה, זיהוי מינים, התקנת culturing, ו culturing פרוטוקולים עבור בעלי חיים והזנה פריחת אצות. אנו מדגישים גורמי מפתח שסייעו לחזק את מערכת התרבות ולדון בבעיות וברזולוציות האפשריות.
פרוטוקול זה מדגים באופן חזותי כיצד להקים מערכת תרבות ארוכת טווח ואמינה עבור הטוניקה הפלגית הימית Oikopleura dioica. מערכת התרבות Oikopleura מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של תחומים ביולוגיים הקשורים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה ואבולוציה. למין זה יש מחזור חיים קצר, פליות גבוהה, ו ניתן לאסוף אותו בקלות מהחוף, מה שהופך אותו לאורגניזם מודל מעולה.
למרות פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור O.dioica, אנו מקווים שזה יכול להיות מיושם על אורגניזמים פלנקטוניים אחרים. כדי להתחיל, ליזום מזון אצות כדי לקיים את תרבות Oikopleura, החל autoclaving מי ים מסוננים. כדי ליזום תרבות מלאי של calcitrans Chaetoceros, 60 מילס של מי ים autoclaved היה בתוספת הבאים:30 microliters של ויטמינים, 30 microliters של פתרון A, 15 microliters של נתרן סיליקט, ו 60 microliters של סטרפטומיצין.
לבסוף, 30 מיקרוליטרים של C.calcitrans מתרבות מניות קודמת נוספו כחוסנים. עיין בטבלה השנייה בכתב היד לגבי כרכים של תוספים וחיסון עבור מינים אחרים של אצות וסוגי תרבות. לאחר החיסון, המניות ותת-התת-תתיים נשמרים באינקובטור ב-17 מעלות צלזיוס עם תאורה רציפה.
לאחר כ 10 ימים, צמיחת אצות מאושר על ידי flasks להיות צבעוני. כאשר זה קורה, להעביר את תרבות המניות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס עד חודש תוך שמירה על תת התרבות באותו אינקובטור. כדי ליצור תרבות עבודה, להוסיף תוספי מזון הדרושים 400 מיל של מי ים autoclaved לחסן עם 100 mils של תת התרבות הקודמת.
לאטום את הבקבוק עם כובע גומי, להכניס אחד מיליון, פיפטה חד פעמית, ולהעביר אותם לתחנת אצות ולשמור אותם בטמפרטורת החדר עם photoperiod שמונה שעות ו aeration מתמיד. באופן ידני מערבולת תרבויות אצות פעמיים ביום כדי למנוע צבירה בתחתית הבקבוק. לאחר הקמת תרבויות האצות, לאסוף דגימות שדה באתר מקומי.
השליכו רשת פלנקטון, ואפשרו לקצה בקלה לשקוע מטר עד שני מטרים מתחת לפני השטח. לירות את הרשת במהירות של כ 5 עד 1 מטרים לשנייה. ממשיכים להתריע הלוך ושוב בין שתיים לחמש דקות.
זמן הגרירה צריך להיות מותאם על פי שפע פלנקטון באתר. לאחר ההתרנגות, יש להרים בזהירות את הרשת ולהעביר באיטיות את תכולת קצה בקלה לבקבוק זכוכית של 500 מ"מ. ממלאים את הבקבוק בשוליים כדי למנוע בועות אוויר שיכולות לגרום ללחץ על בעלי החיים במהלך ההובלה.
בשלב זה, נוכחותו של Oikopleura ניתן לאשר על ידי צפייה בקבוקי מדגם על רקע כהה. עם זאת, נדרשת תצפית מיקרוסקופית לזיהוי ברמת המינים. חזור על תהליך זה עד שלושה בקבוקים 500-mil נאספו.
לאסוף מי ים פני השטח כדי לתעד מליחות, טמפרטורה, וריכוז כלורופיל עם profiler CTD. בנוסף, לאסוף 10 עד 15 ליטר של מי ים באתר כדי לעזור להתאקלם בעלי החיים לתנאי מעבדה. כדי להתאקלם בבעלי החיים, הכינו יחס של אחד לאחד של מי ים עיליים מאתר הדגימה ומי ים מסוננים המתוחזקים במעבדה.
הנפח הסופי צריך להיות מותאם בין חמישה ל 10 ליטר, בהתאם לריכוז של מדגם פלנקטון. הוסיפו בזהירות את דגימת ה-500 מ"מ לסק המוכן. באמצעות משוט המחובר למנוע סינכרוני המסתובב ב-15 סל"ד, השאר את פלנקטון בהשעיה למשך הלילה.
