Name: ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: למדו לייצר את מכשיר ה-XO Pad מנייר לריכוז והפרדה של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים ללא כימיקלים. שיטה זו מציעה שיעורי שחזור גבוהים יותר משיטות מסורתיות למחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה, גרנט NRF-2018R1D1A09084044. י. ה. לי היה נתמך על ידי מלגת מחקר מאוניברסיטת Kwangwoon בשנת 2019. הייארין קים נתמכת על-ידי תוכנית הפיתוח של מומחי התעשייה של המשרד הקוריאני למסחר, תעשייה ואנרגיה (MOTIE), מופעל על ידי מכון קוריאה לקידום טכנולוגיה (KIAT) (לא. P0002397, תוכנית HRD להתכנסות תעשייתית של התקנים חכמים לבישים).

1. ייצור התקנים
<ol><li>הגדר את האזור שיודפס על נייר באמצעות תוכנת מדפסת (טבלת חומרים). הערה: העיצוב כולל 12 שכבות בדוגמת שעווה שבהן הקטרים של האזורים העגולים מעוגלים בהדרגה ממרחק של 5 מ"מ עד 2 מ"מ (איור 1A).</li>
	<li>הדפס שעווה הידרופובי על האזורים המיועדים משני צידי הנייר הצלולוזה (טבלת חומרים) באמצעות מדפסת שעווה מסחרית (לוח חומרים) (איור 1b).</li>
	<li>מניחים את נייר השעווה מודפס בתנור מעבדה עבור 80 s ב 120 ° c. הערה: שלב זה מאפשר לשעווה להגיע לתוך הנייר באמצעות הזרמה תרמית של השעווה המודפסת. בעזרת פרוטוקול דגירה זה, הרזולוציה של התבנית היא ~ 2 מ"מ. לפיכך, להיזהר לא להדפיס דפוסים של פחות מ 2 מ"מ. אחרת הדפוסים ייחסמו על ידי השעווה.</li>
	<li>חותכים את נייר שעווה מודפס עם חותך כדי ליצור התקנים בודדים (איור 1C).</li>
	<li>טיפה 5 μL ו-2 μL של ממברנה בררנית (g., Nafion; רשימת חומרים) על האזורים לדוגמה בשכבות הימניות והימניות ביותר, בהתאמה (איור 1D).</li>
	<li>מניחים את השכבות מצופות עם קרום permselective על צלחת חם ב 70 ° c עבור 30 דקות כדי להתאדות את המסת קרום permselective.</li>
	<li>אטום את המשטח החיצוני ביותר של השכבה מצופה מול פתרון מאגר עם נייר רגיש ללחץ, משאיר חור קטן.</li>
	<li>מקפלים את המכשיר בודד מודפס (כלומר, Exo-PAD) הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים. הערה: על-ידי קיפול ההתקן, כל האזורים לדוגמה הופכים למחוברים בעדינות (איור 1E). עיצוב ממיר זה מתמקד בקווי השדה החשמליים כאשר המתח מוחל על הזרם הקאמרי, ומקבל ריכוז אינטנסיבי יותר של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.</li>
</ol>2. העשרה והתמקדות מרחבית של שלפוחיות ואקזומים באמצעות ריכוז הקיטוב
<ol><li>טעינת 15 μL של המיקרו-שלפוחית ומדגם אקסוזום (~ 3 x 10/11 חלקיקים/mL ב-0.1 x פוספט באגירה מלוחים [PBS] עם 0.05% רצף 20) באזורים לדוגמה המתכנסת על ידי ליטוף והמתן כמה שניות כדי להבטיח הרטבה מלאה של כל האזורים לדוגמה (איור 1f).</li>
	<li>מניחים שני חדרי אקריליק בשני הקצוות של Exo-PAD ולהדק את Exo-PAD באופן מאובטח עם קטעי אוגדן קטנים כדי למנוע התפתחות (איור 1G).</li>
	<li>ממלאים את התאים עם 110 μL של 0.1 x PBS ולהוסיף שני אלקטרודות Ag/AgCl (איור 1H).</li>
	<li>החלת 30 וולט על אלקטרודות עבור 20 דקות באמצעות מערכת מדידה מקור מתח נוכחי (טבלת חומרים). הערה: המתח המוחל יוצר את תופעת הקאמרי ולכן מקדם את המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים בשכבות 8 ו -9 של ה-Exo-PAD.</li>
</ol>3. בידוד מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשרים
<ol><li>הפרד את Exo-PAD מקופל מתאי אקריליק ולגלות את המכשיר כדי לבודד את המיקרושלפוחיות מועשר ואקסוזומים מן השכבות האחרות (איור 1I).</li>
	<li>החוצה את האזורים לדוגמה בשכבות 8 ו -9, כאשר המיקרושלפוחיות והאקסוזומים מועשרים, לניתוח במורד הזרם (איור 1J).</li>
</ol>4. סריקת אנליזה של מיקרוסקופ אלקטרוני
<ol><li>תקן את המיקרושלפוחיות המועשרת והאקסוזומים על-ידי התעשרת את האזורים הנוקבים ב-2.5% גלוטאלדהיד בשנת 0.1 m נתרן קא, מאגר של 1 h ו-1% אוסמיום tetroxide בשנת 0.1 M נתרן קאבאיחור 1 h. התראה: אוסממיום tetroxide הוא כימיקל רעיל ומסוכן מאוד. בגלל אוסמיום tetroxide יכול לחדור לפלסטיק, זה חייב להיות מאוחסן בזכוכית. כל טיפול של אוסממיום tetroxide חייב להתבצע בתוך מכסה כימי עם כפפות ניטריל.</li>
