Name: מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למד מדידה רציפה של מעגלים גנטיים ב-Escherichia coli באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן. שיטה זו מאפשרת חישוב שונות האות ויחס האות לרעש בתאים בודדים להערכת ביצועי המעגל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למר גיל גלברט (הפקולטה להנדסת חשמל בטכניון) על הסיוע בקוד MATLAB. אנו מודים לד"ר שימינג לי (הפקולטה להנדסה ביו-רפואית בטכניון) על שסייע בהגהה של מאמר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן משפחת נויבאואר ומשרד המדע הישראלי, מענק 2027345.

1. הכנת מדיה ותרבות
<ol><li>הכן פתרון מלאי של 1,000x קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל) או אנטיביוטיקה רלוונטית.<ol>
<li>. שוקל 0.5 גרם של קרבניצילין. הוסף 10 מ"ל של סטרילי H2O. להתמוסס לחלוטין.</li>
		<li>לעקר מניית קרבניצילין באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. Aliquot פתרון אנטיביוטי ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להכין מרק lysogeny (LB) צלחות, לערבב 5 גרם של טריפטון, 5 גרם של NaCl, 2.5 גרם של תמצית שמרים ו 7.5 גרם של אגר Bacto עם 0.5 L של H סטרילי2O. Autoclave הפתרון ב 121 °C (60 °F) במשך 20 דקות.<ol>
<li>שקועים חלקית בתערובת הג'ל המותכת באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס. הוסף 1,000 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).</li>
		<li>מכינים מנות פטרי בסביבה סטרילית. השאירו את הצלחות כדי להגדיר לפני אחסון אותם במקרר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדיה מינימלית M9, הכינו פתרונות מלאי נפרדים של הדברים הבאים: 5x מלחי M9 (56.4 גרם לליטר), 2 מ' גלוקוז ו-2% חומצות קאסאמינו נטולות ביוטין. מובלעת אוטומטית את הפתרונות ב 121 °C (69 °F) במשך 20 דקות.</li>
	<li>להכנת 5 צלחות פטרי, מערבבים 1125 מ"ג של אגר נמס נמוך ו 400 מ"ג אגר עם 89.2 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9). הוסיפו 10 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמאייר של 250 מ"ל. הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק.</li>
	<li>מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 3 עד 4 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר. הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה.</li>
	<li>מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) כדי לערבב עוד יותר על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הדליקו את הלהבה על ספסל היציקה.</li>
	<li>הוסף במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא: 800 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol]) 100 μL של תיאמין (B1) 1100 μL של גלוקוז (2M) 100 μL של קרבניצילין (50 מ"ג / מ"ל).</li>
	<li>מערבולת בקבוק ארלנמייר כדי להבטיח הפצה שווה של כל החומרים ברחבי אגר.</li>
	<li>פותחים צלחת אחת בכל פעם ליד הלהבה ומתחילים לשפוך.<ol>
<li>השאירו את הצלחות על הספסל במשך כמה דקות עד התגבשות ראשונית.</li>
		<li>הופכים את הצלחות כדי למנוע עיבוי מים לטפטף על הג'ל.</li>
		<li>השאירו את הצלחות כדי לחזק בטמפרטורת החדר במשך כ 2 שעות.</li>
		<li>לאחר הצלחות יש מוצק ומיובש, הם יכולים להיות מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. זני חיידקים ובניית פלסמידים
הערה: המעגל הגנטי מכיל חלק אחד; חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המונע על ידי מקדם PtetO וכתוצאה מכך ביטוי מכונן. כל הפלסמידים בעבודה זו נבנו בטכניקות שיבוט מולקולריות בסיסיות והפכו לאשריצ'יה קולי 10β, באמצעות פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי24. המבנה הסופי הפך Escherichia coli MG1655 סוג הבר זן לבדיקה.
<ol><li>להפוך את הפלסמיד הרצוי לתאי Escherichia coli MG1655 עם פרוטוקול זעזוע חום סטנדרטי24.</li>
	<li>לגדל את התאים שהשתנו על צלחת אגר LB לילה ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: ניתן לשמור על מנות פטרי משלב 2.2 עד 3 ימים לשימוש מיקרוסקופי.</li>
	<li>לחסן מושבה אחת לתוך 5 מ"ל של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית בצינור זכוכית.</li>
	<li>לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) עם 250 סל"ד רועד מהירות באינקובטור במשך 2 שעות עד הנוזל מעונן.</li>
	<li>הכן 1 מ"ל של פתרון דילול כדלקמן: 892 μL של מדיה מינימלית (1x M9) 8 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol]) 100 μL של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol]) 1 μL של תיאמין (B1) 11 μL של גלוקוז (2 מטר) 1 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית<ol>
<li>מערבבים ומסתובבים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל את תרבות התא (1:30) משלב 2.4 לתוך צינור 2 מ"ל על ידי הוספת 30 μL של צמיחת קולי Escherichia ל 1000 μL של פתרון דילול (שלב 2.5).</li>
	<li>דגירה הצינור במשך 1 שעה עם רועד (250 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לגדול 40 μL - 60 μL על לוחות M9 מוכן בשלב 1.10. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. הערה: הצפיפות האופטית (OD600nm)לציפוי צריכה להיות סביב 0.1.</li>
	<li>מניחים עד שלוש צלחות זכוכית 35 מ"מ התחתון על הספסל. הערה: ודא שלזכוכית הצלחת יש את העובי הנכון עבור עדשות המיקרוסקופ המשמשות.</li>
	<li>הכינו את התרבות לזריעת צלחות ג'ל, חזרו על שלבים 2.3 עד 2.6 למושבות מהצלחת שהוכנו במדידות מיקרוסקופ בשלב 2.9.</li>
	<li>הכינו את הפתרון הבא להכנת שלוש לוחות מיקרוסקופ.<ol>
<li>מחממים את אמבט המים ל 60 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש לערבב 112.5 מ"ג של אגר נמס נמוך ו-40 מ"ג אגר עם 8.92 מ"ל של מדיה מינימלית (1x M9) ולהוסיף 1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [vol/vol]) בבקבוק ארלנמייר של 25 מ"ל. הערה: הקפד לשפוך את המדיה על השפתיים הפנימיות של הבקבוק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיקרוגל הפתרון בצרורות קצרים של 2 עד 3 שניות. חזור על הפעולה עד שהפתרון יתבהר. הערה: הקפד לא להגיע לנקודת רתיחה.</li>
	<li>מניחים את הבקבוק ארלנמאייר 25 מ"ל באמבט מים חמים (60 מעלות צלזיוס) לערבוב נוסף על ידי דיפוזיה, ולהשאיר אותו להתקרר על הספסל עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת רפידות agarose
<ol><li>ספסל נקי עם 70% אתנול. סרט מתיחה על הספסל הנקי. ודא שהקלטת חלקה ומפולסת.</li>
	<li>הכינו שני כיסויים: אחד בקלטת והשני בקרבת מקום. הכינו כיסוי.</li>
	<li>הסר בקבוקון (מוכן בשלב 2.14) מאמבט מים, לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולהשאיר אותו להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45-50 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להפוך את פתרון הג'ל, לערבב במהירות את כל הפתרונות בסדר הבא: 80 μL של 50% גליצרול (0.4% [vol/vol]) 1 מ"ל של 2% חומצות קאסאמינו (0.2% [wt/vol]) 10 μL של תיאמין (B1) 110 μL של גלוקוז (2 M) 10 μL של אנטיביוטיקה רלוונטית.</li>
	<li>יוצקים 1.5 מ"ל של הג'ל על העטיפה ומכסים אותו בחתיכה השנייה מכינים "כריך".</li>