למחרת בבוקר, לבדוק את נוכחותו של Oikopleura בעין. מעבירים את בעלי החיים לצלחת פטרי, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ שדה כהה שנקבע בין הגדלה 20 עד 40 פעמים לזיהוי חיובי. Oikopleura מאופיינים כחיות בצורת ראשן המחשוף את זנבותיהם בתוך בית שקוף.
כדי לאשר O.dioica, לחפש זכרים בוגרים לחלוטין עם גונאדים צהובים או נקבות עם ביצים. אם החיות לא בשלות, חפשו נוכחות של שני תאים תת-סדריים בחצי הדיסטלי של הזנב. אלה קיימים הן בבעלי חיים בוגרים והן בבעלי חיים לא בוגרים.
ברגע שהמין מאושר, להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה. חזור על תהליך זה עד 10 עד 20 אנשים אושרו ברמת המינים. אם לא נמצא O.dioica, לשמור על המקה ערבוב במשך יום או יומיים נוספים.
O.dioica קטן שלא היו ניתנים לצפייה בתחילה ימשיך לגדול ולהיות קל יותר לראות. אם אף אחד מהם אינו מופיע לאחר שבוע, בטל את הדגימה ונסה שוב לדגום. על מנת להקים מונוקולטורה, לבודד 120 O.dioica מדגם שדה בחמישה ליטרים של מי ים מסוננים.
למחרת בבוקר, חפש זכרים בוגרים לחלוטין שזוהו על ידי גונאדים צהובים ולנקבות עם ביצים המופיעות כעולמות זהובים מנצנצים. הכן מקור להשריץ על ידי העברה עדין של 15 זכרים ו -30 נקבות עם פיפטה 5 מ"מ, קהה סוף למזימה המכילה 2.5 ליטר מי ים מסוננים. כדי למזער את הלחץ הפיזי במהלך ההעברה הידנית, שחררו באיטיות את בעלי החיים מתחת לפני השטח של מי הים החדשים.
אפשר למבוגרים מבודדים להשריץ באופן טבעי. לאחר ההשרצתה, הפריה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי חילוץ חמישה עד 10 מיל של מי ים מתחתית הקוסם להשריץ וזיהוי ביצים עם מחשוף תחת מיקרוסקופ. בבוקר הראשון לאחר ההשרתה, היום הראשון, דור חדש של בעלי חיים צעירים עם בתים מנופחים צריך להופיע במזווה.
השתמש ב-500 מ"ל, כף יד, כדי להעביר בעדינות בעלי חיים לסק חדש המכיל 7.5 ליטר מי ים טריים ומסוננים. יוצקים לאט את התוכן על פני השטח כדי למזער את המערבולות ולהסיר כוחות. בבוקר השני לאחר ההשרצות, היום השני, להעביר באופן ידני 150 בעלי חיים למזווה חדש המכיל חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים.
בבוקר השלישי שלאחר ההשרצות, היום השלישי, מעבירים ידנית 120 בעלי חיים למזנון חדש עם חמישה ליטרים של מי ים טריים ומסוננים. עד היום הרביעי, בוגר מינית, בעלי חיים בוגרים צריכים להיות נוכחים. לאסוף 15 זכרים ו 30 נקבות עבור מקור הוליד חדש עם 2.5 ליטרים של מי ים מסוננים ליזום את הדור הבא.
תהליך זה חוזר ומתוחזק על חיי התרבות. על מנת לשמור על מונוקולטורה של O.dioica, מזון אצות מוכן מדי יום מתרבויות עבודה. בעלי החיים ניזונים שלוש פעמים ביום.
הכן מזון יומי על ידי מדידת ספיגת תרבות העבודה באמצעות ספקטרופוטומטר שנקבע על 660 ננומטר. ערכי ספיגה, נפחי תרבות O.dioica היעד, ובגרות בעלי חיים ממוקמים לתוך גיליון אלקטרוני מוכן המבוסס על עקומת צמיחה אצות שנקבעו בעבר כדי לחשב את הנפח המדויק של אצות הנדרש להאכלת היום. פיפטה את הנפחים המחושבים לצינורות 50 מ"מ, וצנטריפוגה ב 5, 000g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאט לאט לשפוך את על טבעי, בזהירות פיפטה למעלה ולמטה כדי לעכל את האצות גלולה. מילוי הצינורות לנפח המקורי שלהם עם מי ים טריים ומסוננים. בהתבסס על תרשים האכלת האצות היומי מהגיליון האלקטרוני, הזן את הכמות שצוינה לכל מקור בשעה 9 בבוקר.m.
