ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NVK, חוקר CPRIT בחקר הסרטן, מודה המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) על תמיכתם הנדיבה, CPRIT גרנט RR150044. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק המחקר של קרן וולש C-1930, ועל ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35 GM129294 שהוענק ל-NVK. למימון לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. סיסאי ציטוטוקסיסיטי: התקנה
<ol><li>הכן פתרונות של תרכובות עניין בריכוזים הרצויים במדיה המתאימה (ללא סרום או 1, 2.5, או 5% FBS RPMI-1640).<ol>
<li>כדי למדוד cytotoxicity של תרכובת אחת (למשל, כדי לקבוע מינונים יעילים), להכין תרכובות בריכוז הסופי 2x.</li>
		<li>כדי למדוד את רעילות ציטוקסיסיטי של שילובים מורכבים, להכין תרכובות בריכוז הסופי 4x.</li>
		<li>הכן פקדים ממס בלבד על-ידי ערבוב אותה כמות של ממס עם המדיום המתאים. לדוגמה, אם תרכובות בדיקה מומסות DMSO ומתנול, להפוך את בקרת ממס בלבד עבור כל ממס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף תאים מצלחת תרבות או בקבוקון לתוך צינור חסונים 15 מ"ל.</li>
	<li>להעביר 10 μL של מתלה תא לתוך צינור microcentrifuge וכתם עם 10 μL 0.4% טריפאן כחול. השתמש במוציתומטר כדי לספור תאים קיימא ולא מעשיים עבור כל מקור תא.</li>
	<li>כדורי ב 200 גרם במשך 5 דקות. לשאוף או לשתות סופרנטנט.</li>
	<li>גלולת תא תולה מחדש במדיה המתאימה לאסא (ללא סרום או 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640) בצפיפות תא של 3*105 תאים/מ"ל. הערה 1: צפיפות תאים של 3*105 תאים/מ"ל מספקת צפיפות זריעה של 15,000 תאים/באר. צפיפות זריעה היא פרמטר חשוב ובאופן אידיאלי יש להגדיר מראש לפני הניסוי. צפיפות זריעה צריכה לקחת בחשבון 1) גודל התא – בדרך כלל תאים גדולים יותר נזרעים בצפיפות נמוכה יותר; 2) משך הטיפול – תאים הם בדרך כלל זרעים בצפיפות נמוכה יותר לניסויים שימשך זמן רב יותר; ו 3) שיעור חלוקת תאים – תאים עם שיעור גבוה יותר של חלוקה נזרעים בצפיפות נמוכה יותר. דוגמאות ספציפיות של צפיפויות זריעה ממוטבות: תאי K562, גדול יותר, 24 שעות משך – 10,000 תאים / גם; MOLM-13 תאים, גודל בינוני, 24 שעות טיפול – 15,000 / גם; MOLM-13 תאים, 48 שעות טיפול – 8,000 / גם; תאים חד-תאיים חד-תאיים קטנים ובריאים בדם היקפי (PBMCs), טיפול של 24 שעות – 50,000/גם; תאי AML ראשוניים, 24 שעות טיפול – 15,000-20,000 / גם. הערה 2: הנוכחות של FBS במדיה עשויה להשפיע על הפעילות של התרכובות. הפחתת הריכוז של FBS עשויה להפוך את תוצאות ההסתה לפשוטות יותר לפענוח, אך היא גם מפחיתה את הדיוק הפיזיולוגי.</li>
	<li>זרע 50 μL של מתלה תא מ שלב 1.5 לתוך כל באר של צלחת 96-גם באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
	<li>הוסף תרכובות באופן הבא:<ol>
<li>עבור תרכובת אחת אומר, להוסיף 50 μL של 2x פתרון מורכב לתוך כל באר. עבור בארות בקרת ממס, להוסיף 50 μL של מדיית בדיקה המכילה את הממס בריכוז 2x.</li>
		<li>לשילוב, הוסף 25 μL של כל אחד מהמתחם (4x פתרונות) לתוך כל באר. עבור בארות יחיד תרכובת שליטה, להוסיף 25 μL של פתרון מורכב 4x ו 25 μL של בינוני מבחן. עבור בארות בקרת ממס, להוסיף 50 μL של בינוני בדיקה או בינוני בדיקה המכילה את הממס. הערה 1: הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 0.5%. הערה 2: מומלץ להוסיף את המדיה המכילה את התרכובות עם פיפטה נוגע בקיר של כל באר בשל נפח נמוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקש בעדינות על הצלחת כדי להבטיח ערבוב של תכולת הבארות.</li>
	<li>דגירה צלחות ב 37 ° C באווירה לחה 5% CO2 לזמן מתאים, למשל, 24 שעות.</li>
</ol>2. סיסאי Cytotoxicity: כתמים עם Hoechst 33342 ו פרופידיום לודיד
<ol><li>הכן תמיסת כתמים 10x. פתרון זה צריך להיות מוכן טרי לפני כל ניסוי, זה לא יכול להיות מאוחסן. ריכוזי צבע סופיים צריכים להיקבע לפני הניסוי.<ol>
<li>עבור קווי תאים לוקמיה ותאי לוקמיה ראשיים, 1 מ"ל של 10x כתמים מאגר מכיל 10 μL של 20 mM Hoechst 33342 ו 50 μL של 1 מ"ג/ מ"ל פרופידיום iodide ב PBS סטרילי (ריכוזים סופיים: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).</li>
		<li>עבור PBMCs בריא, 1 מ"ל של 10x כתמים מאגר מכיל 10 μL של 20 m Hoechst 33342 ו 10 μL של 1 מ"ג / מ"ל פרופידיום iodide ב PBS סטרילי (ריכוזים סופיים: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL). הערה: הריכוז הסופי של פרודיד פרופידיום צריך להיקבע לפני הניסויים. יש לבדוק תאים באמצעות טווח של ריכוזי PI (1, 2.5, 5 μg/mL), ולאחר מכן יש להשוות את הכדאיות המחושבת Hoechst/PI לכדאיות הנמדדת באמצעות טריפאן בלו. ריכוזי PI המפורטים לעיל נבחרו בהתבסס על יכולת הכדאיות של תא היעד בארות בקרת מדיה (מעל ~ 90% עבור קווי תאים לוקמיה, מעל ~ 70% עבור מחשבים אישיים בריאים). התראה: Hoechst 33342 ו- propidium iodide הם מסרטנים פוטנציאליים. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול בהם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר הדגירה, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 10 μL של 10x כתמים מאגר לכל באר. הערה: כדי למנוע זיהום צולב, ודא כי עצות פיפטה אינן נוגעות במדיה.</li>