	<li>החזירו את הארלנמייר לאמבטיית המים החמים. מכסים את הכריך עם המכסה ומגדירים טיימר במשך 20 דקות.</li>
	<li>במקביל, דגירה הצינור משלב 2.11 עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F) עם רועד (250 סל"ד)</li>
	<li>לאחר 20 דקות להפוך את הכריך (שלב 3.5), לכסות אותו ולהשאיר לנוח במשך 1 שעה. הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר להשאיר את "כריך" לנוח ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלב 3.8.</li>
	<li>זרע Escherichia coli תרבות משלב 3.7 על ידי pipeting המדגם על צלחת 35 מ"מ. הערה: Pipeting 6 μL של תאים כמו טיפות קטנות נפרדות נותן את התוצאות הטובות ביותר.</li>
	<li>אפשר את הטיפות להתייבש, לפחות 15 דקות ועד 30 דקות.</li>
	<li>לחשוף את הג'ל המוצק של הכריך משלב 3.8 על ידי החלקת הכיסוי משם.</li>
	<li>חותכים כריך לרפידות בודדות קטנות עם פונץ' ביופסיה או טיפ.</li>
	<li>להישען אותו בעדינות על המדגם (שלב 3.9). השאירו את המנה במשך 20 דקות על הספסל.</li>
</ol>4. הכנת המדגם להדמיית מיקרוסקופיה
<ol><li>הסר את הבקבוק מאמבט מים משלב 3.6. לנגב את החלק החיצוני של הבקבוק נקי ולתת מגניב לטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס). הערה: הסר את הבקבוק בשלב 4.1 כ-3 דקות לפני סיום שעון העצר.</li>
	<li>יוצקים 3 מ"ל של הג'ל כל הזמן להיקף הצלחת בתנועה מעגלית. השאירו להתמצק במשך כמה דקות.</li>
	<li>לאטום צלחות עם קלטת לנקב כמה חורים עם מחט 25 G. הופכים את כל הכלים כדי למנוע עיבוי מים נוטף על הג'ל.</li>
	<li>דגירה כל הכלים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה תוך מניעת מיטוזה התא. הערה: השאירו דגימות ב-4°C למדידות רצופות, לא יותר מיום אחד.</li>
	<li>הפעל את המיקרוסקופ לפי הוראות היצרן.</li>
	<li>מצא את המוקד הראשוני באמצעות עדשת ההגברה הנמוכה ביותר ונהל מערכת מיקוד אוטומטית (AFS).</li>
	<li>השתמש בשמן במידת הצורך, להטביע את העדשה עם שמן ולהפיץ אותו בזהירות על ידי הזזת הצלחת עם בקר פלטפורמה (לא באופן ידני) ו AFS יכול להיות מעורב שוב.</li>
	<li>השתמש חתך יחסית בכיוון Z, בעקבות הצעת ברירת המחדל עבור חתכים שלב Z. הערה: צילמנו תמונות שדה בהירות כל 5 דקות ותמונות פלואורסצנטיות כל 20 דקות. לפעמים המיקוד צריך להיות מותאם במהלך 30 הדקות הראשונות. חימום מראש של קופסת החממה והשמן של המיקרוסקופ, תוך קירור המדגם נוטה לסייע בהפחתת אובדן המיקוד הראשוני.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
הערה: כדי לעבד נתוני מיקרוסקופיה, עיצבנו תוכנה מבוססת מחשב ב- MATLAB. תוכנה זו מאפשרת זיהוי של גבולות התא מתמונות tiff שדה בהיר ומקטעים וממיין תאים לפי אזור. הפלט של ניתוח תמונה זה יכול לשמש כמסכה על תמונות טיפ פלואורסצנטיות כדי להפיק רמות עוצמת תא ולבטל חפצים בתחום הפלואורסצנטי כגון הילה של התא עקב מגבלות רזולוציית מיקרוסקופ. התוכנה שפותחה נוצרה בהשראת עבודותדומות 7,25,26,27,28,29,30 ומספק פתרון אלגנטי המותאם למעבדה.
<ol><li>תחילה, הגדר את הפרמטרים הבאים main_code.m.<ol>
<li>הגדר את התיקיה של תמונות הרכישה.</li>
		<li>הגדר את פרק הזמן של התמונה - שלב זמן ערוץ שדה בהיר בדקות.</li>
		<li>הגדר את תדירות GFP - קצב הרכישה של תמונות GFP.</li>
		<li>הגדר את רזולוציית המיקרוסקופ (כלומר, כמה פיקסלים שווים ל- μm אחד).</li>
		<li>הגדר טווח סל היסטוגרמה - טווח אזור תאים. הערה: תהליך סיווג הנתונים לפי אזור התא דומה לעקרונות של גטינג בניתוח נתוני cytometry זרימה. שערים ממוקמים סביב אוכלוסיות של תאים בעלי מאפיינים משותפים, בדרך כלל מפוזרים קדימה וצדדים מפוזרים, כדי לבודד ולכמת אוכלוסיות אלה של עניין. מיקרוסקופיה מאפשרת שער, לחקור ולכמת מספר קבוצות תאים.</li>
		<li>הגדר ליבת קונבולוציה (3,3) - פרמטר זה מזהה גבולות תאים על ידי סף כללי (count_cells.m). הערה: התקנה זו נדרשת רק בעת שינוי המעבדה או המיקרוסקופ. התוכנה דורשת את ערוץ שדה בהיר הקלט להיות מסומן עם אינדקס c1, ערוץ פלואורסצנטי שכותרתו c2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל main_code.m, אשר יפעיל את כל קבצי ה- Script האחרים באופן אוטומטי (count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>התוכנית מקטעת באופן אוטומטי תמונות שדה בהיר (ראה איור משלים 2.4).</li>
		<li>שלב את תמונת הפילוח עם תמונת פלואורסצנט (GFP) כדי לחלץ את רמת העוצמה לכל תא.</li>
		<li>חשב את הגרף של כמות התאים לפי זמן והתאם בהתאם לצמיחה מעריכית.</li>
		<li>חשב את הממוצע וסטיית התקן (STD) עבור כל טווח אזור תאים.</li>
		<li>חשב את יחס האות לרעש (SNR) עבור כל טווח אזור תא.</li>
		<li>התווה והתאם את התפלגות כמות התאים לפי עוצמה.</li>
		<li>חשב את מקדם השונות (CV) והשווה לנתוני מנתח הזרימה. הערה: התוכנה תעניק כפלט את תמונות הפילוח הסופיות להתאמת conv_kernel בתיקיה חדשה "folder/Segmented". התוכנה תיתן כפלט את הגרפים בתיקיה חדשה "folder /Graphs שלך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>על מנת להשוות בין ניסויים, להשתמש compare_experiments.m.<ol>
<li>הגדר ספריות עבור הגרפים השמורים והכתובת עבור הספריה \CompareResult.</li>
		<li>הפעל את הקובץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+analog+computation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic analog computation in living cells.</a> Nature. 497, 619-623 (2013).</li>
<li>Yang, X. S. Y., L, A. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang%2C+XSY+%22Imaging+Bacterial+Molecules%2C+Structures+and+Cells%22">Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells</a>. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).</li>
<li>Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+agar+pad+method+for+mycobacterial+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedcentral+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A modified agar pad method for mycobacterial live-cell imaging.</a> Biomedcentral Research Notes. , (2011).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> ChemPhysChem. , (2006).</li>
<li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64, 2240-2246 (1998).</li>
<li>Barger, N., Litovco, P., Li, X., Habib, M., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+metabolic+computation+in+a+bioluminescence-sensing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic metabolic computation in a bioluminescence-sensing system.</a> Nucleic Acids Research. , (2019).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nature Protocols. , (2012).</li>
<li>Swain, P. S., Elowitz, M. B., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+contributions+to+stochasticity+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic contributions to stochasticity in gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. , (2002).</li>
<li>Baumgart, L., Mather, W., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+DNA+cycling+across+a+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synchronized DNA cycling across a bacterial population.</a> Nature Genetics. , (2017).</li>