12 אחה.m ו-17:.m. ניתן להגדיר משאבת מנון אוטומטית כדי להאכיל את בעלי החיים בשעה 17:.m.
בסופי שבוע ללא נוכחות של צוות culturing. לאחר כל האכלה, לשמור על מזון אצות מוכן בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשמש להזנה הבאה. O.dioica ניתן לאסוף מנמל על ידי גרירה עדינה של רשת פלנקטון שונה מצויד רשת 100 מיקרון וסוף בקלה ללא סינון.
הדגימה בין 2015 ל -19 הראתה שונות עונתית בנוכחות O.dioica בנמלי אוקינאווה. נראה כי טמפרטורת מי הים השפיעה על נוכחותם של בעלי החיים. O.dioica שלט כאשר טמפרטורת מי הים פני השטח היה 28 מעלות ומעלה.
O.dioica בשיתוף פעולה עם Oikopleura longicauda בטמפרטורות שבין 24 ל -27 מעלות. עם זאת, O.longicauda שלט בטמפרטורות מתחת 23 מעלות. שינויים במליחות לא לתאם עם השפע של O.dioica.
שלושת הגורמים החשובים ביותר להקמת מערכות תרבות יציבות של O.dioica הם שמירה על איכות מים גבוהה עם מערכת סינון רב-שלבית, זיהוי משטר הזנה אופטימלי, רצוי על ידי יצירת עקומות תקן אצות, והכנת מקורים הולידו עם מספר מספיק של זכרים ונקבות. בעקבות הפרוטוקול שסופק, מחזור החיים של O.dioica הוא ארבעה ימים ב 23 מעלות. הקמנו באופן אמין שש אוכלוסיות עצמאיות של או.דיויקה, כולן נמשכו יותר מ-20 דורות.
לסיכום, הקמת תרבות יציבה של O.dioica יכולה להיעשות במהירות וחסכונית. עם התקנה נכונה, תרבות יציבה יכולה להיות מושגת בתוך שבוע. בשילוב עם הגנום הקטן שלה ומ מחזור החיים המהיר, זה הופך את O.dioica למין מודל אקורדט רב עוצמה.
ניתן לשמור על O.dioica במי ים מלאכותיים וטבעיים. אחסון ארוך טווח של מזון אצות אפשרי באמצעות תרבות מוצקה והקפאה. בנוסף, זרע O.dioica יכול גם להיות cryopreserved ולהישאר קיימא במשך יותר משנה.
O.dioica ממשיך לספק תובנות רבות עוצמה לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של עונתיות מקומית, מערכת תרבות קפדנית, וכמה אנשים מסורים מאפשרים ליצור תרבות יעילה במאמץ מועט.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את הקמתה של מערכת תרבית מהימנה עבור התוניקטה הימית Oikopleura dioica, המשמשת כאורגניזם מודל למחקרים ביולוגיים שונים. הוא סוקר שיטות דגימה, זיהוי מינים ופרוטוקולי תרבית, תוך דגש על גורמי מפתח לתחזוקה מוצלחת של התרבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה ימית
- אקולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- Oikopleura dioica הוא טוניקט עם מחזור חיים קצר ופריון גבוה.
- ניתן לאסוף אותו בקלות מסביבות חופיות.
- מין זה משמש כמודל מצוין לחקר תהליכים ביולוגיים שונים.
- פרוטוקולים מותאמים עשויים להועיל לאורגניזמים פלנקטוניים אחרים.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לגידול של Oikopleura dioica.
- להקל על מחקרים באקולוגיה, התפתחות, גנומיקה ואבולוציה.
- להעמיק את ההבנה של מערכות גידול עבור אורגניזמים ימיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מזון אצות באמצעות מי ים שעברו עיקור באוטוקלב ותוספים ספציפיים.
- איסוף דגימות שטח באמצעות רשתות פלנקטון.
- זיהוי מיקרוסקופי של *Oikopleura dioica*.
- הקמת מונו-קלטורות באמצעות פרוטוקולי העברה והדגיה קפדניים.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של מערכת תרבית ארוכת טווח עבור Oikopleura dioica.
