Name: חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: למד שיטות בידוד וגידול נוירונים סימפטיים מגנגליה צווארית עליונה בעוברי חולדה. הפרוטוקול כולל צביעה אימונוציטוכימית והכנת תמציות לניתוח פרוטאומי המאפשר חקר מנגנוני התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן לפיתוח הפקולטה ומענק תוכנית מחקר קיץ במכללת סנט מרי של קליפורניה. המחברים גם רוצים להודות ד"ר פמלה לין באוניברסיטת קליפורניה דייוויס וד"ר אנתוני Iavarone באוניברסיטת ברקלי Mass ספקטרומטריה מתקן על עצתם במהלך הפיתוח של פרוטוקולים אלה. המחברים גם רוצים להודות להיילי נלסון במשרד לתקשורת במכללה סנט מרי של קליפורניה על עזרתה בהפקת וידאו ועריכה.

<ol><li>Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+Changes+in+the+neuritic+growth+cone+and+target+neuron+during+synaptic+junction+development+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture.</a> Journal of Cell Biology. 9, (1976).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Dendritogenesis+in+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons.</a> Autonomic Nervous System. , (2018).</li>
<li>Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal polarity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).</li>
<li>Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Extracellular+Matrix+And+Osteogenic+Protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).</li>
<li>Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+and+retinoic+acid+induce+neurotrophin-3+responsiveness+in+developing+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons.</a> Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).</li>
<li>Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+the+survival+and+response+to+nerve+growth+factor+of+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons.</a> Developmental Biology. 161 (1), 96-106 (1994).</li>
<li>Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+light+chain+and+synaptotagmin+I+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).</li>
<li>Harris, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Guidance+by+a+Decellularized+Fibroblast+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix.</a> Matrix Biology. , 176-189 (2017).</li>
<li>Wingerd, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14+integrins+and+vascular+cell+adhesion+molecule-1+play+a+role+in+sympathetic+innervation+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart.</a> Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M. Tissue culture of autonomic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, MA. 177-205 (1991).</li>
<li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture.</a> Developmental Biology. 128 (2), 337-348 (1988).</li>
<li>Voyvodic, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+dendrites+in+the+rat+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).</li>
<li>Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Responses+of+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons+during+BMP-7-Induced+Dendritic+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth.</a> PLoS ONE. 6 (7), 21754(2011).</li>
<li>Pravoverov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+Necessary+for+BMP-7-induced+Dendritic+Growth+in+Cultured+Rat+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).</li>
<li>Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatera-Naranjo%2C+O+%22RNA+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">RNA (New York, N.Y.)</a>. 16 (8), 1516-1529 (2010).</li>
<li>Aschrafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+mediates+the+axonal+trafficking+of+tyrosine+hydroxylase+and+dopamine+%CE%B2-hydroxylase+mRNAs+and+enhances+norepinephrine+synthesis+in+primary+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).</li>
<li>Ghogha, A., Bruun, D. a, Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).</li>
<li>Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP2+is+localized+to+the+dendrites+of+hippocampal+neurons+which+develop+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture.</a> Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).</li>
<li>Mi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANTHER+version+11%3A+Expanded+annotation+data+from+Gene+Ontology+and+Reactome+pathways%2C+and+data+analysis+tool+enhancements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).</li>
<li>Chandrasekaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+the+morphological+development+of+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons.</a> Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).</li>
<li>Courter, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP7-induced+dendritic+growth+in+sympathetic+neurons+requires+p75+NTR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling.</a> Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).</li>
<li>Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture%3A+Autonomic+and+Enteric+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9 (1), 82(2016).</li>
<li>Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+isolation+and+culture+of+mouse+embryonic+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3200(2011).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+device+for+co-culture+of+sympathetic+neuron+and+iPS-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%2C+EMBS%22%5BJournal%5D)">Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes.</a> Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).</li>
<li>Takeuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+semi-separated+co-culture+system+of+sympathetic+neuron+and+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+31st+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%3A+Engineering+the+Future+of+Biomedicine%2C+EMBC+2009%22%5BJournal%5D)">Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte.</a> Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).</li>
<li>Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+BMP-induced+dendritic+growth+in+cultured+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).</li>
<li>Kim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+decrease+dendritic+arborization+in+rat+sympathetic+neurons+by+blocking+RhoA+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation.</a> Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+Primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li>
<li>Szpara, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+during+neurite+outgrowth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration.</a> BMC Neuroscience. 8 (1), 100(2007).</li>
<li>Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapigest+efficacy+for+the+digestion+of+proteins+from+cell+cultures+and+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clujul+Medical%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue.</a> Clujul Medical. 87 (4), 5(2014).</li>
<li>Vit, O., Petrak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+proteins+in+proteomics.+How+to+break+open+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box.</a> Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים לתפירת נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה של גורי חולדות עובריות. היתרונות של שימוש במערכת מודל זה הם כי ניתן להשיג אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים מתן תגובה דומה גורמי גדילה, ומאז דרישות גורם גדילה עבור נוירונים אלה כבר מאופיין היטב, ניתן לגדל נוירונים אלה במבחנה במדיה מוגדרת, בתנאים ללאסרום 10. למרות הפרוטוקול מתאר את התהליך לבידוד SCG מE21 גורי חולדה, פרוטוקול זה יכול לשמש עבור פירוק של SCG מגורי חולדה מ E17 כדי E21 ולניתוח של העכבר העוברי SCG<sup class="xref"...