	<li>ביטול המיקרושלפוחיות ואקסוזומים קבועים עם ציונים עולים של 200 הוכחה אתנול (כלומר, 50%, 70%, 90%, ו-100%) עבור 30 דקות כל אחד.</li>
	<li>יבש כימי את המדגם על ידי הכשרת הבית בתוך הdesiccator למשך 30 דקות. התראה: הג הוא כימיקל דליק ורגיש לחות. זה חייב להיות מאוחסן באזור יבש ומאוורר הרחק ממקורות ההצתה.</li>
	<li>מעיל את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מיובשים לחלוטין עם זהב/פלדיום (~ 20 ננומטר) באמצעות התזה ולכידת סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תמונות.</li>
</ol>5. ניתוח מעקב ננו-חלקיק
<ol><li>להכניס את האזורים לדוגמה בשכבות 6, 8, ו 10 באמצעות אגרוף ביופסיה לאחר 20 דקות של פעולת התקן.</li>
	<li>הישאב כל אזור מנוקב בתמיסה מאגר (0.1 x PBS עם 0.01% רצף 20).</li>
	<li>מערבולת עבור 10 דקות ו צנטריפוגה עבור 30 s ב 6,000 סל ד כדי להשעות מחדש את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשר.</li>
	<li>הסירו את האזורים הנוקבים מהפתרון ומדדו את ריכוז המיקרושלפוחית והאקסוזומים באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (שולחן החומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Edgar, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+%26+A%3A+What+are+exosomes%2C+exactly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Q & A: What are exosomes, exactly.</a> BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+exosome+isolation+and+analysis%3A+Enabling+liquid+biopsy+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).</li>
<li>Simons, M., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+-+vesicular+carriers+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).</li>
<li>Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles+in+normal+physiology%2C+pathophysiology%2C+and+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases.</a> Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).</li>
<li>Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+devices+for+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52722(2015).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origami-paper-based+device+for+microvesicle%2Fexosome+preconcentration+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+Extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Free+Isolation+of+Exosomes+from+Extracellular+Vesicles+by+Microfluidic+Viscoelastic+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows.</a> ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).</li>
<li>Marczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+and+preconcentration+of+exosomes+by+ion+concentration+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization.</a> Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).</li>
<li>Livshts, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation%3A+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Chiriacò, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+for+exosomes+and+microvesicles+detection+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization.</a> Sensors. 18 (10), 3175(2018).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetic+size-based+spatial+separation+of+micro%2Fnanospheres+using+paper-based+3d+origami+preconcentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator.</a> Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).</li>
<li>Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+pre-concentration+with+high+enrichment+factors+at+a+fixed+location+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