- שיטות זיהוי אישרו את נוכחות המין ואת שלב הבגרות.
- פותחו פרוטוקולים להשראה ושמירה על התרביות.
- סופקו הנחיות לאקלימטיזציה ותחזוקת התרבית.
מסקנות
- המחקר מציג גישה מקיפה לגידול של Oikopleura dioica.
- ניתן ליישם את הממצאים על מינים פלנקטוניים אחרים.
- הקמת מערכות גידול אמינות היא קריטית למחקר ביולוגי עתידי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקמה של מערכות תרבית אמינות עבור אורגניזמי מודל ימיים כגון Oikopleura dioica תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי בביופארמה. מחזור החיים המהיר של המין, נתיבי הפיתוח השמורים והנגישות הגנומית מאפשרים סריקת פנוטיפ בסריקה גבוהה ומחקרי ביומרקרים תרגומיים. זרימה זו מספקת פלטפורמה ניתנת לשכפול ולהרחבה להערכת השפעות של תרכובות במערכת הרלוונטית למחלה, ובכך היא מפחיתה את אי-הוודאות הביולוגית לפני אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולי התפתחות ושבקי בקרה גנטית שמורים בחבליים, הרלוונטיים למנגנונים של מחלות אנוש.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות פנוטיפויזציה מהירה של הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות בהקשר של אורגניזם שלם.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קישור של מודולציית מטרה לתוצרי התפתחות או התנהגות ניתנים לצפייה במודל שניתן לטיפול גנטי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מספקת מערכת ביולוגית סטנדרטית וכמותית להכנת פלטות לסריקת תרכובות עם שלבי התפתחות עקביים.
- قابיליות הרחבה (Scalability): פוריות גבוהה והפריה חיצונית מאפשרות איסוף עובריים בהיקף רחב עבור בדיקות פנוטיפיות המבוססות על פלטות רב-בארים.
- שחזוריות: משטרי הזנה מוגדרים ובקרות סביבתיות מפחיתים את השונות, ובכך תומכים בסטנדרטיזציה של הבדיקה בין צוותים ואתרים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מסלולי אפוप्टוזיס, מטבוליזם ואיתות שמורים מאפשרים מידול של פנוטיפים של מחלות אנוש לצורך אישור מטרה.
- המשכיות תרגומית: תומך במעבר מתיקוף פגיעה במטרה לבדיקות יעילות פרה-קליניות במערכת של חרשוניים באמצעות כלים גנומיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הערכה מוקדמת של רעילות התרכובת ומנגנון הפעולה, ובכך מספק מידע להחלטות המשך או הפסקה (go/no-go) לפני מחקרים ביונקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מערכת הגידול של Oikopleura dioica משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם, ותומכת בתיקוף מטרות באמצעות סריקה פנוטיפית ומעקב מכניסטי לפני זיהוי מובילים ופיתוח פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי תפקוד גנים ופעילות של מסלולים באמצעות פנוטיפים ניתנים לצפייה במודל חי של חרשוניים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות בעלות תוכן גבוה, כגון מורפולוגיה, ניידות ומדווחים פלואורסצנטיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בדימות Time-lapse, בניתוח תמונות אוטומטי ובהשוואה סטטיסטית בין אוכלוסיות מטופלות לאוכלוסיות בקרה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים ראשוניים של מנגנון פעולה לאימות פרה-קליני באמצעות מסלולים שמורים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת משאב ביולוגי מתחדש ודל-תחזוקה עבור קמפיינים חוזרים של סריקה ופרויקטים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במודל של חרבון (chordate) הנגיש גנטית.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים להאכלה, השבחה ותחזוקת תרביות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות של go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון המבוסס על תיקוף פנוטיפי במערכת של אורגניזם שלם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול בעלי חולרים ימיים, במיקרוסקופיה ובטכניקות לתרבית אצות.
- נדרש גישה למדגרות, לספקטרופוטומטרים לצורך כימות אצות, ולמערכות סינון סטריליות להכנת מי הים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של לוחות הזמנים להאכלה, בקרות סביבתיות ונהלי טיפול בבעלי חיים.
- כולל שיקולי התאמה עבור נקודות סיום ניסיוניות שונות, כגון דימות פלואורסצנציה או בדיקות התנהגותיות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זמינות עונתית בדגימה מהשטח והצורך בייצור רציף של מזון מבוסס אצות.