נוירונים סימפטיים נגזר גנגליה צוואר הרחם מעולה עוברי (SCG) שימשו באופן נרחב כמערכת תרבות עצבית ראשית לחקר היבטים רבים של התפתחות עצבית כולל תלות גורם גדילה, אינטראקציות נוירון-יעד, נוירוטרנסמיטר איתות, צמיחה סקסוני, פיתוח דנדריט ו פלסטיות, סינפטוגנזה ומנגנוני איתות הבסיסית עצב-יעד / נוירון-glia אינטראקציות1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. למרות גודלם הקטן (כ-10000 נוירונים/גנגליה), ישנן שלוש סיבות עיקריות לפיתוח ולשימוש נרחב במערכת תרבות זו הם אני) להיות הגנגליה הראשונה בשרשרת הסימפטית, הם גדולים יותר, ולכן קל יותר לבודד, מאשר שאר הגנגליה הסימפטית10; ii) בניגוד לנוירונים המרכזיים, הנוירונים ב-SCG הם הומוגניים למדי עם כל הנוירונים הנגזרים מהציצה העצבית, בעל גודל דומה, תלות בגורם גדילה עצבי ולהיות נור-adrenergic. זה הופך אותם מודל יקר ערך עבור מחקרים מורפולוגיים וגנומיים10,11 ו- iii) נוירונים אלה יכולים להישמר במדיום מוגדר ללא סרום המכיל גורם גדילהעצבי במשך יותר מחודש 10,12. נוירונים SCG Perinatal שימשו בהרחבה לחקר המנגנונים הבסיסיים ייזום ותחזוקה של דנדריטים2. הסיבה לכך היא בעיקר, למרות נוירונים SCG יש arbor דנדריטי נרחב vivo, הם לא להרחיב דנדריטים במבחנה בהיעדר סרום, אבל יכול להיות מושרה לגדול דנדריטים בנוכחות גורמי גדילה מסוימים כגון חלבונים מורפוגנטעצם 2,,12,13.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד ולקולות נוירונים SCG חולדה עוברית. במהלך 50 השנים האחרונות, תרבויות עצביות עיקריות של SCG שימשו בעיקר מחקרים מורפולוגיים עם מספר מוגבל של מחקרים הבוחנים את השינויים הגנומיים או פרוטאומיים בקנה מידה גדול. זה בעיקר בשל גודל רקמה קטנה וכתוצאה מכך בידוד של כמויות נמוכות של DNA או חלבון, מה שמקשה לבצע ניתוחים גנומיים ופרוטונומיים על נוירונים אלה. עם זאת, בשנים האחרונות, רגישות גילוי מוגברת אפשרה פיתוח של שיטות לבחון את הגנום, miRNome ופרוטומה בנוירונים SCG במהלך פיתוח צמיחהדנדריטית 14,15,16,17. מאמר זה יתאר גם את השיטה לניתוח מורפולוגי של נוירונים אלה באמצעות אימונוציטוכימיה ופרוטוקול כדי להשיג תמציות חלבון עצבי לניתוח ספקטרומטרי מסה.

