מדידה רציפה של רעש ביולוגי ב Escherichia קולי באמצעות מיקרוסקופיה לשגות זמן

פרוטוקול זה במדידה רציפה של מעגלים גנטיים ב- E.coli וחישוב שונות האות ויחס אות לרעש בתא חיידקי בודד כדי להעריך את ביצועי המעגל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא ניתנת להתאמה בקלות לזנים ומעבדות שונות, דורשת הכשרה מינימלית וללא ציוד מיוחד, והיא זולה יחסית. רעש הוא תפקיד משמעותי בקביעת הפונקציונליות של מערכות ביולוגיות.

נכון לעכשיו, יש עניין בבניית מעגלי גנים בקנה מידה גדול. מערכות אלה יכולות להיות מעוכבות על ידי רעש הקפד לייבש את הדגימות היטב, כדי לשמור על רפידות צמרמורת ב 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל האפשר, לחתוך ולחלק את החלקים בסבלנות ובעדינות. כדי להכין את החיידקים לניתוח לחסן מושבה אחת מתרבות E.coli חוצה.

לדוגמה, מעגל עם כתב GFP. בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB להשלים אותו עם אנטיביוטיקה רלוונטי. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן.

בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול במיני צנטריפוגה מיני מיליליטר שני מיליליטר, ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר. לאחר מכן, דגירה את התרבות במשך שעה אחת עם רועד לפני זריעת 40 עד 60 microliters של השעיה זו על צלחות תרבות M9. כדי להכין את החיידקים לניתוח, לחסן מושבה אחת מתרבות E.Coli חוצה.

לדוגמה, מעגל עם כתב GFP בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מרק LB בתוספת אנטיביוטיקה רלוונטית. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה באינקובטור רועד במשך שעתיים עד המרק מעונן. בסוף הדגירה, לסובב למטה מיליליטר אחד של פתרון דילול בצינור מיני מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר ולהעביר 30 microliters של חיידקים ואת כל נפח פתרון דילול לתוך צינור חדש שני מיליליטר.

ואז להדגיר את התרבות במשך שעה אחת עם רעידות. להכנת לוחות מיקרוסקופ, מערבבים 112.5 מיליגרם של אגר נמס נמוך עם 40 מיליגרם אגר, ומיליליטר אחד של 2% חומצת קאסאמינו בבקבוק ארלנמייר 25 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 8.92 מיליליטר של מדיום מינימלי על השפתיים הפנימיות של בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר ומיקרוגל הפתרון וכתוצאה מכך קצר, שניים עד שלושה התפרצויות שניות.

ואז להגדיר את אמבט המים ל 55 מעלות צלזיוס. כאשר הפתרון ברור, מניחים את בקבוק ארלנמאייר 25 מיליליטר באמבט מים 60 מעלות צלזיוס ולאפשר את הפתרון אגר להתקרר עד הטמפרטורה שלה יורדת על 45 עד 50 מעלות צלזיוס. בזמן שהאגר מתקרר, נקו את ספסל המעבדה עם 70% אתנול והחליקו חתיכת סרט מעבדה על הספסל הנקי.

מניחים כיסוי זכוכית אחד להחליק על הקלטת ומניחים תלוש כיסוי שני בקרבת מקום. הוסיפו תמיסת אגר מקוררת לאנטיביוטיקה ולתמיסה המתאימה. יוצקים 1.5 מיליליטר של פתרון ג'ל טרי מוכן על פתק הכיסוי ממוקם מעל הקלטת ומניחים את החלקת הכיסוי השנייה על הג'ל, מקפידים להימנע בועות.

החזירו את ארלנמייר לאמבט המים החמים וכסו את תלושי הכיסוי במשך 20 דקות. הופכים את פתקי הכיסוי במשך שעה דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להסיר את הכיסוי מחליק מן הג'ל היבש לחתוך כרית קטנה מן agarose.

במהלך הדגירה, מוסיפים שש טיפות מיקרוליטר של ההשעיה החיידקית המוכנה לצלחת של 35 מילימטר ומאפשרים לטיפות להתייבש לפחות 15 עד 30 דקות. לאחר מכן בזהירות למקם את כרית בכל פעם על טיפה אחת של חיידקים ולאפשר את הדגימות להגדיר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למקם את מיטת אגר מבלי למרוח את המדגם, למקם בזהירות את כרית מגניב על הטרופה עם הקשה עדינה.

כדי לדמיין את הדגימות, להסיר את הבקבוק מהמים ולאפשר את פתרון הג'ל להתקרר לטמפרטורת הגוף. יוצקים שלושה מילימטרים של הג'ל על ההיקף של צלחת המדגם. כאשר agarose יש התגבש, לאטום את הצלחת עם קלטת ולהשתמש מחט 25 מד לחתוך כמה חורים לתוך הקלטת.

לאחר מכן מניחים את הצלחת במהופך ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות כדי לאפשר את agarose להתמצק באופן מלא, תוך מניעת מיטוזה התא. בתוך 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי כדי לאתר את הדגימה בהגדלה הנמוכה ביותר ולעסוק במערכת המיקוד האוטומטית של המיקרוסקופ. החל שמן על המטרה המתאימה ולהשתמש בקר הפלטפורמה כדי להזיז את הצלחת כדי להפיץ בזהירות את השמן.

לאחר מכן הפעל שוב את המוקד האוטומטי ופעל לפי הצעת ברירת המחדל עבור חתכי רוחב של שלב Z כדי לדמות את הדוגמה. ה- E.coli אמור להופיע כצורות מלבניות שחורות על רקע לבן כבוי. והטווח הדינמי של הזוהר אמור להראות עלייה חדה במרכזו.

אירועי מיטוזה יכולים להיות מזוהים תחילה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר 30 דקות. למרות שתאים בודדים עשויים להיות קשים לזיהוי בהגדלה נמוכה. תרביות תאים חיידקיים שהוכנו ביחס דילול שגוי יכולות להדגים מספרים בלתי משתנים של תאים, ודגימות שהוכנו ללא איטום צלחת יכולות להפגין התכווצות מוגזמת, וכתוצאה מכך אובדן מיקוד.

תאים יכולים גם לדחוק פנימה את הג'ל בחיפוש אחר חומרים מזינים, וכתוצאה מכך לערום את תאי החיידקים זה על גבי זה ולהתפשר על המונולאייר של התא, ובכך למנוע ביעילות זיהוי תאים ומדידת אותות פלואורסצנטית אמינה. כפי שהוצע על ידי נתונים אלה, שלב התא במחזור החלוקה אינו משפיע על רמת הרעש, שכן טווחי שטח שונים מדגימים את אותה מגמה. כמו כן, לא נצפה שינוי מהותי ביחס האות לרעש בין GFP לבין GFP סופר-גדול, כפי שמודגם על-ידי נתונים מייצגים אלה.

בעת ביצוע הליך זה, יש להקפיד לקבוע את יחס הדילול הנכון עבור זן החיידקים המשמש לניסוי. השוואת יחס האות לרעש של כל מעגל מוסדר לקו בסיס זה מאפשרת בחירה של מעגל הביצועים הטוב ביותר ויכולה לחשוף תופעות מעניינות