Name: קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: למדו קריסטלוגרפיית רנטגן לחקר המעבר האוליגומרי של TmPep1050 מדימר לאקטיב לדודקאמר אקטיבי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני של אמינופפטידאזים ומנגנוני פעילות תלויים אוליגומריזציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרטין רובר על הגהה של המאמר הזה ועל מתן הערות מועילות. הגישה לקו הקרן של Proxima 2 (SOLEIL synchrotron) הייתה בתוך קבוצות הקצאת בלוקים 20151139.

לסופרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הבנת המעבר של דמר-dodecamer של TmPep1050 ברמה המבנית. המתודולוגיה מנוסה בעבר לקביעת המבנה של שני TmPep1050 אוליגומרים11. הצעד המאתגר ביותר היה למצוא תנאים המקדמים את הניתקות של dodecamers לעמומים יציבים. תנאים כאלה היו צריכים להיות קלים מספיק כדי לאפשר שיוך מחדש של דימרים לתוך dodecamers כאשר cofactor יון מתכת נוספה. ההפרדה של אוליגומרים היה גם צעד קריטי כפי שהוא תנאי מחקרים מבניים אפיון ביוכימי נוסף (למשל, לימוד ההתרועעות dodecamer במינונים שונים של Co2+). ה...

אוליגומרציה היא תהליך דומיננטי המכתיב את הפונקציות הביולוגיות של חלבונים רבים. ב Escherichia קולי, ההערכה היא כי רק 35% של חלבונים הם מונומריים1. חלבונים מסוימים, הנקראים מורפיינים, יכולים אפילו לאמץ מספר מצבים אוליגומריים עם יחידות משנה בעל מבנה נפרד בכל מצב אוליגומרי2. המעבר בין מצבם האוליגומרי הוא לעתים קרובות מתכוון לווסת את פעילות החלבון כמו כל מצב אוליגומרי עשוי להיות פעילות או פונקציה ספציפית שונה. מספר דוגמאות למורפיין תועדו היטב בספרות, במיוחד את סינתאזפורפובילינוגן 3, HPr קינאז/פוספטאז4, פרוטאזלון 5, להקטאט דהידג'נאז6, גליצרלדהיד-3-פוספט דהידג'נאז7, פירווט קינאז8, סינתזיטציטראט 9, וריבנוקלאז A10. לאחרונה, תיארנו M42 aminopeptidase TmPep1050, דוגמה נוספת של אנזים עם התנהגות כמו מורפיין, שפעילותו תלויה במצבים האוליגומרייםשלה 11. המעבר בין המדינות האוליגומריות שלה מתווכת על ידי הגורמים המתכתיים שלה, מה שגורמים למספר שינויים מבניים של יחידות המשנה.
משפחת M42 aminopeptidase שייכת לשבט MH12,13, והיא מחולקת באופן נרחב בקרב חיידקים וארכאה14. M42 aminopeptidases הם אנזימים די-גרעין אמיתיים משפיל פפטידים עד 35 שאריות חומצת אמינובאורך 15. הם מאמצים מבנה מוזר בצורת טטריהדרון עשוי מ-12 יחידות משנה עם האתרים הפעילים שלהם הכיוון לחלל הפנימי. הסדר כזה מתואר לעתים קרובות בשם ננו-מידור של הפעילות כדי למנוע פרוטאוליזה בלתי מבוקרת. הפונקציה הפיזיולוגית של M42 aminopeptidases עשוי להיות קשור פרוטאזום, פפטידים הידרוליזההנובעים מירידהבחלבון 16,17. Pyrococcus horikoshii בעל ארבעה M42 aminopeptidases, כל אחד מציג ייחודי אך משליםפרטים 18,19,20,21. באופן ייחודי, תסביכות הטרוסקסואליות המורכבות משני סוגים שונים של יחידות משנה תוארו בפ. horikoshii, מה שמצביע על קיומם שלמתחמים פפטידים 22,23.
בספרות תוארו מספר מבנים של M42 aminopeptidases11,16,18,19,20,24,25,26. תחום המשנה מורכב משני תחומים נפרדים, קבוצת מחשבים קתטית ותחום דימיטים. התחום הקתליטי מאמץ פיפול α/β משותף שנצמר בכל שבט MH, התחום הקטליטי הארכיטיפי הוא ה-Ap1 של Vibrio proteolyticus27. תחום dimerization מאמצת קיפול PDZ כמו16 ואולי יש, בנוסף לתפקידה oligomerization, תפקיד בשליטה על גישה למצע ואיגוד בחלל הפנימי11. מכיוון שאבן הבניין הבסיסית היא עמומה יותר, מתואר ה-dodecamer לעתים קרובות כשיוך של שישה דימרים, שכל אחד מהם ממוקם בכל קצה של טטרהדרון16. אוליגומרציה של M42 aminopeptidases מסתמך על הזמינות של cofactors מתכת שלה. יונים מתכת Divalent, לעתים קרובות Zn2+ ו Co2+, מעורבים באופן קטליטי בכריכת פפטיד והידרוליזה. הם נמצאים בשני אתרי איגוד נפרדים, כלשהם אתרי M1 ו-M2. שני יונים מתכת גם לנהוג ולכוונן היטב את oligomerization כפי שהוכח עבור PhTET2, PhTET3, PfTET3, ו TmPep105011,24,28,29. כאשר cofactors מתכת מתרוקן, dodecamer מתפרק לתוך dimers, כמו PhTET2, PhTET3, ו TmPep105011,16,28,או אפילו מונומרים, כמו PhTET2 ו PfTET324,29.
מוצג כאן פרוטוקול המשמש לחקר המבנים של TmPep1050 אוליגומרים. פרוטוקול זה הוא קבוצה של שיטות נפוצות כולל טיהור חלבונים, הקרנת פעילות פרוטאוליטית, התגבשות, מפזר רנטגן, והחלפת מולקולרית. הדקויות הטמונות בהתמודדות עם מטאלואנזימים, אוליגומריזציה של חלבונים, התגבשות חלבונים והחלפת מולקולרית מודגשות. מקרה של מחקר מוצג גם כדי להראות אם TmPep1050 dodecamers עשויים עוד יותר לנתק לתוך מונומרים או לא. כדי לטפל בשאלה זו, גרסה TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, נחקרה שאתרי כריכת המתכת שלהם נפגעים על ידי מוטציה שלו-60 (אתר M2) ו His-307 (אתר M1) כדי Ala שאריות. פרוטוקול זה עשוי להיות מתאים ללמוד aminopeptidases M42 אחרים או כל מטאלואנזימים עם התנהגות כמו מורפיין.