<table><tbody><tr><td>2D nanoACQUITY</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>BMP-7</td><td>R& D Systems</td><td>354-BP</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלומיניום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>קורנינג</td><td>CLS-3010</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר או Nunc צלחות תרבית תאים עם תחתית שטוחה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200, 140675, 142475</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין- ובטא;- D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>D-phosphate תמיסת מלח חוצצת (ללא סידן ומגנזיום)</td> <td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - גלוקוז נמוך + גלוטמין, + נתרן פירובט</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>ללא חומצות שומן BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126609</td><td>מלאי 20 מ"ג/מ"ל בגלוקוז נמוך DMEM</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים Dumont מס' 4 ומס' 5</td><td>Ted Pella Inc</td><td>5621, 5622</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ומספריים לדיסקציה</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1328, 1329, 5002</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית - 12 מ"מ</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי עכבר IgG Alexa 488 מצומד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>תערובת התזונה של Ham's F-12</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>המסת המלח המאוזנת של האנק (ללא סידן ומגנזיום)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין-סלניום-טרנספרין (100X)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ L-15 בינוני</td><td>תרמו פישר</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה מדיה לכיסויי זכוכית</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>P36931, P36934</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עכבר-אנטי-MAP2 (SMI-52)</td><td>BioLegend</td><td>SMI 52</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה עצבי</td><td>Envigo Bioproducts (לשעבר Harlan Bioproducts)</td> <td>BT5017</td><td>מלאי 125 &mu; גרם/מ"ל ב-0.2% Prionex ב-DMEM</td></tr><tr><td>Paraformaldehye</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Prionex</td><td>Millipore</td><td>529600</td><td>תמיסה 10%, 100 מ"ל</td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters Corporation</td><td>186001861</td><td>5 x 1 mg</td></tr><tr><td>Synapt G2 High Definition ספקטרומטריית מסה</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro חומצה אצטית - דרגת ריצוף</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td>10 X 1 מ"ל</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega או NEB</td><td>V511A, P8101S</td><td>100 &mu; גרם או 5 X 20 מ"ג</td></tr><tr><td>ווטרס בקבוקוני התאוששות מלאים</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>186000385c</td><td></td></tr></tbody></table>

חולדה culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

נוירונים סימפטיים מן החולדה העוברית מעולה ganglia צוואר הרחם (SCG) שימשו כמערכת מודל מבחנה עבור נוירונים היקפיים לחקור צמיחה סקסונית, סחר באקסונים, סינפטוגנזה, צמיחה דנדריטית, פלסטיות דנדריטית ואינטראקציות מטרה עצבית במערכות תרבות שותף. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והניתיקות של תאי העצב מהגרגליה צוואר הרחם מעולה של עוברי חולדה E21, ואחריו הכנה ותחזוקה של תרבויות עצביות טהורות במדיום ללא סרום. מאז נוירונים אינם לדבוק פלסטיק לא מצופה, נוירונים יהיה תרבותי על או 12 מ"מ כיסוי זכוכית או 6-well צלחות מצופה פולי-D-לינזין. לאחר טיפול עם סוכן אנטימיוטי (Ara-C, ציטוסין β-D-arabinofuranoside), פרוטוקול זה יוצר תרביות עצביות בריאות עם פחות מ 5% תאים שאינם נוירוניים, אשר ניתן לשמור במשך יותר מחודש במבחנה. למרות חולדה עוברית SCG נוירונים הם רב קוטבי עם 5-8 דנדריטים ב vivo; בתנאים ללא סרום, נוירונים אלה להרחיב רק axon אחד בתרבות ולהמשיך להיות חד קוטבי למשך כל התרבות. עם זאת, נוירונים אלה יכולים להיות מושרה להאריך דנדריטים בנוכחות תמצית קרום מרתף, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), או 10% סרום עגל עוברי. תרבויות עצביות הומוגניות אלה יכולות לשמש להכתמה חיסונית ולחקרים ביוכימיים. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמים חיסוניים עבור microtubule הקשורים חלבון-2 (MAP-2) בנוירונים אלה, להכנת תמציות עצביות לספקטרומטריה מסה.