למרות Exo-PAD שימש בהצלחה עבור העשרה ובידוד של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מספר נקודות קריטיות צריך להיחשב בזהירות: 1) הדגירה של התנור זמן וטמפרטורה במהלך הכנת המכשיר, 2) זמן עיבוד, 3) יישום של מתח עם מספרי שכבות משתנות, שטח לדוגמה קטרים, ו 4) הישימות
זמן הדגירה והטמפרטורה הניתנים בפרוטוקול הם תנאים ממוטבים כדי להמציא מכשיר אמין. זמני דגירה ארוכים יותר או טמפרטורה גבוהה יותר עלול לגרום עיוות של העיצוב מתכנסת עקב הזרמה מוגזמת של שעווה מודפסת. הדבר ימנע את היווצרות קווי השדה החשמליים המתמקדים ובכ...

שלפוחיות ואקסוזומים הן ממברנות קטנים מדידת מדידה 0.2-1 מיקרומטר ו 30-200 ננומטר, בהתאמה. הם מופרשים לתוך סביבת החילוץ על ידי כמה סוגי תאים שונים1,2,3,4,5. הם מכילים מידע תא הורים בצורה של תת קבוצות של DNA, mrna, mirna, חלבונים, ושומנים, ולזרום ברחבי הגוף באמצעות נוזלי גוף שונים כגון סרום, פלזמה, שתן, נוזל שדרתי, נוזל שפיר, ורוק6,7,8,9. לכן, טכניקות לבידוד יעיל של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מנוזלים ביולוגיים יכולים לספק הזדמנויות נרחבות בתחומים של אבחון, פרוגנוזה, ניטור בזמן אמת של מחלות, כמו גם בפיתוח של therapeutics חדש.
עם זאת, שיטת הבידוד המקובלת למיקרו-שלפוחית ואקסוזומים המבוססת על הארכה היא זמן רב וגורמת לאובדן וזיהום משמעותיים של המדגם. זה בגלל שהוא כרוך מספר pipetting מסורבלת וטעינה שלבים ומהשליך של ריאגנטים שונים עם חוזר ונשנה5,6,10,11,12. יתר על כן, את המתח להטות גבוה הנגרמת על ידי מעקב (~ 100,000 x g) יכול לגרום לפירוק הפיזי של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מניב שיעורי התאוששות גרועה (5-כ 23%)6,13,14. לכן, יש לפתח טכניקת בידוד יעילה ובעלת משקל למיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים כדי להפחית את הנזק וההפסד, ובכך להשיג שיעורי התאוששות גבוהים יותר.
התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) פותח לבידוד פשוט, עדין ויעיל מאוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים6. העיצוב של ה-Exo-PAD הוא נייר רב-מקופל, עם שטחים לדוגמה המחוברים באופן סדרתי היורדים בהדרגה בקוטר. טכניקת ההפולריזציה (הקאמרי), שהיא תופעה ננו-אלקטרוקינטית הטעונה בbiomolecules, משולבת בעיצוב ייחודי זה. השימוש ב-Exo-PAD הביא להעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים בשכבות מסוימות ובבידוד שלהם על ידי התפתחות המכשיר. מאמר זה מתאר את ה-Exo-PAD בפירוט, החל מייצור ההתקן ומהפעולה הכוללת לניתוח השימוש בו, כדי להמחיש את השיטה ולהציג את תוצאות הנציגים6.