<table><tbody><tr><td>1,10-פננתרולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 מסננים צנטריפוגליים Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>בקר http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>cOmplete ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>N/A</td><td></td><td>ביקור https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>מסך קריסטל I</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>מסך קריסטל II</td><td>המפטון מחקר</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR מאסטר מיקס</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal כלי 15 בארות</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli PPY strain</td><td>N/A</td><td></td><td>ראה התייחסות 31</td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 זן כחול</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כיול סינון ג'ל HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כיול סינון ג'ל LMW</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>סינון ג'ל סטנדרטי</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET פלסמיד מיני-פרפ ערכת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>אינדקס</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>מידות</td><td></td><td></td>מולקולריות</tr><tr><td>L-leucine-p-nitroanilide</td><td>Bachem AG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia plugin</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>ביקור https://www.dectris.com/</td></tr> <tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix</td><td>N/A</td><td></td><td>ביקור</td></tr> <tr><td>https://www.phenix-online.org/ Phusion High-Fidelity DNA פולימראז</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>מלח RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה SnakeSkin, 3.5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>מקור 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>מקור 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 דרגת הכנה</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 זן</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>מאגר פלסמיד DNASU</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>ביקור http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>ביקור https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של thermotoga maritima m42 aminopeptidase tmpep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