<li>Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+biological+noise+via+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Determining biological noise via single cell analysis.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , (2009).</li>
<li>Nielsen, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+circuit+design+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic circuit design automation.</a> Science. , (2016).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Pedraza, J. H., Van Oudenaarden, A. Noise propagations in gene networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPedraza%2C+JH+%22Science%22">Science</a>. , (2005).</li>
<li>Jennifer, A. N. B., Christopher, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. , (2014).</li>
<li>Aoki, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+biomolecular+integral+feedback+controller+for+robust+perfect+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal biomolecular integral feedback controller for robust perfect adaptation.</a> Nature. , (2019).</li>
<li>Hanna, H. A., Danial, L., Kvatinsky, S., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanna%2C+HA+%22Cytomorphic+Electronics+with+Memristors+for+Modeling+Fundamental+Genetic+Circuits%22">Cytomorphic Electronics with Memristors for Modeling Fundamental Genetic Circuits</a>. 4545, (2020).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+noise+in+ultrasensitive+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Attenuation of noise in ultrasensitive signaling cascades.</a> Biophysical Journal. , (2002).</li>
<li>Thattai, M., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+noise+in+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States%22%5BJournal%5D)">Intrinsic noise in gene regulatory networks.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States. , (2001).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. , (2005).</li>
<li>Van Der Ziel, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Ziel%2C+A+%22Noise+in+Measurements%22">Noise in Measurements</a>. , Wiley & Sons Inc. (1976).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd Edition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Press%22">Cold Spring Harbor Laboratory Press</a>. , (1989).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. , (2006).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+An+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. , (2016).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Stylianidou, S., Brennan, C., Molecular, S. B. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStylianidou%2C+S+%22SuperSegger%3A+robust+image+segmentation%2C+analysis+and+lineage+tracking+of+bacterial+cells+-+Stylianidou+-+2016+-+Molecular+Microbiology%22">SuperSegger: robust image segmentation, analysis and lineage tracking of bacterial cells - Stylianidou - 2016 - Molecular Microbiology</a>. , Wiley Online Library. (2016).</li>
<li>Balomenos, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+driven+single-cell+analytics+for+systems+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedcentral+System+Biology%22%5BJournal%5D)">Image analysis driven single-cell analytics for systems microbiology.</a> Biomedcentral System Biology. , (2017).</li>
<li>Smit, J. H., Li, Y., Warszawik, E. M., Herrmann, A., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicoords%3A+A+Python+package+for+the+analysis+of+bacterial+fluorescence+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colicoords: A Python package for the analysis of bacterial fluorescence microscopy data.</a> PLoS One. , (2019).</li>
<li>Guido, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bottom-up+approach+to+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A bottom-up approach to gene regulation.</a> Nature. , (2006).</li>
<li>Beal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-to-noise+ratio+measures+efficacy+of+biological+computing+devices+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. , (2015).</li>
<li>Marr, D., Hildreth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+-+Biology+Science%22%5BJournal%5D)">Theory of edge detection.</a> Proceedings of the Royal Society - Biology Science. 207, 187-217 (1980).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+Systems+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions Systems Man Cybernetics. , (1979).</li>
<li>Soille, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoille%2C+P+%22Morphological+Image+Analysis%3A+Principles+and+Applications%2C+Second+edition%22">Morphological Image Analysis: Principles and Applications, Second edition</a>. , (2000).</li>
<li>Bradley, D., Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Thresholding+using+the+Integral+Image%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Graphics+Tools%22%5BJournal%5D)">Adaptive Thresholding using the Integral Image.</a> Journal of Graphics Tools. , (2007).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. , (1994).</li>
<li>Maurer, C. R., Qi, R., Raghavan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+time+algorithm+for+computing+exact+Euclidean+distance+transforms+of+binary+images+in+arbitrary+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine%22%5BJournal%5D)">A linear time algorithm for computing exact Euclidean distance transforms of binary images in arbitrary dimensions.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine. , (2003).</li>
<li>Millo, R., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+maturation+time+for+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+by+Numbers%22%5BJournal%5D)">What is the maturation time for fluorescent proteins.</a> Cell Biology by Numbers. , (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעבודה זו פיתחנו פרוטוקול המאפשר מעקב ממוחשב אחר תאים חיים של Escherichia coli, בעקבות חלוקה ורמות פלואורסצנטיות על פני תקופה של שעות. פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הדינמיקה הסטוצ'סטית של מעגלים גנטיים ב Escherichia coli על ידי מדידת CV ו SNR בזמן אמת. בפרוטוקול זה השווינו את ההתנהגויות הסטוצ'סטיות של שני מעגלים שונים כפי שמוצג באיור 10. הוכח כי פלסמידים עם מספרי עותק נמוך נוטים יותר אפקטים stochastic ופחות מושפע חלוקת התא. המעגל הראשון ביטא באופן מכונן GFP (איור 10a), ...