בידוד ותחזוקה של תרביות עצביות של נוירונים עובריים SCG תאים תפורים מSCG עוברי חולדה היו מצופה בצלחת פולי-D-ליסין מצופה או כיסוי ומתוחזק בתקשורת תרבות חופשית סרום המכיל גורם גדילה B-עצב. התאים התופרקים המכילים תערובת של תאי עצב ותאי גליה נראים עגולים עלציפוי (איור 1A). בתוך 24 שעות של ציפוי, הנוירונים להאריך תהליכים סקסוניים קטנים עם תאי גליה שיטוח ומופיע שלב כהה תחת מיקרוסקופ ניגודיות שלב(איור 1B). לאחר הטיפול עם Ara-C, 99% של תאי גליה מסולקי...

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

בסרטון זה, אנו נדגים את פולחן הגרופיות הצוואריות העליונות של חולדות עובריות לניתוח מורפולוגי ופרוטומי. לפני תחילת הניתוח, הכינו את אמצעי הבקרה והפירוק. אמצעי בקרה מכיל F-12 ו- DMEM גלוקוז נמוך בתוספת תערובת אינסולין-סלניום-transferrin, גלוטמין, גורם גדילה עצבי, ו BSA.מדיום הניתוח מכיל L-15 בתוספת סטרפטוקומטר עט ו-BSA. עיין בכתב היד לקבלת פרוטוקולים מפורטים להכנת התקשורת. הכנת צלחות לתכשירי עצב פולחן.מדללים מלאי של מיליגרם למיליליטר של פולי-די-ליזין ל-100 מיקרוגרם למיליליטר עם מים מזוקקים סטריליים. לניתוח פרוטומי או גנומי, יום עד יומיים לפני הניתוח, מצפים צלחות שש בארות עם כשני מיליליטר של סטרילי 100 גרם למיליליטר של פולי-D-לינזין. זה הכרחי כדי להבטיח הידבקות התא ל הבאר.עוטפים את הצלחות בסרט נצמד ומאחסנים את הצלחות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ביום הניתוח, לפני תחילת הניתוח, להסיר את הפתרון פולי D-לינזין מן בארות ולשטוף את בארות חמש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים, ואחריו פעם אחת עם DMEM גלוקוז נמוך. במהלך העיכול האנזימטי של הגנגרליה, כשעה לפני ציפוי התאים, שאפו את ה- DMEM מהצלחות והחלפו אותו במדיום בקרה של 0.3 מיליליטר.אחסנו את הצלחות ב-35 מעלות צלזיוס מתחת ל-5%CO2 בתא לח. במכסה המנוע, הגדר את הפריטים הבאים עבור ניתוח. ארבעה צינורות חרוט סטריליים 50 מיליליטר עם כ 20 מיליליטר של מדיה ניתוח בכל צינור.ארבע מנות סטריליות 35 מילימטר עם 1.5 מיליליטר של מדיה ניתוח. צינור חרוט סטרילי אחד של 50 מיליליטר עם 20 מיליליטר של מדיית ניתוח לצנטריפוגה. צינור חרוט סטרילי אחד של 15 מיליליטר לצנטריפוגה של הגרעינים, צינור סטרילי אחד של 10 מיליליטר לאיסוף התאים המנותקים.השתמש חיטוי חרוזים יבשים כדי לעקר זוג מדפים עדין לפחות דקה אחת. כל ההליכים שבוצעו במחקרים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים במכללת סנט מרי בקליפורניה. הנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים במכללת סנט מרי בקליפורניה פותחו על סמך הנחיות שסופקו על ידי המשרד לרווחת בעלי חיים במעבדה במכון הלאומי לבריאות.הסרת עוברי E21 מהעכבר ההרי. שים לב כי הסרת קרן הרחם יכולה להתבצע מחוץ למכסה המנוע אם האזור שמסביב מעוקר ביסודיות. המתת חום לחולדה בהריון עם שאיפת CO2.גוועים את הפרווה מאזור הבטן ומנגבים את העור באזור עם 70% אלכוהול כדי לעקר אותו. באמצעות קבוצה טרייה של מספריים סטריליים ומדפים, לחתוך דרך העור ולאחר מכן את השריר לחשוף את קרני הרחם המכיל את העוברים. הסר את קרן הרחם עם העוברים, באמצעות קבוצה חדשה של מספריים ומדפים, דואג לא לפגוע במעיים בתהליך.מעבירים את קרן הרחם עם העוברים לצלחת פטרי סטרילית 150 מ"מ ומעבירים אותם למכסה המנוע. באמצעות קבוצה חדשה של מלקחיים ומספריים, להסיר את העוברים מקרן הרחם ולהפריד את העוברים מן הממברנות מי המפירה ואת שליה. כדי להרדיף את העוברים, חותכים את חוט השדרה של העוברים לאורך קו האמצע מתחת לזרוע ימין.זה יקטין את הדימום מן העורק הראשי במהלך הסרת SCG. העבר עוברים אלה לתוך צינורות חרוט מוכנים 50 מיליליטר המכילים מדיה ניתוח. תוודא שהעוברים שקועים בתקשורת.