M42 aminopeptidases יוצרים מתחמים פעילים מבחינה פונקציונלית המורכבים מ-12 יחידות משנה. נראה שתהליך ההרכבה שלהם מוסדר על ידי התורמים היונים המתכתיים שלהם, מה שמפעיל מעבר של דימר-דוקאמר. עם כריכת יון מתכת, מספר שינויים מבניים מתרחשים באתר הפעיל ובממשק האינטראקציה, מעצבים עמעום לקידום ההרכבה העצמית. כדי לצפות בשינויים כאלה, אוליגומרים יציבים חייבים להיות מבודדים לפני מחקר מבני. דווח כאן היא שיטה המאפשרת טיהור של dodecamers יציבים ועמומים של TmPep1050, M42 aminopeptidase של T. maritima, ואת קביעת המבנה שלהם על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. דימרים הוכנו מ-dodecamers על ידי הסרת יונים מתכת עם סוכן chelating. ללא קופקטור שלהם, dodecamers הפך פחות יציב ונתק לחלוטין עם החימום. המבנים האוליגומריים נפתרו על ידי גישת ההחלפה המולקולרית הפשוטה. כדי להמחיש את המתודולוגיה, המבנה של גרסה TmPep1050, פגום לחלוטין בכריכת יון מתכת, מוצג לא מראה פירוט נוסף של dimers מונומרים.

כדי ללמוד ניתק dodecamer אפשרי לתוך מונומרים ב TmPep1050, שלו-60 ו שלו-307 codons הוחלפו על ידי אלנין קודון באמצעות גן סינתטי. גן זה שוכפל לאחר מכן בוקטור pBAD עבור ביטוי וטיהור של המשתנה המתאים TmPep1050 לאחר מכן בשם TmPep1050H60A H307A. הכרומטוגרפיה שלהחרגת גודל (איור 3B)הראתה כי לחלבון המטוהר היה משקל מולקולרי לכאורה של 56 kDa (משקל מולקולרי של המונומר הוא 36.0 kDa). משקל מולקולרי דומה לכאורה, 52 kDa, דווח עבור TmPep1050 dimer11. לפיכך, המצב האוליגומרי ש...