	<li>הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב ולנקה בועות. מכתים ב-37°C למשך 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה הצלחת ב 200 גרם במשך 4 דקות כדי להביא את כל התאים לתחתית הצלחת. נגב בזהירות את תחתית הצלחת עם קימוויפ לח כדי להסיר סיבים ו/או פסולת שתפריע להדמיה. הערה 1: צנטריפוגציה של הצלחת מבטיחה את הסיכויים הגבוהים ביותר עבור כל התאים להיתפס בתמונה. לעתים קרובות תאים מתים יתנתקו ויציפו, ויספקו ערכים מטעים של ציטוקוקסיות. צנטריפוגציה מפחיתה את האפקט הזה. הערה 2: יש למצוא את הלוח במהירות האפשרית לאחר צנטריפוגציה, באופן אידיאלי, בתוך 15 דקות. צנטריפוגציה יכולה להפחית את הבחירה של כתמי PI, עשויה לאפשר לתאים לצבור לאט את האדיד פרופידיום. השיפור ברמת הדיוק שנצבר על ידי הדמיית התאים המתים עולה על העלייה הקלה בכתמים PI. מומלץ לסיים את ההדמיה בתוך שעה אחת של צנטריפוגה.</li>
</ol>3. סיסאי ציטוטוקסיסיטי: רכישת נתונים
<ol><li>הגדר את התוכנה עבור מיקרוסקופ אוטומטי / צלחת imager כדי לזהות פלואורסצסצנת עבור שני Hoechst 33342 (פליטה מקסימלית 350 צפון ל', פליטה מקסימלית 461 nm) ו PI (פליטה מקסימלית 493 צפון השנייה, פליטה מקסימלית 636 צפון ל"ר). לרכוש תמונות עבור כל באר בשני הערוצים.</li>
	<li>באמצעות התוכנה (כגון CellProfiler, סטודיו לניתוח תמונות חינם המבוסס על MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ או תוכנה קניינית כגון Gen5) לספור את התאים בכל באר בכל ערוץ. הערה: מאז כל תא צריך להיות מוכתם עם Hoechst 33342, תאים מתים צריך להיות מוכתם עם PI, היחס של מת לכל מייצג את השבר של תאים מתים. לדוגמה, אם הספירה האוטומטית בדגימה לא מטופלת מציגה 467 תאים מוכתמים ב- PI (תאים מתים) ו- 2335 תאים מוכתמים ב- Hoechst 33342 (סה"כ תאים), השבר המת הוא 0.2 או 20%. ערך זה מושווה לאחר מכן לדוגמה שטופלה באופן זהה שבה נעשה שימוש בטיפול.</li>
	<li>תיאור מפורט של רכישת נתונים Hoechst/PI באמצעות Cytation5 תא הדמיה קורא מרובה מצבים ותוכנות Gen5 v. 3.00:<ol>
<li>הגדר את קורא לוחות Multimode Cytation5 / imager לתאי תמונה בתחתית שטוחה, 96-גם, צלחות פלסטיק שחור גנרי.</li>
		<li>הגדר פרוטוקול הדמיה כדי לנצל את ערכות המסנן הסטנדרטיות DAPI ו- Texas Red. לצלם תמונות במרכז הבאר באמצעות מטרת הגדלה של פי 4. אין להשתמש בהיסט (X/Y או Z). השתמש בהגדרות ההדמיה הבאות: DAPI – LED - 10, זמן שילוב - 99, רווח - 0; טקסס אדום - LED - 8, זמן אינטגרציה - 950, רווח - 18. בצע מיקוד אוטומטי באמצעות אות DAPI; לא צריך להיות היסט בהתמקדות בין ערוצים.</li>
		<li>בצע ניתוח תמונה באמצעות תוכנת Gen5 v 3.00. בהגדרות התוכנה, הגדר תאים כצורות בין 5 ל- 25 μm בגודלם. אל תכלול אובייקטי קצה ראשי וצלל אובייקטים נוגעים על-ידי הפעלת אפשרות מיוחדת "פצל אובייקטים נוגעים".  לאחר מכן, עבד את התמונה כדי להסיר את הרקע (חיסור רקע כהה), החל מסיכה גרעינית (DAPI ערך סף &gt;= 6000 AU) וספור אובייקטים. בצע ניתוח תת-אוכלוסיה המבוסס על כתמי PI (ערך סף טקסס רד &gt;= 5000 AU) וספירת אובייקטים. % קיימות תא מוגדר כ( 1 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61295/61295eq1.jpg"> .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+viability+assessment%3A+toward+content-rich+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell viability assessment: toward content-rich platforms.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Melzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+an+affordable+marker+for+automated+live-dead+cell+analysis+in+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry.</a> Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).</li>
<li>Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Functional+Characteristic+of+Senescent+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells.</a> Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).</li>
<li>Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescence-associated+secretory+phenotype%3A+the+dark+side+of+tumor+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).</li>
<li>Castro-Vega, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+senescent+microenvironment+promotes+the+emergence+of+heterogeneous+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells.</a> Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).</li>
<li>Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid+tumors+by+a+single+multinucleated+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell.</a> Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).</li>