כל צינור יכול להכיל עד שלושה עוברים. בידוד של גנגליון צוואר הרחם מעולה מהעובר. מעבירים גור אחד מאמצעי הניתוח לצלחת פטרי סטרילית של 150 מ"מ, חצי מלאה במצע מוצק עם משטח הגב שלו על המצע.באמצעות שלושה מחטים סטריליות 23 מד, להצמיד את הפאב לצלחת עם מחט אחת מתחת לכל זרוע ומחט שלישית דרך הפה כדי לזרז בזהירות את הצוואר. חותכים דרך העור באזור הצוואר באמצעות מדפים דקים סטריליים כדי לחשוף את בלוטות הרוק מתחת. הסר בלוטות אלה באמצעות מדפים עדין.אתר את השרירים סטרנוקליידום ו omohyoid ליד עצם הבריח ואת קנה הנשימה בהתאמה. ראשית, לחתוך את השרירים הסטרונוקלידוסטואידים רוחביים. ואז בזהירות לחתוך את השריר omohyoid דק באמצעות מדפים עדין.לאחר הסרת השרירים הללו, bifurcation בעורק הראשי בקצה הראשון, יהיה גלוי משני צדי קנה הנשימה עם SCG ממוקם מתחת לתספורת זו בעורק הראשי. באמצעות מדפים סגורים, בעדינות להרים את העורק הראשי כדי לדמיין את SCG. באמצעות מטח אחד משני צדי SCG, לשלוף את התרפיד ולהעביר אותו מנות סטריליות מוכן 35 מילימטר.רקמה זו ככל הנראה תכיל את SCG עם העורק הראשי, עצב הוואגוס עם גרני הנוודוז, כמו גם קטעים אחרים של שריר או שומן באזור. חזור על תהליך הניתוח בצד השני. הסר SCGs מכל העוברים לפני שתמשיך בשלבי הניתוח הנותרים המתוארים.הפץ את הרקמות המבודדות בין שתיים מהמנות של 35 מילימטרים כדי להקל על עיבוד דגימות הרקמה. לאחר העיבוד של SCG. כדי להפריד את SCG מן הרקמה נותח, תחילה להשתמש מטלטולים עדין כדי להסיר כל רקמה מיותרת, כגון שריר או שומן, דואג כדי למנוע את האזור ליד bifurcation הת הראשי.ברגע שהרקמות האלה הוסרו, שני גנגלים נראים לעין. גנגליון הנודוז קטן ועגול בעוד SCG הוא בצורת שקדים. משוך בעדינות את עצב הוואגוס כדי להפריד את עצב הוואגוס ואת גרגליית הנוודז מהתרדמה ולאחר מכן להפריד את SCG מהערק הראשי.השתמש מדפים עדין כדי להסיר את הקפסולה המקיפה SCG. העבר את SCG למנה חדשה של 35 מילימטר תרבות. חזור על תהליך זה עם כל דגימות הרקמה נותק.מצפים פיפטה זכוכית מעורקת עם תקע כותנה עם מדיית ניתוח כדי למנוע מהרקמות לבקוע לקירות הפיפיט. השתמש פיפטה להחליף את המדיה dissection עם סטרילי שני מיליליטר של קולגן מסוג II, להפיג סוג II בסידן ומגנזיום ללא HBSS ודגירה במשך 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לעזור לשבור את הרקמות. שימו לב כי ייתכן שיהיה צורך לייעל את זמני הדגירה עם אצוות שונות של קולגן/דיספס ובדרך כלל נע בין 40 דקות לשעה.לאחר הדגירה, מעבירים את ה- SCGs והקולגנס / דיספס לצינור חרוט סטרילי של 15 מיליליטר. השתמש במדיה ניתוח לשטוף את הצלחות ולהעביר את הפתרון לצינור. הוסף די מדיה של ניתוח כדי להביא את עוצמת הקול לכ- 10 מיליליטר.צנטריפוגה ב 200 x גרם, 1, 000 כדי 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה את המדגם. שאפו את העל-טבעי, דאגו לא לסלק את גלולת הכדור. תן שוב את גלולה עם 10 מיליליטר של מדיה ניתוח, לחזור על הצנטריפוגה ולהשליך את supernatant.החלף עם אחד עד שני מיליליטר של תרבות בינונית. באמצעות פיפטה פסטר סטרילית צרה, כפופה קצה, מראש מצופה אותו עם תרבות בינונית, מכנית לנתק את הגושים על ידי triturating בעדינות חמש עד שש פעמים. תן לגושים הגדולים להסתפק בדקה אחת ולהעביר את ההשעיה של התא העל-טבעי לצינור חדש של 10 מיליליטר.חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות עם כוח הולך וגדל של טריטורציה בכל פעם כדי להבטיח דיסוציאציה כמעט מוחלטת של SCGs. להעביר את supernatant לאחר כל סיבוב של טריטורציה לצינור 10 מיליליטר עם supernatant מן הטריוטורציה הראשונה. הוסף מספיק מדיה תרבותית כדי להביא את עוצמת הקול לשמונה עד עשרה מיליליטר.