ביולוגיה סינתטית היא תחום רב תחומי שהתגלה בעשור האחרון ומטרתו לתרגם עקרונות תכנון הנדסי לתכנון ביולוגי רציונלי1,2,3 , במאמץ להשיגאינטגרציהועיבוד רב-תחומי בתאים חיים להבנת המדע הבסיסי4,5, יישומים אבחון, טיפולי וביוטכנולוגי6,7,8,9,10. היכולת שלנו לכמת את תגובת פלט הקלט של מעגלי גנים סינתטיים עברה מהפכה על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיה חד-תאית, כולל מנתח הזרימה והדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות11. מנתח זרימה משמש לעתיםקרובותכדי למדוד את התגובה של מעגלים אלה במצב יציב 1,12, מיקרוסקופיה הפוכה משמשת למדידת התגובה הדינמית של מעגלי גנים סינתטיים ברמה של תא יחיד3. לדוגמה, אחת העבודות המוקדמות בביולוגיה סינתטית כללה בניית רשתות מתנד גנטיות בתאים חיים באמצעות לולאות משוב שליליות עם עיכוב3. מאוחר יותר, מעגלי המתנד הגנטי הוחלו כדי להבין שליטה מטבולית בסביבה הדינמית של תאיםחיים 4. מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן לשגות היא שיטה אחת לאפיין מעגלים כאלה. אנו משערים כי התאים המארחים, Escherichia coli, לסנכרן בעת יצירת מושבות מיקרו, המאפשר מדידה של אות וחישוב של רעש מבלי לעקוב אחר יחסי אם ובת מדויקים.
רעש הוא היבט בסיסי, אינהרנטי של מערכות ביולוגיות הנובעות לעתים קרובות ממקורות מרובים. קחו לדוגמה, תגובות ביוכימיות המערבות אותות שמקורם בהובלת נשאים אקראיים נפרדים כגון דיפוזיה של חלבונים13. אותות אלה מתפשטים עם תנודות אקראיות14. מקורות רעש אחרים הם זמינות משאבים, חלוקת תאים ושינויים בתנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ולחץ. אותות ביולוגיים המתפשטים במעגלי גנים סינתטיים לעיתים קרובות יש אות נמוך מאוד יחס רעש (SNR), אשר מפריע לביצועים של מעגלים כאלה. לכן, תכנון מעגל גנטי נשאר אחד ההיבטים המאתגרים ביותר שלהנדסה גנטית 15. לדוגמה, בניגוד לרוב הגישות המחשבות רק את ביטוי הגנים הממוצע (הנמדד על פני אוכלוסיית התאים כולה), השונות של האות הנמדד נחשבת על מנת להנדס התנהגות צפויה באמצעות רשתות גנים סינתטיות12. ככזה, רמות השונות או הרעש בביטוי החלבון ממלאות תפקיד דומיננטי בעיצוב וביצועים של מעגלי גנים אנלוגיים ודיגיטליים1,16,17.
גישות רבות פותחו כדי לכמת את השונות בין תא לתא, כולל ב Escherichia coli3,7,18. שיטות אלה משמשות לעתים קרובות לחקר הפעלת גנים ומסלולים מטבוליים, אולם עם פחות התמקדות בחקר דינמיקת רעש סטוכסטי, כמו מדידה והתנתקות של מקורות רעש ספציפיים, במיוחד עבור מעגלים גנטיים בתאים חיים שבהם זהו אתגר בסיסי19,20,21. מספר גורמים, שניהם תורשתיים למעגל עצמו (מהותי) ונגזרים מהתאים המארחים (חיצוניים), יכולים להפריע לביצועים המתמשכים של מעגלים גנטיים. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול שמטרתו לכמת את הרעש הכולל בתאי קולי Escherichia, כולל מקורות רעש מהותיים ו extrinsic6,22. על ידי כימות הרעש הכולל ולאחר מכן הערכת SNR23, העיצוב של מעגלי גנים ניתן לשפר. שיטה זו ניתנת לשינוי כדי למדוד מקורות רעש עצמאיים בנפרד, על ידי ניטור מספר חלבונים פלואורסצנטיים6,20. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, אנו שומרים על התנאים הסביבתיים מבוקרים היטב ומודדים ללא הרף את פעילות התאים ללא השפעה של גורמים חיצוניים. אנו מודדים את האות מחלבונים פלואורסצנטיים בתאים בודדים לאורך זמן ובו זמנית מדימויים אותם תחת מצע אגרוז. התמונות המתקבלות מנותחות באמצעות MATLAB המותאם אישית של המעבדה.
באופן אידיאלי, מדידה רציפה של הפעילות בזמן אמת של חלבונים פלואורסצנטיים בתוך התא תייצר נתונים מדויקים באמצעות הצמיחה והחלוקה של התאים. עם זאת, זה מאתגר לרכוש נתונים כאלה. זאת בשל השפלה של חלבונים פלואורסצנטיים, המכונה הלבנת תמונות7, כאשר הם נחשפים לקרינה בתהליך העירור. יתר על כן, תאי קולי Escherichia רגישים גם עבור עירור, אשר עלול להוביל phototoxicity7. שתי הבעיות מגבילות את כמות מסגרות התמונות שניתן להשיג ואת הזמן בין רכישות. מצע וסוגים בינוניים (למשל, מרק lysogeny) המשמש לגידול התאים במהלך ההדמיה יש גם תפקיד קריטי. מומלץ מאוד להשתמש במדיום מינימלי, הממזער רקע שאינו פלואורסצנטי ומאריך את זמן חלוקת התאים.
יתר על כן, המדגם צריך להיות מוכן בהתחשב בדרישות הבאות (1) שיעור חלוקת תאים נמוך מאפשר חשיפות תכופות פחות עבור הדמיה צמודה מחזור החלוקה והפחתת ההסתברות של phototoxicity ו photobleaching. הגדרנו את זמן הרכישה לכמחצית מזמן המיטוזיס החזוי (2) צפיפות תאים נמוכה בתחילת הניסוי מאפשרת אחידות ויכולת מעקב טובות יותר של החלוקה. צפיפות התאים מושפעת מיחס הדילול של תאי קולי Escherichia, המהווה פרמטר משמעותי להצלחת פרוטוקול זה ויש לקבוע אותו עבור כל מעבדה. על מנת לקבוע את היחס, כל זן קולי חדש של Escherichia או מדיה בשימוש צריך להיות מצויד גרפים קצב הצמיחה (איור משלים 1). יחס מתאים הושג אם תאים יכולים לגדול ללא רעידות נוספות לאחר דגירה קצרה מתוך צפיפות ראשונית של כ OD600nm = 0.1. תאים בשלב זה יתחלקו בהתאם לטמפרטורת הסביבה בלבד (3) הגבלת תנועת התאים: תנועת התאים תלויה מאוד בתקיפות המצע (כרית agarose). מוצקות המצע תלויה בכמות ההתעוררות הכוללת ובזמן התמצקות הג'ל. ג'לים לא ניתן להשאיר כדי לחזק את הלילה בטמפרטורת החדר, כמו קולי Escherichia יעבור מיטוזה. גורמים אחרים המשפיעים על יציבות המצע כוללים את כמות המים במדגם והלחות. נושאים נוספים נידונים בפירוט בתוצאות הנציגות. פרוטוקול זה מספק פרטים רבים ועובר בהדרגה משלב אחד למשנהו. הפרוטוקול מציע יציבות ארוכה לניסויי הדמיה ומספק כלי בסיסי לעיבוד תמונה.