<li>Osisami, M., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Metastatic+Tumor+Dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy.</a> Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cancer+stem-like+cells+through+the+formation+of+polyploid+giant+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells.</a> Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Mittal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinucleated+polyploidy+drives+resistance+to+Docetaxel+chemotherapy+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).</li>
<li>McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine-induced+apoptosis+and+hydrogen+peroxide-induced+necrosis+in+two+human+breast+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines.</a> British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).</li>
<li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+lactate+dehydrogenase+release+assay+for+screening+of+drug+candidates+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).</li>
<li>Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+necrosis+by+release+of+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Counting+and+Viability+Assessment+of+2D+and+3D+Cell+Cultures%3A+Expected+Reliability+of+the+Trypan+Blue+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay.</a> Biological Procedures Online. 19, 8(2017).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+spectral+signatures+of+the+nucleic+acid+dye+acridine+orange+can+distinguish+cell+death+by+apoptosis+and+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis.</a> Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12.18 (2004).</li>
<li>Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+stages+in+single+apoptotic+and+necrotic+cells+monitored+by+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy.</a> Scientific Reports. 4, 4698(2014).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+increased+sensitivity+of+acute+myeloid+leukemia+to+mitotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs.</a> Cell Death & Disease. 10 (8), 617(2019).</li>
<li>Caro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+signatures+uncover+distinct+targets+in+molecular+subsets+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma.</a> Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).</li>
<li>Lagadinou, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+inhibition+targets+oxidative+phosphorylation+and+selectively+eradicates+quiescent+human+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).</li>
<li>Senft, D., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+mitochondrial+dynamics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulators of mitochondrial dynamics in cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).</li>
<li>Vazquez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC1%CE%B1+expression+defines+a+subset+of+human+melanoma+tumors+with+increased+mitochondrial+capacity+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress.</a> Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).</li>
<li>Caino, M. C., Altieri, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+exploit+adaptive+mitochondrial+dynamics+to+increase+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion.</a> Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).</li>
<li>Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+of+cancer+revisited%3A+%22mitochondrial+malignancy%22+and+ROS-induced+oncogenic+transformation+-+why+mitochondria+are+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).</li>
<li>Kreitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Plasticity+of+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Sriskanthadevan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+cells+have+low+spare+reserve+capacity+in+their+respiratory+chain+that+renders+them+susceptible+to+oxidative+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress.</a> Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).</li>
<li>Guerra, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction%3A+A+Novel+Potential+Driver+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer.</a> Frontiers in Oncology. 7, 295(2017).</li>
<li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).</li>
<li>Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mitocans%2C+anti-cancer+drugs+acting+on+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria.</a> Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).</li>