מערבבים בעדינות מתלי תאים וכמתו את צפיפות התאים באמצעות מד חמוציטים. הפץ את ההשעיה התא לתוך הבאר בצפיפות התא המתאימה לניסויים. מערבבים את ההשעיה התא ללא הרף במהלך תהליך הציפוי כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים לתוך הבארות.לניתוח מורפולוגי, לוח התאים סביב 8, 000 תאים לגם בצלחת 24 באר. ולפרוטוקולים גנומיים ופרוטומיים, לוח התאים גבוה ככל 30, 000 תאים ל הבאר. מעבירים את הצלחות לתיעוב זכוכית עם מים סטריליים בתחתית כדי ליצור תא לח.להזריק מספיק CO2, סביב 120 מיליליטר, כדי לקבל סביבה 5%CO2 ב desiccator, לפני האיטום. לשמור על הצלחות ב 35.5 מעלות צלזיוס. פעולה זו נקראת יום אפס בפרוטוקול.צלחות אלה יכולות להישמר גם באינקובטור רגיל של 5%CO2. השיטה המתוארת לעיל ממזערת את שינויי הטמפרטורה וה- pH וגם מסייעת במניעת זיהום צולב. תחזוקה של נוירונים SCG מתורבתים וטיפולים.תמונות אלה מראות את תאי הגנגליה הצוואריים המעולה המנותקים ביום אפס, ביום הראשון וביום החמישי. תמונת היום אפס מציגה את התאים בעת הציפוי. התאים המ מצופים ביום אפס מכילים תערובת של תאים עצביים ולא עצביים.ביום הראשון, 24 שעות לאחר הציפוי, להסיר בזהירות מחצית התקשורת התרבותית ולהחליף עם שני micromolar ארה-C, ציטוסין D-arabinofuranoside, סוכן אנטי מיתוטי. השאירו את הטיפול בתאים למשך 48 שעות. בדרך כלל אורך זה של טיפול מספיק כדי לחסל תאים שאינם עצביים בתרבות.ביום השלישי, שאף בעדינות חצי מהמדיום והחלף באמצעי בקרה. ביום הרביעי, התאים מוכנים לטיפולים ניסיוניים. להאכיל תרבויות כל יומיים עם המדיום המתאים.מחליפים בעדינות חצי מהמדיום היטב במדיום טרי. התמונה ביום החמישי מראה צמיחה אקסונאלית נרחבת ללא צמיחה דנדריטית שנצפתה. כדי לגרום לצמיחה דנדריטית, נוירונים ניתן לגדל על Matrigel או מטופלים עם 10% סרום או 50 ננוגרם למיליליטר של חלבון מורפגנטי עצם-7.איור 2 מראה שינויים במורפולוגיה העצבית של נוירונים SCG עכברוש E21 בעקבות טיפול עם BMP-7. מיקרוגרפים ניגודיות פאזה ייצוגית בהגדלה של 10 X מראים את גוף התא העצבי המעגלי עם אקסונים בנוירונים בקרה בפאנל A, ותאי עצב עם תהליכים קצרים דמויי דנדריט מרובים כאשר מטופלים עם BMP-7 המוצגים על ידי החצים בפאנל B.Cultured SCG נוירונים בעקבות טיפולים מתאימים ניתן להשתמש בניתוח מורפולוגי באמצעות כתמים אימונוציטוכימיים לניתוח גנומי כגון ניתוחים פרוטומיים. עיין בכתב היד לקבלת פרוטוקולים מפורטים לכשל חיסוני והכנה לדוגמה לניתוח פרוטומי.איור 3 מראה כשל חיסוני מחלבון MAP-2 בחולדות עובריות מתורבתות נוירונים סימפטיים. לוחות A עד D להראות נוירונים SCG מתורבתים שטופלו עם מדיה שליטה לוחות E דרך H להראות נוירונים שטופלו BMP-7 ב 50 ננוגרם למיליליטר במשך חמישה ימים. מיקרוגרפים מייצגים המראים כתמים אימונוציטוכימיים של הנוירונים עם מיקרוטובול הקשורים לחלבון-2 ב- C ו- G, כתם גרעיני ב- D ו- H עם מיקרוגרפים ניגודיות פאזה ב- B ו- F, ולצאת משלושת הערוצים בכתמים A ו- D.Immunocytochemical ממיקרוטובול הקשורים לחלבון-2 קיים בגוף התא ואקסונים פרוקסימליים של נוירוני בקרה בפאנל C. וכתמים מחלבון MAP-2 בגוף התא ודנדריטים בנוירונים שטופלו ב-BMP-7 נמצאים בפאנל G.Here' הוא מדגם של גרפליה צוואר הרחם מעולה שטופלה במדיה שולטת, שזיהתה 1,100 חלבונים.ג'ין אונטולוגיה באמצעות מסד הנתונים של הפנתר מצאה שרוב החלבונים היו ציטופלסמיים. עם זאת, היו חלבונים וחלבונים הקשורים קרום בצמתים הסלולר המדגם. ניתוח זה גילה גם כי חלבונים המעורבים במגוון רחב של מסלולי איתות עצביים זוהו המדגם.לסיכום, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד ולתרבת נוירונים גנגליון צוואר הרחם עוברי מעולה עבור ניתוח מורפולוגי ופרוטומי. עבודה זו מומנה על ידי קרן פיתוח הפקולטה ותוכנית מחקר הקיץ במכללת סנט מרי בקליפורניה.