<table><tbody><tr><td>אלקטרודות Ag/AgCl</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td>531500</td><td>אלבומין בקוטר 0.15 אינץ'</td></tr><tr><td>מסרום בקר (BSA), Alexa Fluor 594 מצומד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A13101</td><td>BSA מצומד עם Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 ננומטר)</td></tr><tr><td>מאגר קרבונט-ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041-50CAP</td><td>מאגר קרבונט</td></tr><tr><td>תוכנת CorelDraw (Coral Co., קנדה)</td>תוכנת <td>מדפסת Corel Corporation</td><td></td><td>להגדרת הדפסת שעווה אזור</td></tr><tr><td>ColorQube 8870</td> מדפסת <td>שעווה</td><td>של Xerox Corporation</td><td></td></tr><tr><td>נייר כרומטוגרפיה דרגה 1</td><td>Whatman</td><td>3001-861</td><td>נייר תאית, מידות: 20 * 20 ס"מ</td></tr><tr><td>תקני אקסוזום עם תווית פלואורסצנטית</td><td>HansaBioMed Life Sciences, Ltd.</td><td>HBM-F-PEP-100</td><td>אקסוזום עם תווית FITC (Ex/Em: 490/520 ננומטר)</td></tr><tr><td>Keithley 2410 מד מקור זרם/מתח</td><td>Keithley Instruments, Inc.</td><td></td><td>זרם&ndash; מערכת מדידת מקור מתח</td></tr><tr><td>Nafion תמיסת שרף פרפלואורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31175-20-9</td><td>ממברנה סלקטיבית, 20 wt.% בתערובת של אלכוהולים אליפטיים נמוכים יותר ומים; מכיל 34% מים</td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Technology</td><td></td><td>מכונת ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA)</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS, pH7.4)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010001</td><td></td></tr></tbody></table>

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes

שלפוחיות ואקסוזומים הן קרומי שלפוחיות קטנות שפורסמו לסביבת החילוץ והופץ ברחבי הגוף. מכיוון שהם מכילים שונים תא הורים biomolecules כגון DNA, mRNA, miRNA, חלבונים, ושומנים, שלהם העשרה ובידוד הם צעדים קריטיים לניצול שלהם כמו סמנים פוטנציאליים יישומים קליניים. עם זאת, שיטות בידוד קונבנציונאלי (למשל, הטיות) גורמות לאובדן משמעותי ונזק למיקרושלפוחיות ואקסוזומים. שיטות אלה דורשות גם שלבים חוזרים ונשנים מרובים של העברת החומרים, טעינה, ובזבוז של ריאגנטים. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לעיצוב התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) המיועדת להעשרה ולבידוד יעילים של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים באופן פשוט. העיצוב הייחודי של ה-Exo-PAD, המורכב משכבות רב-אקורדיון הכוללות שכבות משולבות משולבות עם שטחים לדוגמה מתכנסת, משולבים עם טכניקת הקיטוב של ריכוז היונים, ובכך מאפשרת לעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים על שכבות ספציפיות. כמו-כן, המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת מבודדים על-ידי התגלגלות בפשטות של ה-Exo-PAD.

זמן הפעולה חייב להיות מיטבי כדי להשיג את התשואה המקסימלית של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת. לא מספיק זמן אינו מאפשר העברה מספקת של המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים, אשר מפחית את ההעשרה, בעוד זמן מופרז מתדרדר המיקוד המרחבי ולכן מפזר את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. לפיכך, באמצעות שלב האופטימיזציה הזמן, הגורם המקסימלי הריכוז המרבי של מיקרולושלפוחית ואקסוזומים והמיקום הסופי בו ניתן לזהות את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. כדי למצוא את המיקום הסופי של המיקרוסקופים והאקסוזומים, הגירה בזמן של שימוש בשיטת המיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים המסו...

