מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

הפרוטוקול הנוכחי מנתח שיטה משתלמת ופשוטה למעקב נוירו-אנטומי ואלקטרופיזיולוגי משולב של מעגלים עצביים in vivo. הטכניקה מאפשרת מיפוי של מסופים נלווים מאוכלוסיית נוירונים ספציפית לאתר יעד. כמו כן, ניתן לאמת את המפה האנטומית של מסופים אלה על ידי גירוי אופטוגנטי במהלך הקלטה חוץ-תאית באתר היעד.

ניתן ליישם פרוטוקול זה לחקר מעגלים עצביים מרובים הקשורים לתפקוד חושי, מוטורי וקוגניטיבי. ביצוע הליך זה דורש ידע מסוים בניתוחים סטריאוטקסיים של מכרסמים וטיפול באלקטרודות עצביות עדינות. חיבור מערכת ההקלטה למניעת רעש בהקלטות.

הדגמה חזותית מדגישה את השלבים הבסיסיים בהקמת מערכת LED במחיר סביר עבור אופטוגנטיקה in vivo. כמו כן, הוא מראה כיצד לחבר את המגבר עם דרייבר ה-LED להקלטה וגירוי מסונכרנים בעכבר מורדם. הנח כרית חימום על המסגרת הסטריאוטקסית כך שגוף העכבר שוכב עליה מה שיעזור לשמור על טמפרטורת גופו לאורך כל ההליך, ולאחר מכן קבע בעדינות את הראש על המנגנון הסטריאוטקסי.

הכן את אזור הניתוח על ידי ניקויו תחילה בתמיסת יוד ולאחר מכן באלכוהול להסרת היוד. לאחר מכן, מרחו לידוקאין מקומי כדי לחסום את התחושה בקרקפת. לאחר מכן, בעזרת אזמל, בצע חתך בקו האמצע המשתרע מהחזית לאזור העורף.

עבור אזור טגמנטלי גחוני או הזרקת VTA, מקם מזרק מחט קהה דק במיוחד בקואורדינטות שליליות של 3.08 מילימטר אחורי קדמי ו-0.5 מילימטר לרוחב מדיאלי ביחס לברגמה. השתמש בכלי קידוח כדי לקדוח חור של מילימטר אחד בגולגולת בקואורדינטה המסומנת. עקוב אחר הוראות היצרן כדי לקבע את מחזיק המזרק על מיקרומניפולטור ומלא את המזרק במים מזוקקים כפולים כדי לנקות ולבדוק את זרימת הנוזל.

לאחר מכן הוציאו את המים כדי לבדוק את זרימת המזרק. הפשירו כמויות של נגיף הקשור לאדנו או קוקטייל AAV על קרח. מלאו את המזרק המותקן ב-1,000 ננוליטר של תמיסת AAV והוציאו 10 ננוליטר מהתמיסה כדי לאשר את זרימת הנוזל.

השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את המחט לאתר ההזרקה ולהזריק 600 עד 800 ננוליטר AAV לתוך ה-VTA, ולספק את התמיסה במהירות של 60 ננוליטר לדקה. שלושה שבועות לאחר הזרקת ה-AAV, הצמידו את ראש החיה למסגרת סטריאוטקטית כפי שתואר קודם לכן ובצעו כריתת גולגולת כדי לחשוף את הדורה. השתמש בכלי קידוח כדי להסיר חלק מהעצם הקודקודית.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בקצה מחט כפוף בקוטר 27 כדי לכרות את הדורה החשופה, תוך הקפדה לא לפרק את כיסוי הקליפה העדין ואת רקמות קליפת המוח באזור זה. מרחו טיפות של נוזל מוחי מלאכותי על אזור הגולגולת כדי למנוע יובש. קדח חור בעצם העורף כדי להחזיק את בורג ההארקה ולחבר חוט הארקה מנירוסטה.

לפני הורדת הצינורית, חבר את כבל הסיב האופטי למקור LED מצמד סיבים. הורד את הסיב האופטי בקוטר 400 מיקרומטר לתוך ה-VTA בקואורדינטות של AP שלילי 3.08 מילימטרים ו-ML 0.5 מילימטרים. בעזרת מיקרומניפולטור, מקם את אתרי המגע של האלקטרודה בשכבת התא הפירמידלית של ה-CA1.