<li>Ubah, O. C., Wallace, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy%3A+Targeting+mitochondria+and+other+sub-cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elimination+of+cancer+cells+by+deoxyglucose-ABT-263%2F737+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy.</a> PLoS One. 6 (9), 24102(2011).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anti-cancer+drugs%2C+mitocans%2C+to+enhance+the+immune+responses+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).</li>
<li>Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Synergistic+Potential+of+Mitochondria-Targeting+Drugs+for+Leukemia+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 435(2020).</li>
<li>Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nuclear+staining+assay+for+high-throughput+screening+to+identify+cytotoxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds.</a> Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).</li>
<li>Döhner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+acute+myeloid+leukemia+in+adults%3A+recommendations+from+an+international+expert+panel%2C+on+behalf+of+the+European+LeukemiaNet%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet.</a> Blood. 115 (3), 453-474 (2010).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7, 45465(2017).</li>
<li>Fan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Energy+Metabolism+and+Potential+of+3-Bromopyruvate+as+an+Inhibitor+of+Aerobic+Glycolysis%3A+Implications+in+Tumor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment.</a> Cancers (Basel). 11 (3), (2019).</li>
<li>Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+effects+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29+on+the+differentiation+potential+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells.</a> Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).</li>
<li>Tunçer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+dimethyl+sulfoxide+driven+gross+molecular+changes+have+the+potential+to+interfere+with+various+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 14828(2018).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

למרות הפרוטוקול עבור Hoechst / PI cytotoxicity assay הוא חזק ודורש זמן מעשי קטן יחסית, ישנם מספר פרטים ניסיוניים חשובים מאוד כדי להבטיח תוצאות מדויקות. ראשית, חשוב לוודא כי הריכוז של DMSO נשאר מתחת 0.5% (v /v). מוסכם בדרך כלל כי חשיפה אפילו במינונים נמוכים של DMSO יכול לשנות באופן משמעותי את מורפולוגיה וחיבור של תאים ולעכב באופן משמעותי את התקדמות מחזורהתא 39,40.
שנית, יש לבצע את הכתמים בהקדם האפשרי לאחר הטיפול. מכיוון שאין מדרגות כביס...

הצעד הראשון לזיהוי טיפולים יעילים בסרטן הוא הבחירה של סיסוקסיות cytotoxicity חזקה, משוחדת שניתן להשתמש בה כדי לבחון את ההשפעה של הטיפול. בחירה נפוצה לניסויים בתפוקה נמוכה היא הדרה של צבע כחול trypan מתאי חיים. שיטה זו מועדפת כי היא מאפשרת שיטה יחסית משוחדת לכמת את הישרדות התא. טריפאן כחול מפזר באופן פסיבי לתוך תאים שהמברנות שלהם בסכנה, אבל זה חסום ביעילות מלהיכנס לתאים בריאים1. המנה של התאים החיים ואת התאים הכולל מייצג את הכדאיות אחוז, אשר מצביע על היעילות של הטיפול. החיסרון המשמעותי ביותר של ה-trypan Blue assay הוא שהוא אינו מתאים באופן גרוע לתודולוגיות בתפוקה גבוהה. יש לו יחס אות לרעש נמוך יחסית וכתמים ממושכים יכולים לגרום לחפצים בשל הכתמה של תאים קיימא. כתוצאה מכך, הדרה כחול trypan הוא בדרך כלל, אבל לא תמיד2, ירד לספירה ידנית. זה עושה את זה איטי מדי ומציג את האפשרות החזקה של הטיה בשל שיפוט סובייקטיבי של החוקר (אלא אם כן ספירות מסנוור או עצמאי משמשים, אשר להפחית עוד יותר את תפוקת המעבדה). באופן כללי, התפוקה של תפוקה זו אינה מספיקה לגילוי סמים מודרני.
הכדאיות, שבדרך כלל יש לה תפוקה הרבה יותר גבוהה, מאפשרת לחוקרים לעקוף מגבלה זו, אך מגיעים עם אזהרות משמעותיות (ראה טבלה 1). שיטות אלה בדרך כלל נופלות לשתי קבוצות. קבוצה אחת מורכבת מאסרים צבעוניים המבוססים על הפונקציה של אנזימי רדוקס תאיים. מצעים חסרי צבע או שאינם פלורסנט מומרים למוצרים מלאי חיים שניתן לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר. דוגמאות קלאסיות כוללות מלחי טרטאזוליום (MTT, WST-1, XTT וכו') ורסזורין. קטגוריה זו כוללת גם תסדירות זוהרות המשתמשות בלוציפרין כדי להעריך את רמת ה-ATP. לנתונים מסוג זה יש את המגבלה הבסיסית שהם מודדים את חילוף החומרים התאי, שהוא לא יכולת הכדאיות הסלולרית כשעצמה. זה די נפוץ עבור תאים להיות התרכך בתנאים שליליים, אבל עדיין לשמור על היכולת לחלק3,4,5. לדוגמה, תאי גזע סרטניים הם לעתים קרובות יחסית מטבוליתהרהיות 6,7,8,9, והם צפויים להיות קשה לומר באמצעות טכניקות אלה. יעילות של טיפולים המים נזק לתפקוד המיטוכונדריאלי, כגון רוב המיטוקנים, גם צפוי להיות מוערך יתר על המידה באופן משמעותי.