מוצג פרוטוקול להמציא מכשיר מבוסס נייר להעשרת האפקטיבית והבידוד של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

Microvesicles and exosomes are small membranous vesicles released to the extracellular environment and circulated throughout the body. Because they ...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לייצור מכשיר מבוסס נייר בשם XO Pad, המיועד להעשרה יעילה בבידוד של וריקולים חוץ-תאיים. ה- XO Pad הוא מכשיר פשוט שיכול לרכז ולבודד קדם-תאיים ללא שימוש בכימיקלים או במכונות עבודה, תוך הצגת שיעורי התאוששות גבוהים יותר מאשר שיטות קונבנציונליות. התחל בהגדרת האזור להדפסה באמצעות תוכנת מדפסת.העיצוב צריך להיות 12 שכבות בדוגמת שעווה שבו קטרים של אזורי מדגם עגולים בהדרגה צר מחמישה עד שני מילימטרים. לאחר מכן, להדפיס שעווה הידרופובית על האזורים המיועדים משני צידי נייר תאית. מניחים את הנייר המודפס שעווה בתנור מעבדה במשך 80 שניות ב 120 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחתוך את הנייר המודפס שעווה עם חותך כדי להפוך התקנים בודדים XO Pad.זרוק חמישה ושני microliters של קרום סלקטיבי פרם על אזורי המדגם ברוב השכבות השמאלית וי הימנית ביותר, בהתאמה. מניחים את השכבות מקודדות עם קרום סלקטיבי סלם על צלחת חמה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להתאדות את הממס. לאחר מכן לאטום את המשטח החיצוני ביותר של השכבה מצופה מול פתרון החיץ עם סרט רגיש ללחץ, עוזב חור קטן.מקפלים את התקן XO Pad הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים כדי לחבר את כל אזורי המדגם. פיפטה 15 מיקרוליטרים של מיקרובסיקל מדגם exosome באזורים מדגם מתכנס לחכות כמה שניות כדי להבטיח הרטבה מלאה. מניחים שני תאים אקריליים בשני הקצוות של כרית ה- XO ומהדקים אותו בצורה מאובטחת עם קליפי קלסר קטנים כדי למנוע את ההתגלות.מלאו את התאים ב-110 מיקרוליטרים של 0.1X PBS והכניסו שתי אלקטרודות כסף. לאחר מכן השתמש במערכת מדידת מקור מתח זרם כדי להחיל 30 וולט על האלקטרודות במשך 20 דקות. כדי לבודד את המיקרוווסיקים והאקסוזומים המועשרים, הפרד את כרית ה- XO המקופלת מהתאיים האקריליים ופרש את המכשיר כדי לבודד את החלקיקים המועשרים מהשכבות האחרות.אגרוף את אזורי המדגם בשכבות שמונה ותשע שבו microvesicles ו exosomes מועשרים לניתוח במורד הזרם. בדיקה של נדידת זמן-לשגות של מיקרואורגניזמים ואקסוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בוצעה על מנת לייעל את זמן הפעולה להתאוששות מרבית של החלקיקים המועשרים. התעצמויות הפלואורסצנטיות בכל אזורי המדגם כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.לפני תהליך ההעשרה, מיקרואורגניזמים ואקסוזומים פוזרו בכל אזורי המדגם עם ירידה הדרגתית בעוצמה. לאחר 10 דקות של עיבוד, החלקיקים היגרו אלקטרו-קינטית ותקע טרום ריכוז מיידי הופיע בשכבה שבע. כשהגיע הזמן ל-20 דקות, מיקרואורגניזמים ואקסוזומים התמקדו מאוד בשכבות 8 ו-9 והועשרו פי חמישה על סמך התעצמות הפלואורסצנטיות.שלמות המיקרואורגניזמים והאקסוזומים המועשרים בשכבה 8 נחקרה עם SEM. באופן משמעותי יותר חלקיקים שאינם פגומים נצפו לאחר תהליך ההעשרה. כמו כן נותחה התפלגות הגודל של המיקרואורגניזמים והאקסוזומים המועשרים.לאחר מכן, הריכוז בפועל של המיקרואורגניזמים המועשרים והאקסוזומים באזורי המדגם בשכבות 6, 8 ו-10 נותח. בשכבה 8, המיקרואורגניזמים והאקסוזומים התרכזו מראש בגורם של 5.58, אך בשכבות האחרות לא נצפה ריכוז מקדים מורגש. כדי להבטיח את יכולת ההתרבות של הליך זה, פעל במדויק את הפרוטוקול עבור זמן הדגירה בתנור וטמפרטורה במהלך אימות המכשיר וזמן הפעולה של המכשיר מכיוון ואלהים הם התנאים הממוטבים.ניתן להשתמש ב- XO Pad גם כדי להפריד ולבודד קבוצה חוץ-תאית מדגימות עשירות בחלבון, כגון סרום או פלזמה, באמצעות מאגר פחמתי. פרוטוקול זה יכול לספק כלי הכנה יעיל ופשוט, עם יכולות טרום ריכוז ובודד הנדרשות למחקר קליני, כגון אבחון, אספקת תרופות, אימונותרפיה וטיפולים אחרים.