<table><tbody><tr><td>צלחת זכוכית 35 מ"מ</td><td>בעובי</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>המתאימה לעדשת מיקרוסקופ.</td></tr><tr><td>אגרוז&nbsp;</td>הכנה <td>לונזה</td><td>5004</td><td>LB</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K3007</td><td>משרה</td></tr><tr><td>בקטו טריפטון&nbsp;</td><td>BD - בקטון, דיקינסון ושות'&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB preperation</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>חומצות קסאמינו&nbsp;</td><td>BD - בקטון, דיקינסון ושות'&nbsp;</td><td>223050</td><td>תמיסת מדיה מינימלית</td></tr><tr><td>ליקוי חמה Ti</td><td>ניקון</td><td></td><td>מיקרוסקופ הפוך</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td>תמיסת מדיה מינימלית</td></tr><tr><td>גליסרול</td><td>ביו-מעבדה</td><td>000712050100</td><td>מצע מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>4449600000000</td><td>שמן טבילה</td></tr><tr><td>M9 תמיסת מלח&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>פתרון מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB preperation</td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>מצע מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>קלטת פרפילם</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>מתייחס כקלטת בטקסט</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>מצע מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>thaymine B1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T0376&nbsp;</td><td>פתרון מדיה מינימלי</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD - בקטון, דיקינסון ושות'&nbsp;</td><td>הכנה של 212750</td><td>ליברות</td></tr></tbody></table>