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

פרוטוקול זה מקל על המחקר של aminopeptidases עם מצבים אוליגומריים שונים ופעילויות תלויות אוליגומריזציה מאוזנות בין עמעום לא פעיל דודקאמרים פעילים. טכניקה קונבנציונלית זו יכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה. ומלבד הצורך בגישה למתקן קריסטלוגרפיה של קורות או קרני רנטגן, אינו דורש התקנים מיוחדים.עם הסתגלות מסוימת, שיטה זו עשויה להיות מיושמת על כל חלבון אחר עם פעילות או פונקציה התלויה במידה של אוליגומריזציה. כדי לעבד את נתוני הרנטגן, למשתמשים חייבת להיות הבנה מינימלית של קריסטלוגרפיה. אנו מזמינים את המשתמשים לעקוב אחר הדרכות, לבקר ב- XDS Wiki ולצפות בערכות לימוד של Phenix.כדי לבצע בדיקת פעילות, להוסיף 25 microliters של 100 mM L-לאוצין p-Nitroanilide ל 965 microliters של 50 מילימולרים MOPS, 250 micromolar קובלט שני כלוריד ו 10% מתנול Pre דגירה תערובת התגובה באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס, לפני דילול האנזים לריכוז סופי micromolar אחד עם 50 מילימולים נוספים MOPS. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אנזים מיקרומולרי אחד לתערובת התגובה והמערבולת את הפתרון שנוצר לפני החזרת התגובה לאמבטיה היבשה של 75 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משעה. כאשר הפתרון הפך צהוב, לעצור את התגובה עם מיליליטר אחד של 20% חומצה חומצית מערבולת את התערובת לפני המאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן להעביר aliquot של תערובת התגובה לתא ספקטרופוטומטר ולקרוא את סופגים ב 410 ננומטר נגד תערובת תגובה דגירה ללא אנזים, כשליטה שלילית. להכנת אפואנזים, להוסיף 10 microliters של 1, 10-phenanthroline פתרון מלאי 890 microliters של 50 מילימולרית MOPS, 0.5 אמוניום גופרתי טוחה ו 100 microliters של TmPep1050 מטוהרים. בדוק את אובדן הפעילות באמצעות בדיקת הפעילות כפי שהוכח ללא תוספת של קובלט שני כלוריד.לאחר ההקפאה, להעביר את המדגם לתוך צינור דיאליזה להדיאליזה המדגם נגד 200 מיליליטר של 50 מילימולרים MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחה בארבע מעלות צלזיוס. החלף את הדיאליזה עם חיץ טרי שלוש פעמים במהלך הדיאליזה 48 שעות ולאסוף מדגם מצינור הדיאליזה. באמצעות יחידות סינון אולטרה עם ניתוק 30 קילודאלטון, לרכז את המדגם בחזרה 100 microliters ולבדוק את הריכוז על ספקטרופוטומטר נפח ננו ב 280 ננומטר.כדי להכין את dimers לדלל את האפואנזים לריכוז micromolar אחד ב 50 מילימולרי MOPS ו 0.5 אמוניום גופרתי טוחן, ולהדקיר את התגובה במשך שעתיים באמבטיה יבשה 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לרכז את דגימת האנזים כאשר לפחות 50 ריכוז microliter ולבדוק את המשקל המולקולרי לפי גודל הדרת כרומטוגרפיה. כדי לשפר את הצורה, הגודל והקריסטליות של גבישי החלבון, הוסיפו את הנפח המתאים של פתרון התגבשות ממוטב לירידה בגבישים כדי להביא את נפח טיפת הגביש ל-10 מיקרוליטרים.מעבירים את טיפת צינור 1.5 מיליליטר מיקרו ולהוסיף 90 microliters יותר של פתרון התגבשות לזרע היטב. עבור כל דילול זרעים, יש להוסיף 500 מיקרוליטרים של רגנט התגבשות לאורך כל באר למספר בארות המתאים בצלחת התגבשות ולערבב שני מיקרוליטרים של דגימת חלבון עם שני מיקרוליטרים של רייגנט התגבשות ו-0.2 מיקרוליטרים של זרעים בתמיכה אחת של התגבשות לאורך כל באר. ואז לתקן את התומכים על כל באר של reagent התגבשות.לקטוף קריסטל, למלא אמבטיה עם חנקן נוזלי לצלול כל בקבוקונים או סל המשמש לטיפול מדגם לתוך החנקן. טיפול בחנקן נוזלי מסוכן זה יכול לגרום לכוויות קור חמורות. הקפד ללבוש הגנות אישיות נאותות כמו כפפות קריוגניים ומנועי עיניים מגן.הגדר לולאות איסוף לדוגמה בגדלים שונים בהתאם לגודל הגביש ולהשתמש במשקפת כדי לבחור טיפה המכילה גבישים. לאחר מכן השתמש בלולאה כדי לבחור בעדינות גביש מבודד מ באר אחת ומיד לצלול את הלולאה בחנקן נוזלי לפני הצבת הלולאה בקבוקון מתאים. למדידת מידות נקודתיות של דיפוזיה, צרו תיקייה שממנה יופעל XDS ואתרו את הנתיב לתמונות.