culturing-rat-sympathetic-neurons-from-embryonic-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

הגנגליה הגדולה מכילה נוירונים. מעוררי חמלה וסימפטיים שinnervate איברי אגן כאן אנו מתארים שיטת הניתוח ולספק תרשימים לזיהוי גנגליה אלה ואת העצבים המשויכים שלהם. שיטות אלה ניתן להחיל על מניפולציה ניסויית של גרעינים אלה ב vivo או להסרת לאחר המוות למחקר נוסף.

חיתוך של האגן האוטונומי האגליה והעצבים המשויכים בחולדות זכר ונקבה

שינויים פתופיזיולוגיים במערכת העצבים האוטונומית הלבבית, במיוחד בענף הסימפטי שלה, תורמים לתחזוקה ולתחזוקה של הפרעות קצב חדריות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד לאפיין גרעינים כוכביים מורין כדי לשפר את ההבנה של התהליכים המולקולריים והתאים הבסיסיים.

מיקום, ניתוח וניתוח של גנגליון מורין סטלה

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.

בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל עכברי של אבלציה של עצבוב אדרנרגי על ידי זיהוי וכריתה של גנגליון צוואר הרחם העליון.

טכניקה כירורגית לכריתת גנגליון צוואר הרחם מעולה במודל מורין

למד שיטות בידוד וגידול נוירונים סימפטיים מגנגליה צווארית עליונה בעוברי חולדה. הפרוטוקול כולל צביעה אימונוציטוכימית והכנת תמציות לניתוח פרוטאומי המאפשר חקר מנגנוני התפתחות עצבית.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

גלה סרטונים נוספים