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

הפרוטוקול שפותח כאן מציע כלי המאפשר מעקב ממוחשב אחר חטיבת קולי Escherichia ורמות פלואורסצנט על פני מספר שעות. התהליך מתחיל בסינון מושבות ששורדות על מדיה מינימלית, בהנחה שרק Escherichia coli מחסה פלסמיד הנכון יוכל לשגשג בתנאים הספציפיים. מכיוון שתהליך בניית מעגלים גנטיים גדולים, הדורש הרכבה של חלקי דנ"א רבים, הוא מאתגר, רכיבי מעגלים מופצים לעתים קרובות בין פלסמידים מרובים במספרי העתק שונים הדורשים שימוש במספר אנטיביוטיקה. מוטציות בפלסמיד יכולות להרוס את שעתוק הגנים של עמידות לאנטיביוטיקה ולהצטלב עם ניהול משאבים בתא המוביל לנמק. המושבה שנבחרה ממוקמת על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וכמה מישורי מיקוד נבחרים למעקב אחר מיקרוסקופיה הן בתחומים בהירים והן בתחומים פלואורסצנטיים. הפרוטוקול שומר על מוקד התמונה במשך יותר מ -12 שעות בתנאים ראשוניים שלא ניתן לווסת, ויוצר כמה קשיים. לדוגמה, תאים מתים מתחילים להצטבר בשדה המיקוד של העדשות לאחר כמה שעות של הדמיה, מה שגורם לרעלים להצטבר והאות לטשטש ולהתנוון. דלדול של חומרים מזינים מציג תהליכים מטבוליים חדשים לעכב את התגובה הרצויה של המעגל. טמפרטורת הניסוי מורידה את ההשפעה של גורם ואנטיביוטיקה, אשר יכול לפגוע עוד יותר את האמינות של האות. ג'ל המדיה המינימלי מתכווץ ומתייבש, וכתוצאה מכך המיקוד האופטי משתנה עם הזמן. פיתחנו שיטה זו כדי להתגבר על אתגרים אלה Escherichia coli, בדומה לעבודות קודמות פיתוח שיטות אנלוגיות עבור מיקרו אורגניזמים אחרים. בנוסף, שיטה זו מציעה אלגוריתם לכימות הרעש הסטוצ'סטי הכולל בתאים ללא שינוי ושינוי, ומוצאת כי התוצאות עולות בקנה אחד עם תחזיות מנתח זרימה כפי שמוצג על ידי מקדם דומה של וריאציה (CV).