paper-based-preconcentration-isolation-microvesicles

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים קטנים שוחררו מהתאים, מ קטן כמו 10 דגימות סרום μl. גישה זו עוקפת את הצורך בultracentrifugation, דורשת רק כמה דקות של זמן assay, ומאפשרת בידוד של כלי רכב חשמלי מדגימות של כרכים מוגבלים.

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

נוזל המרה הוא מקור יקר לשלפוחיות חוץ-תאיות/אקסוזומים המכילים סמנים ביולוגיים בעלי פוטנציאל חשוב. פרוטוקול זה מייצג שיטה חזקה לבידוד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל miRNA.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

שלפוחיות חוץ-תאיות הקיימות בדם הוצעו כסמנים ביולוגיים חדשים למחלות שונות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של מיקרו-שלפוחיות גדולות שמקורן בקרום פלזמה מדגימות דם היקפיות וניתוחם לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה קונבנציונלית ו-Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

זהו פרוטוקול לבידוד ושלפוחיות רקמות (EVs) מהכבד. הפרוטוקול מתאר תהליך דו-שלבים המעורב בקולגן ומלווה באמצעות מעקב דיפרנציאלי לבידוד רקמת הכבד EVs.

בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

פרוטוקול זה מבודד ושלפוחיות שלפוחית (EVs) הרחק מריטונים עם יעילות גבוהה ותשואה על ידי שילוב משקעים EV, צפיפות הדרגתי מעבר הצבע, ולכידת חלקיקים כדי לאפשר זרימת עבודה יעילה והפחתה של התחלת דרישות נפח, וכתוצאה מכך ההכנות לשימוש בכל מחקר EV.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

שלפוחיות חוץ-תאיות טומנות בחובן הבטחה עצומה ליישומים ביו-רפואיים, אך שיטות הבידוד הנוכחיות גוזלות זמן רב ואינן מעשיות לשימוש קליני. במחקר זה אנו מציגים מכשיר מיקרופלואידי המאפשר בידוד ישיר של בועיות חוץ-תאיות מכמויות גדולות של נוזלים ביולוגיים באופן רציף ובמינימום צעדים.

בידוד חד-שלבי של בועיות חוץ-תאיות מדגימות בנפח גדול באמצעות התקן מיקרופלואידי A4F מפוצל

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למדו לייצר את מכשיר ה-XO Pad מנייר לריכוז והפרדה של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים ללא כימיקלים. שיטה זו מציעה שיעורי שחזור גבוהים יותר משיטות מסורתיות למחקר ביולוגי.

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

גלה סרטונים נוספים