מתודולוגיה חלופית ממנפת את המאפיינים הכימיים של חומרים שונים המאפשרים להם לחצות או לא לחצות קרום ביולוגי. דוגמה אחת היא כתמים גרעיניים כגון SYTOX או פרודיד פרופידיום (PI). קטגוריה זו כוללת גם מאמרים הדומים בקונספט אך שונים בתפקודם, כגון ההירוגנאז של הקטט (LDH), המודד את שחרורו של LDH לתוך המילייה החוץ-תאי כאינדיקטור של נמק תאי (איור 1, טבלה 1). ההתאסות האלה מסוגלות יותר להבחין בין תאים לא פעילים מבחינה מטבולית לבין תאים מתים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>תסה/צבע</td>
			<td>זוהו סוגים של מוות בתאים</td>
			<td>ציוד נחוץ</td>
			<td>תכונות עיקריות</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, אלמר בלו (רזורין)</td>
			<td>אפופטוזיס/נמק</td>
			<td>ספקטרופוטומטר</td>
			<td>זול, מהיר; תסה נקודת קצה; תלוי בפעילות של אנזימים (מיטוכונדריאלי באופן בלעדי במקרה של MTT) ואינו מפלה בין מצבי מוות של תאים1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>שחרור LDH</td>
			<td>נמק</td>
			<td>ספקטרופוטומטר</td>
			<td>מהיר, ללא תלות בפעילות אנזימים מיטוכונדריאליים; יקר לבדיקות בתפוקה גבוהה; מזהה תאים נמקים עם קרום פלזמה מופשר11,12
</td>
		</tr>
<tr>
<td>כחול טריפאן (ש"ב)</td>
			<td>אפופטוזיס/נמק</td>
			<td>מיקרוסקופ</td>
			<td>תא מושלם; אינו מפלה בין מצבי מוות של תאים; עבודה ולא מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה; קשה יותר לשימוש עם תאים נדבקים; נוטה לשיפוט סובייקטיבי של המשתמש, אך נחשב לשיטת מדידת הכדאיות הסטנדרטית של התא13
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">תפוז ים עצין (AO)</td>
			<td>אפופטוזיס/נמק/</td>
			<td rowspan="2">מיקרוסקופ פלואורסצי</td>
			<td rowspan="2">צבע חומצה גרעין עם תכונות ספקטרליות ייחודיות, יכול להבחין בין אפופטוזיס ונמק/נמק14
</td>
		</tr>
<tr>
<td>נקרופטוזיס (נמק)</td>
		</tr>
<tr>
<td>הוצ'סט 33342, DAPI</td>
			<td>אפופטוזיס</td>
			<td>מיקרוסקופ פלואורסציטי או ציטומטר זרימה</td>
			<td>חדיר לתא; לא הולם בכוחות עצמו כדי לפקח על מוות תאים; שימושי להכתמה ב- co; יכול לשמש כדי להעריך עיסוק כרומטין ופיצול גרעין אפופטוזיס מוקדם; ניתן לזווג עם פרודיד פרופידיום להבחין אפופטוזיס מן הנמק15,16
</td>
		</tr>
<tr>
<td>פרופידיום לודיד(פי אי)</td>
			<td>אפופטוזיס/נמק מאוחר</td>
			<td>מיקרוסקופ פלואורסציטי או ציטומטר זרימה</td>
			<td>מנטרל תאי מושלם; מזהה הן אפופטוזיס מאוחר והן מצב נמק של מוות תא17. רעיל וחמלי לאחר דגירה ארוכה פעמים18
</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1 . רשימת ההתארות של ציטו-אקסיות. Cytotoxicity assays, שחלקם שימשו במחקר זה, המפורטים יחד עם התיאור הקצר של התכונות העיקריות שלהם.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חילוף החומרים המיטוכונדריאלי משתנה בכמהסוגי סרטן 19,20,21,22,23,24,25. לדוגמה, לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוצגו כדי להגן על המסה המיטוכונדריאלית שלהם, תוכן mtDNA, ונשימה מיטוכונדריאלית כדי לענות עלדרישות האנרגיה שלהם 19,26,27. מצד שני, כמה גידולים מוצקים מאופיינים בתפקוד מיטוכונדריאלי, או ליתר דיוק "תכנות מחדש חילוף חומרים", כגון downregulation של חלבונים מיטוכונדריאלי מעורב OXPHOS או ירידה בתכנים mtDNA, כי היה קשור פולשניות גידול, פוטנציאל גרורתי והתנגדות לתרופות מעוררות אפופטוזיס28,29. יתר על כן, לאחרונה, יש כבר עניין מוגבר באמצעות תרכובות מגוונות מכנית המשפיעים על תפקוד המיטוכונדריאלי (נקרא בדרך כללמיטוקאן 30),כטיפוליו פוטנציאליים עבור סוגי סרטן מסוימים. תרופות אלה מתמקדות סינתזה ATP, DNA מיטוכונדריאלי, OXPHOS, ו- ROS ייצור, כמו גם פרו אפופטוטי ואנטי אפופטוטי חלבונים הקשורים המיטוכונדריה30,31. מספר מחקרים הראו כי גישה זו יש הבטחהמשמעותית 19,32,33,34. עם זאת, סטיות מטבוליות אלה בביולוגיה של תאים סרטניים או טיפולים פילוח מיטוכונדריה עשוי להשפיע באופן משמעותי על הכדאיות המקובלת המבוססת על פונקציונליות מיטוכונדריאלית.