התוכנה מנתחת תמונות תחום שדה בהיר כי הם מחוץ לבן ושחור. קולי Escherichia ייראה כמו צורות מלבניות שחורות על רקע לבן מחוץ למגוון דינמי של זוהר צריך להראות ספייק במרכזו (איור 1). בתמונות פלואורסצנטיות תאים עשויים להיות הילה קטנה, אך עדיין ניתן לפתור תאים בודדים עם צורות מלבניות. אירוע מיטוזה צריך להיות מזוהה תחילה לאחר 30 דקות. מיקוד המיקרוסקופ צריך להישאר יציב לאורך זמן ולמרות שהתאים עשויים לנוע לאט במהלך 30 הדקות האלה, הם לא צפויים לעזוב את שדה הראייה. ניסוי כזה ייחשב טוב וניתן לצפות...

עבודה זו מציגה שיטת מיקרוסקופיה המאפשרת הדמיה חיה של תא יחיד של Escherichia coli לניתוח וכימות של ההתנהגות הסטוקסטית של מעגלי גנים סינתטיים.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

פרוטוקול זה במדידה רציפה של מעגלים גנטיים ב- E.coli וחישוב שונות האות ויחס אות לרעש בתא חיידקי בודד כדי להעריך את ביצועי המעגל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת להתאמה בקלות לזנים ומעבדות שונות, דורשת הכשרה מינימלית וללא ציוד מיוחד, והיא זולה יחסית. רעש הוא תפקיד משמעותי בקביעת הפונקציונליות של מערכות ביולוגיות.נכון לעכשיו, יש עניין בבניית מעגלי גנים בקנה מידה גדול. מערכות אלה יכולות להיות מעוכבות על ידי רעש הקפד לייבש את הדגימות היטב, כדי לשמור על רפידות צמרמורת ב 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל האפשר, לחתוך ולחלק את החלקים בסבלנות ובעדינות. כדי להכין את החיידקים לניתוח לחסן מושבה אחת מתרבות E.coli חוצה.לדוגמה, מעגל עם כתב GFP. בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB להשלים אותו עם אנטיביוטיקה רלוונטי. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן.בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול במיני צנטריפוגה מיני מיליליטר שני מיליליטר, ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר. לאחר מכן, דגירה את התרבות במשך שעה אחת עם רועד לפני זריעת 40 עד 60 microliters של השעיה זו על צלחות תרבות M9. כדי להכין את החיידקים לניתוח, לחסן מושבה אחת מתרבות E.Coli חוצה.לדוגמה, מעגל עם כתב GFP בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן. בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול בצינור מיני מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר.ואז להדגיר את התרבות במשך שעה אחת עם רעידות. להכנת לוחות מיקרוסקופ, מערבבים 112.5 מיליגרם של אגר נמס נמוך עם 40 מיליגרם אגר, ומיליליטר אחד של 2% חומצת קאסאמינו בבקבוק ארלנמייר 25 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 8.92 מיליליטר של מדיום מינימלי על השפתיים הפנימיות של בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר ומיקרוגל הפתרון וכתוצאה מכך קצר, שניים עד שלושה התפרצויות שניות.ואז להגדיר את אמבט המים ל 55 מעלות צלזיוס. כאשר הפתרון ברור, מניחים את בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר באמבט מים 60 מעלות צלזיוס ולאפשר את הפתרון אגר להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45 עד 50 מעלות צלזיוס. בזמן שהאגר מתקרר, נקו את ספסל המעבדה עם 70% אתנול והחליקו חתיכת סרט מעבדה על הספסל הנקי.מניחים כיסוי זכוכית אחד להחליק על הקלטת ומניחים תלוש כיסוי שני בקרבת מקום. הוסיפו תמיסת אגר מקוררת לאנטיביוטיקה ולתמיסה המתאימה. יוצקים 1.5 מיליליטר של פתרון ג'ל טרי מוכן על פתק הכיסוי ממוקם מעל הקלטת ומניחים את החלקת הכיסוי השנייה על הג'ל, מקפידים להימנע בועות.החזירו את ארלנמייר לאמבט המים החמים וכסו את תלושי הכיסוי במשך 20 דקות. הופכים את פתקי הכיסוי במשך שעה דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את הכיסוי מחליק מן הג'ל היבש לחתוך כרית קטנה מן agarose.במהלך הדגירה, מוסיפים שש טיפות מיקרוליטר של ההשעיה החיידקית המוכנה לצלחת של 35 מילימטר ומאפשרים לטיפות להתייבש לפחות 15 עד 30 דקות. לאחר מכן בזהירות למקם את כרית בכל פעם על טיפה אחת של חיידקים ולאפשר את הדגימות להגדיר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למקם את מיטת אגר מבלי למרוח את המדגם, למקם בזהירות את כרית מגניב על הטרופה עם הקשה עדינה.כדי לדמיין את הדגימות, להסיר את הבקבוק מהמים ולאפשר את פתרון הג'ל להתקרר לטמפרטורת הגוף. יוצקים שלושה מילימטרים של הג'ל על ההיקף של צלחת המדגם. כאשר agarose יש התגבש, לאטום את הצלחת עם קלטת ולהשתמש מחט 25 מד לחתוך כמה חורים לתוך הקלטת.לאחר מכן מניחים את הצלחת במהופך ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות כדי לאפשר את agarose להתמצק באופן מלא, תוך מניעת מיטוזה התא. בתוך 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי כדי לאתר את הדגימה בהגדלה הנמוכה ביותר ולעסוק במערכת המיקוד האוטומטית של המיקרוסקופ. החל שמן על המטרה המתאימה ולהשתמש בקר הפלטפורמה כדי להזיז את הצלחת כדי להפיץ בזהירות את השמן.לאחר מכן הפעל שוב את המוקד האוטומטי ופעל לפי הצעת ברירת המחדל עבור חתכי רוחב של שלב Z כדי לדמות את הדוגמה. ה- E.coli אמור להופיע כצורות מלבניות שחורות על רקע לבן כבוי. והטווח הדינמי של הזוהר אמור להראות עלייה חדה במרכזו.אירועי מיטוזה יכולים להיות מזוהים תחילה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 30 דקות. למרות שתאים בודדים עשויים להיות קשים לזיהוי בהגדלה נמוכה. תרביות תאים חיידקיים שהוכנו ביחס דילול שגוי יכולות להדגים מספרים בלתי משתנים של תאים, ודגימות שהוכנו ללא איטום צלחת יכולות להפגין התכווצות מוגזמת, וכתוצאה מכך אובדן מיקוד.תאים יכולים גם לדחוק פנימה את הג'ל בחיפוש אחר חומרים מזינים, וכתוצאה מכך לערום את תאי החיידקים זה על גבי זה ולהתפשר על המונולאייר של התא, ובכך למנוע ביעילות זיהוי תאים ומדידת אותות פלואורסצנטית אמינה. כפי שהוצע על ידי נתונים אלה, שלב התא במחזור החלוקה אינו משפיע על רמת הרעש, שכן טווחי שטח שונים מדגימים את אותה מגמה. כמו כן, לא נצפה שינוי מהותי ביחס האות לרעש בין GFP לבין GFP סופר-גדול, כפי שמודגם על-ידי נתונים מייצגים אלה.בעת ביצוע הליך זה, יש להקפיד לקבוע את יחס הדילול הנכון עבור זן החיידקים המשמש לניסוי. השוואת יחס האות לרעש של כל מעגל מוסדר לקו בסיס זה מאפשרת בחירה של מעגל הביצועים הטוב ביותר ויכולה לחשוף תופעות מעניינות