כדי לסנכרן את דופק האור עם ההקלטה העצבית, חבר את דרייבר ה-LED והייבוא הדיגיטלי של בקר ההקלטה לפולסר לוגי טרנזיסטור-טרנזיסטור עם מפצל BNC. כוונן את הכפתור כדי לקבוע את העוצמה האפקטיבית שיכולה ליצור תגובה מבלי לייצר חפצים פוטואלקטריים ולחבר את הקרקע על הגולגולת לקרקע במתאם. חבר את הקדם ampראש liifier stage לבקר ההקלטה באמצעות כבל ממשק היקפי טורי ובדוק את נורות הצבע LED ביציאות בקר ההקלטה.

נוריות ירוקות וצהובות מצביעות על כרך תקיןtage על המחובר ampלוח החיים והנורית האדומה מציינת בקרת ראש תוכנה עובדתtagה. לאחר הפעלת התוכנה, בחר את פורמט קובץ הנתונים ושנה את שם הקובץ. עבור ליציאה עבור הראש המחוברtagה ולחץ על השבת הכל ביציאה אם לאלקטרודה יש פחות ערוצים מהראש stage.

בחר את מספר הערוצים המתאים שיוצגו על המסך. כדי ללכוד את חותמת הזמן TTL עבור הקלטה עצבית מסונכרנת וחותמת זמן המופעלת על ידי דופק אור, לחץ על הייבוא הדיגיטלי והפעל דיגיטלי באפס אחד. זה חייב להתאים לחיבור ה-BNC בייבוא הדיגיטלי של המגבר.

התאם את ציר הזמן וסולם המתח לתצוגת צורת גל מתאימה ובחר את קצב הדגימה, תוך התחשבות בכך שקצב דגימה ומספר ערוצים גבוהים יותר יגדילו את גודל הקובץ. לאחר מכן, הגדר את רוחב הפס של המגבר להקלטת יחידה אחת. כאן נעשה שימוש בתדר ניתוק של 300 עד 5,000 הרץ.

לצליל ספייק, לחץ על שמע אנלוגי והפעל את היציאה האנלוגית. לאחר מכן כוונן את הרווח ואת משתיק הקול לקבלת צליל אופטימלי. כדי לסנכרן את הקלטת המגבר ורכבת הדופק הקלה, לחץ על לשונית התצוגה והפעל את סמן ההצגה.

עבור לערוץ המתאים המתאים לחיבור BNC ובדוק מחדש את היציאות כדי לוודא שערוצי ההקלטה והדיגיטלי בערוץ מאפשרים ללכוד קוצים עצביים וחותמות זמן של דופק אור. לחץ על היקף הספייק כדי להציג צורות גל המהוות את רכבת הספייק המתועדת ברציפות. השתמש בעכבר כדי להגדיר את הסף עבור צורות הגל שיוצגו.

לאחר מכן בדוק את ה-RMS כדי לקבוע את רמת הרעש בהקלטה שלך. ביטוי הנגיף הקשור לאדנו אומת על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית של EYFP באזור הגחון של עכברים 21 יום לאחר ההזרקה. הדמיה פלואורסצנטית שימשה גם לאיתור הקרנות גלוטמט VTA קדם-סינפטיות בשכבות ההיפוקמפוס DG, CA3 ו-CA1.

לאחר שזוהתה פעילות מתח חוץ-תאית, הפעילות הבסיסית נרשמה במשך כ-10 דקות לפני הפעלת דופק האור בתדר הרצוי. זה איפשר להשוות את שיעורי הירי או ההתפרצות של נוירונים משוערים CA1 לפני ואחרי גירוי אור גלוטמט VTA. כדי לתמוך בתוצאה זו, השוואה סטטיסטית של שיעורי הירי ברשת CA1 לפני ואחרי הגירוי הראה עלייה משמעותית בתקופה שלאחר הגירוי.

ניתוח עוקב של רכבת הרסטר לזיהוי התפרצויות הראה גם קצב התפרצות מוגבר עבור נוירונים פירמידליים משוערים CA1 לאחר גירוי פוטו. התגובה לפוטוסימולציה זוהתה על ידי פלואורסצנטיות של ביטויי מדווח AAV באתרי הגירוי. כמו כן, התיאור של צריך להיות מתואם עם אתר ההקלטה עבור יחידות משוערות מגיבות.

שיטה זו יכולה להתבצע גם בעכברים ערים המבצעים משימות התנהגותיות. במקרה זה, יש להשתמש בבדיקות מושתלות כרוניות ובצינורית סיבים אופטיים. טכניקה זו תאפשר מעקב חזק אחר מעגלים עצביים באמצעות שילוב של התפלגות טרמינלית פרה-סינפטית באתר היעד ואפנון של מסופים פרה-סינפטיים כדי לזהות תגובת אתר יעד in vivo.