כאן, פרוטוקול ממוטב לתגרה גרעינית דיפרנציאלית מתואר. הפרוטוקול מאפשר קביעה מהירה ומדויקת של רעילות ציטוקוקסיות של מיטוקנים או השילובים שלהם עם תרכובות אחרות. Hoechst 33342 הוא צבע גרעיני חדיר לתא כי בקלות חוצה קרום התא להכתים DNA, המאפשר את ספירת התא הכוללת כדי להשיג. על ידי כתמים שותף עם PI, אשר רק נכנס הגרעין של תאים מתים, את חלקם של חיים (Hoechst בלבד) ומת (מוכתם בשניהם) תאים ניתן לקבוע במדויק. פרוטוקול זה מחדד את assayשפורסם 35 על ידי הוספת שלב אופטימיזציה של ריכוז הצבע (על ידי הצלבת תוצאות עם שיטת טריפאן כחול orthogonal) וצנטריפוגציה של הצלחת לפני הדמיה. מאז קווי תא רבים הם חצי דבק או מושעה, צנטריפוגציה מגדילה את חלקם של תאים התמונה ומשפר מאוד את הדיוק. ל-assay יש מספר יתרונות, כולל כתמים אלה אינם דורשים הסרת מדיה או כביסה. תערובת הצבע גם זולה, קלה להכנה ותואם למערכות צנרת רב-ערוציות/רובוטיות.
לאחר תאים כבר מוכתם, הם תמונה עם מיקרוסקופ אוטומטי. זה יש את היתרון הנוסף של יצירת רשומה קבועה של התמונות שניתן לנתח מחדש מאוחר יותר ואת ההשפעות של תרכובות מסוימות ניתן להעריך מחדש על ידי בדיקה חזותית של תמונות שנתפסו. לאחר שהושגו תמונות, ניתן לספור תאים באופן ידני או באמצעות כל אחת מחבילות תוכנה שונות, כולל הן בחינם (למשל, ImageJ, CellProfiler וכו') ותוכנה מסחרית (לדוגמה, Metamorph, Gen5 וכו'). ספירת תאים אוטומטית עדיפה בדרך כלל מאחר שצינורות ספירת תאים אוטומטיים שפותחו כראוי מדויקים יותר ומוטה פחות מספירת תאים ידנית. הם גם מתעלמים בצורה יעילה יותר מפסולת תאים או ממתחמים לא מסיסים. פיתוח של צינורות אלה הוא בדרך כלל פשוט והוא פשוט על ידי היעילות של הכתמים בשימוש. הפלט הוא כמותי מאחר שמספר התאים המתים בפועל מחושב באופן אוטומטי ביחס למספר תא כולל, וניתן להחיל ספי סף שונים כדי להגדיל או להקטין את המחרוזת שלזיהוי 35. לנוחיותכם, נכללים פרמטרים ממוטבים לספירת תאים באמצעות Gen5 v. 3.00 תואם תוכנת Cytation 5 Cell Imaging קורא מרובה מצבים.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td><td>Chem-Impex</td><td>50-519-067</td><td></td></tr><tr><td>3-bromo-pyruvate</td><td>Alfa Aesar</td><td>1113-59-3</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>צלחות 96 בארות שחורות או שקופות עם תחתית שטוחה 96 בארות </td></tr><tr><td>מגיב כדאיות תאי HS כחול אלמאר (100 מ"ל)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50101</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>תמיסה של 20 מ"מ; ריכוז סופי 1:1,000 </td></tr><tr><td>HyClone סרום בקר עוברי</td><td>GE Healthcare</td><td>#25-514</td><td></td></tr><tr><td>m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>טבליות PBS תרמו</td><td>פישר</td><td></td><td>BP2944100 טבליה אחת + 200 מ"ל מים סטריליים = 1x תמיסת PBS </td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100X)</td> <td>ערכת בדיקת LDH של Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-103-5952</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-596-072</td><td>אבקה