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

מקור: Valentine, M. E., et al. יצירת מוטציות של מחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת הנחתת אלימות במודל עכבר פשוט של זיהום. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את השימוש בביולומינסנציה כדי לדמיין ולהשוות את ההתנהגות in vivo של זני חיידקים אלימים ומוחלשים בעכברים. הוא מתאר את הכנת תרחיפי החיידקים הביו-לומינסנטים והזרקתם התוך-צפקית לעכברים. הזן האלים מפגין התפשטות מערכתית, בעוד שהזן המוחלש נשאר מקומי ומתנקה בהדרגה, כפי שמצוין על ידי אות הדעיכה.

מעקב אחר דינמיקת זיהום חיידקי בעכבר באמצעות ביולומינסנציה

מקור: Oms, T., et al. ניתוח אוכלוסייה ותאים בודדים של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מציג פרוטוקול לניטור תאי חיידקים בודדים המבטאים חלבון קושר DNA בעל תווית פלואורסצנטית בתוך מערכת מיקרופלואידית. הוא ממחיש כיצד אנטיביוטיקה מעכבת את רוב התאים, בעוד שתת-אוכלוסייה של תאים מתמידים שורדת את הטיפול וגדלה מחדש לאחר הסרת האנטיביוטיקה.

מיקרוסקופ זמן-lapse מיקרופלואידית לחקר התמדה אנטיביוטית בחיידקים

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

מקור: חיימוביץ', א. א. ואחרים. מדידה רציפה של רעש ביולוגי באשריכיה קולי באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים ויזואליזציה בזמן אמת של רעש ביולוגי באי-קולי על ידי מעקב אחר תנודות בפלואורסצנציה של GFP במהלך גדילה וחלוקה של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס.

ניטור רציף של רעש ביולוגי בחיידקים באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס

מקור: שומאכר, ד., וסוגארד-אנדרסן, ל. הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של מחזור התאים הצמחיים המלא של החיידק החברתי המתפתח באיטיות Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית תאים חיים למעקב אחר מקורות כרומוזומים מסומנים פלואורסצנטית במהלך חלוקת תא חיידקים. הוא לוכד את דינמיקת הפרדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה.

הדמיית טיים-לאפס של הפרדת כרומוזומים בחיידקים מסומנים פלואורסצנטית

מקור: Makowski, Ł., ואחרים. הדמיה של תאים חיים של טורף חיידקי Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בזמן-לפס. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית פלואורסצנציה בזמן אמת של חיידק בדלוביבריו הטורף E. coli מקובע מתחת לכרית אגרוז, ומאפשר הדמיה בזמן אמת של שכפול תוך-תאי ושחרור צאצאים לצורך חקר טורף חיידקים ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

דימות טיימלפס בתאי חיים של טורפות בקטריובורוס של Bdellovibrio על E. coli

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר יישום של פלואורסצנטיות מולקולה אחת בהכלאה situ (smFISH) כדי למדוד את הקינטיות vivo של סינתזה mRNA והשפלה.

חיטוט mRNA קינטיקה בחלל וזמן ב Escherichia קולי באמצעות שני צבעים פלואורסצנטיות מולקולה אחת ב סיטו הכלאה

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

למד מדידה רציפה של מעגלים גנטיים ב-Escherichia coli באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן. שיטה זו מאפשרת חישוב שונות האות ויחס האות לרעש בתאים בודדים להערכת ביצועי המעגל.

מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

גלה סרטונים נוספים