כדי להפעיל xdsme, הזן את הפקודה בחלון מסוף. לאחר XDS סיים את המשימה לבדוק את קובץ lp הנכון לציין את ההסתברות של קביעת קבוצת החלל, שלמות נתונים, הרזולוציה הגבוהה ביותר, פסיפס גביש ואיכות נתונים. לאחר בדיקת יומן XDS חסר טעם כדי להשיג את הסבירות של קבוצות רווח, השתמש בפקודות כדי להדק את xdsme עם פתרונות שונים של קבוצת חלל המוצעים על-ידי XDS, בתיקיה נפרדת כדי למנוע דריסת התהליך הקודם.לאחר בחירת הפתרון הטוב ביותר בהתבסס על סטטיסטיקת הנתונים, הזן את הפקודות להפעלת XSCALE ו- XDSCONV. כדי לקבוע את השלב ללא פריט פיזור חריג, השתמש בקואורדינטות 4P X, Y, כדי להכין את המודל ההתחלתי להחלפה מולקולרית. מקובץ PDB, השתמש בעורך הקבצים PDB Phenix כדי לחלץ את מונומר A כדי לחתוך חומצות האמינו שלה אלנין.הפעל X עם קובץ ההשתקפות שנוצר על-ידי XDSCONV והרצף כקלט. בדוק את קובץ יומן הרישום מ- Xtriage. שים לב להשלמות, למספר יחידות המשנה ביחידה האסימטרית, לאניסוטרופיה, לנוכחות טבעות הקרח ולמופע התאומים.כדי להפעיל את Phaser-MR בפניקס להחלפה מולקולרית, בחר את קובץ ההשתקפות, את הרצף ואת מודל 4P six Y ההתחלתי נחתך בפוליאלנין ולחץ על הפעל. עם השלמת, לבדוק אם המודל נמצא ולבדוק את הציון של ההחלפה המולקולרית. ציון Z גורם תרגום של לפחות שמונה, מציין כי הפתרון הוא בהחלט נכון.לאחר קביעת השלב לפי החלפה מולקולרית, בחר הפעל מבנה אוטומטי ולחץ על הפעל. כל הקבצים הדרושים יתווספו באופן אוטומטי. עם השלמתו, בדוק את המודל ב- COOT ולבנות ולמקד את המודל באופן ידני, על פי מפת צפיפות האלקטרונים ב- COOT.באמצעות מודל זה, הרצף ואת נתוני העקמומיות כמו קלט, לחדד את המודל אוצרות ידנית Phenix, בהתייחסו Phenix כדי לעזור לבחור את האסטרטגיה הנכונה. לאחר עידון לבדוק את התוצאות, עידון חינם עבודת עידון חייב להקטין. מחווני MolProbity חייבים להיות מכובדים וחריגים עם מתאם חלל ריאלי נמוך, חייבים להיות מוגבלים.כאשר המודל המעודן הטוב ביותר נוצר, להפעיל MolProbity בשרת ולבדוק את כל החריגים שזוהו על ידי התוכנית. ניתן להשתמש כרומטוגרפיה של הדרת גודל כדי לקבוע את המשקל המולקולרי לכאורה של החלבון המטוהר. מצב התגבשות של פפטיד, ניתן לייעל על ידי שינוי ה- pH לעומת ריכוז PEG סביב מצבו של עמום.לדוגמה, הטוב ביותר TmPep1050 H60A H307A גבישים, הושגו 0.1 ציטראט נתרן טוחנת עם pH של 5.2 ו 20%PEG 3350 ריכוז, לאחר מחזור אחד של זריעת מיקרו כדי לשפר את גבישיות מיקרו. בניתוח זה, אינדקס נתונים הראה כי קבוצת החלל של הגביש TmPep1050 H60A H307A היה C2221, אבל XDS הציע פתרון אחר, קבוצת החלל MP. המבנה של TmPep1050 H60A H307A, ניתן להשלים לאחר מספר מחזורים של עידון אוטומטי וידני.אישור המצב האוליגומרי עם משטח ממשק של 1, 710 אנגסטרום מרובע בין שני מונומרים ואנרגיה חופשית של היווצרות ממשק של מינוס 16.2 קילוקלוריות לכל שומה. כאן, תקריב של TmPep1050 H60A H307A אתר פעיל בהשוואה לאתר הפעיל של TmPep1050 עמום ו dodecamer ניתן לראות. בעת בניית מודל לדאוג לבנות רק את מה שאתה רואה בצפיפות האלקטרונים כדי למנוע פרשנות יתר, את הנתונים, ולקחת את הזמן כדי ללטש את המודל שלך.המשקל המולקולרי של עמום ו dodecamer יכול להיקבע גם על ידי ספקטרומטריית מסה מקומית. והשיטות יכולות להיות שימושיות לגילוי אוליגומרים מעבר.

x-ray-crystallography-to-study-oligomeric-state-transition-thermotoga

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי וטיהור של סלמונלה טיפוס סינתאז comp פרוטוקול זה מערכת מהירה כדי לטהר את קומפלקס החלבון ביום. שיטות מכוסות הן מוטאגנסיס מכוונת אתר, ביטוי חלבון ב Escherichia coli, כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, והתגבשות.

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

למדו קריסטלוגרפיית רנטגן לחקר המעבר האוליגומרי של TmPep1050 מדימר לאקטיב לדודקאמר אקטיבי. שיטה זו מאפשרת ניתוח מבני של אמינופפטידאזים ומנגנוני פעילות תלויים אוליגומריזציה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

גלה סרטונים נוספים