יבשה; מלאי 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS; ריכוז סופי 5 ומיקרו; גרם/מ"ל (תאי לוקמיה), 1 ומיקרו; גרם/מ"ל (PBMCs רגילים) </td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>ארק פארם</td><td>AK115691</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>תיאזוליל כחול טטרזוליום ברומיד</td><td>ACROS Organics</td><td>AC158990010</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td><קווי תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>קו תאים CML </td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>ATCC</td><td></td><td>קו תאים AML </td></tr><tr><td>MOLT-4</td><td>ATCC</td><td>CRL-1582</td><td>כל קו התאים </td></tr><tr><td>OCI-AML2</td><td>ATCC</td><td></td><td>קו תאים AML </td></tr></tbody></table>

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

התרומה של המיטוכונדריה לטרנספורמציה אונקוגנית היא נושא של עניין רחב ומחקר פעיל. ככל שתחום חילוף החומרים של הסרטן הופך מורכב יותר, המטרה של מיקוד המיטוכונדריה באמצעות תרכובות שונות שגורמות לנזק מיטוכונדריאלי (מה שנקרא מיטוקנים) הופך פופולרי למדי. למרבה הצער, רבים קיימים cytotoxicity assays, כגון אלה המבוססים על מלחי tetrazolium או resazurin דורשים אנזימים מיטוכונדריאליים פונקציונליים עבור הביצועים שלהם. הנזק שנגרם על ידי תרכובות כי היעד המיטוכונדריה לעתים קרובות פוגע הדיוק של אלה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה המבוסס על כתם דיפרנציאלי עם שני צבעי פלורסנט, אחד מהם הוא תא חודר (Hoechst 33342) והשני הוא לא (פרודיד פרופידיום). ההבדל בכתמים מאפשר להפלות תאים חיים ומתים. ההסכם ניתן למיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה, אשר מגביר את התפוקה ומפחית הטיה. זה גם מאפשר את ההסחמה לשמש באופן בתפוקה גבוהה באמצעות צלחות 96-באר, מה שהופך אותו אופציה בת קיימא עבור מאמצי גילוי סמים, במיוחד כאשר התרופות המדוברות יש רמה מסוימת של מיטוקסיות. חשוב לציין, תוצאות שהושגו על ידי Hoechst / PI כתמים assay להראות עקביות מוגברת, הן עם תוצאות הדרה כחול trypan ובין שכפולים ביולוגיים כאשר ההשוואה מושווה שיטות אחרות.

הפרוטוקול הנ"ל פותח באמצעות תאי OCI-AML2, אשר נלקחו כנציג קו תא לוקמיה מיאלואידית חריפה. AML מאופיין בהתפשטות חריגה של תאים המטופואיטיים לא מושונים ולא פונקציונליים במח העצם26. למרות ההתפתחויות האחרונות בטיפול ממוקד AML, רמת הטיפול נותרה ללא שינוי במשך כמה עשורים, ומורכבת מטיפול אינדוקציה (המורכב בדרך כלל משלושה ימים של אנתרופיקלין, למשל, daunorubicin, idarubicin, או mitoxanthrone אינדוקציה, ו 7 ימים של cytarabine) ואחריו קונסולידציה (מורכב בדרך כלל של סיבובים של טיפול cytarabine ואחריו תקופות<sup...

הפרוטוקול מתאר תפוקה מהירה, גבוהה, אמינה, זולה, ובלתי משוחדת, לקביעת יעילות של הכדאיות הסלולרית. תסה זו שימושית במיוחד כאשר המיטוכונדריה של התאים נפגעה, מה שמפריע לאסות אחרות. ההסתה משתמשת בספירה אוטומטית של תאים המוכתמים בשני צבעים גרעיניים – Hoechst 33342 ו-propidium iodide.

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

שיטה זו תאפשר לחוקרים להעריך את הכדאיות התאית ללא תלות בתפקוד המיטוכונדריאלי. וזה נוח למאמצי סינון סמים תפוקה גבוהה. טכניקה זו מהירה, מדויקת, זולה, ומאפשרת קביעת תרכובות ציטוטוקסיות, כולל אלה הפוגעות בתפקוד המיטוכונדריאלי ברוב סוגי התאים.קל לבצע פרוטוקול זה. חשוב לשים לב להכנת התרופה, תנאי הטיפול וצפיפות התאים כדי להבטיח דיוק ותוקף ניסיוניים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שצעדי רכישת תמונה וניתוח תמונה יכולים להיות קשים לסיכום, במיוחד עבור חוקרים שיש להם ניסיון מועט עם Gen5 Software.התחל בהכנת פתרונות של תרכובות הריבית בריכוז הרצוי. הקפד תמיד לערבב תרכובות על ידי מערבולת ביסודיות. כדי למדוד ציטוטוקסיות של תרכובת אחת, להכין תרכובות בריכוז סופי 2X.אם מודדים ציטוטוקסיות של שילובים מורכבים, הכינו אותם בריכוז סופי של פי 4. הכן פקדים ממס רק על ידי ערבוב אותה כמות של ממס עם המדיום המתאים. לאסוף תאים לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ו aliquot 10 microliters של ההשעיה התא.לקבלת כתמים כחולים טריפאן, להוסיף 10 microliters של 0.4% trypan כחול aliquot ולהשתמש hemocytometer או מונה תאים לספור תאים קיימא ולא קיימא. תאי גלולה בצינור 15 מיליליטר ב 200 פעמים G במשך חמש דקות, ואז שאפו או decamped supernatant. אנחנו להשעות את גלולת התא במאמר מדיה מתאימה בצפיפות תאים של שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר.השתמש פיפטה רב ערוצית לזרוע 50 microliters של מתלים התא לתוך כל באר של צלחת 96 היטב. עבור בדיקות מורכבות בודדות, להוסיף 50 microliters של פתרון מורכב 2X לתוך כל באר. עבור בארות בקרת ממס, להוסיף 15 microliters של מדיה בדיקה המכיל את הממס בריכוז 2X.לשילוב בדיקות להוסיף 25 microliters של כל אחד תרכובות 4X לתוך כל באר. עבור בארות בקרה מורכבות יחיד, להוסיף 25 microliters כל פתרון מורכב 4X ומבחן בינוני. ודא כי הריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%כדי להבטיח את הרבייה, להוסיף תרופות עם טיפים פיפטה נוגע בצד של בארות.הקפד להוסיף את הסמים למקומות שונים. דקירות זה צריך להתבצע מהר מאוד, רצוי לוקח לא יותר מ 30 דקות לכל צלחת. הקישו בעדינות על הצלחת כדי לערבב את תכולת הבאר ולהדיגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.כאשר מוכנים להכתים את התאים עם Hoechst 33342 ו propidium יודיד להכין פתרון כתמים טריים 10X ולהוסיף 10 microliters לכל באר. יש להקיש בעדינות על הצלחת ולהדליר אותה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צנטריפוגה הצלחת ב 200 פעמים G במשך ארבע דקות כדי להביא את כל התאים לתחתית הצלחת.ואז בזהירות לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם לנגב מעבדה לחה כדי להסיר את כל הפסולת שעלולה להפריע הדמיה. תמונה הצלחת בתוך 15 דקות לאחר צנטריפוגה. פתח את Gen5 Software וצור פרוטוקול סטנדרטי חדש, לחץ על הליך ובחר את סוג הלוחות לשימוש.בדרך כלל, 96 צלחות פלסטיק שחורות היטב. לאחר מכן, הגדר את שיטת הקריאה לתמונה, לחץ על אישור ובחר ערכות DAPI ו- Texas Red Filter עם יעד הגדלה של פי 4. אין צורך בהיסט, שכן מרכזי היטב ידמיין.עבור מסנן DAPI, הגדר את LED ל- 10, זמן שילוב ל- 99 והתאפס. עבור טקסס רד, הגדר LED לשמונה, זמן אינטגרציה ל 950, ולהשיג 18. לחץ על אפשרויות כדי לוודא שהמוקד האוטומטי מבוצע בערוץ DAPI ואין היסט בהתמקדות בין ערוצים.שמור את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על אישור. כעת ניתן להקליט תמונות באמצעות לחצן 'קרא חדש'. לאחר הקלטת התמונות, לחצו על 'הפחתת נתונים' ובחרו 'עיבוד מקדים של תמונה'.החל עיבוד מראש של תמונה עם חיסור רקע כהה באמצעות גודל שיטוח אוטומטי בהתבסס על אות DAPI. עבור טקסס רד, השתמש באותן אפשרויות כמו עבור ערוץ 1. כשתסיים, לחץ על אישור.לאחר מכן עבור אל לוח הניתוח התאי והחל מסכה גרעינית המבוססת על אות DAPI שהשתנה עם ערך סף של 6, 000 יחידות, גודל אובייקט מינימלי של חמישה מיקרומטרים וגודל אובייקט מרבי של 25 מיקרומטר. נתחו את התמונה כולה, אל תכלול עצמים ראשוניים בגבול התמונה ופצלו עצמים נוגעים ללב. באפשרויות זיהוי מתקדמות, הגדר את קוטר הכדור המתגלגל כ- 30 מיקרומטרים והערך את הרקע בהתבסס על 5% מהפיקסלים הנמוכים ביותר.שמור רק את ספירת התאים במדדים מחושבים. לאחר מכן, לבצע ניתוח subpopulation המבוסס על הממוצע השתנה טקסס אדום אות עם ערך סף של 5, 000 יחידות לספור תאים מתים. לבסוף, גש לספירת התאים המתקבלת.תמונות מייצגות של תאים מוכתמים בהויכסט, יודיד פרופידיום מוצגים כאן. המספר הכולל של תאים גבוה למדי וגדול ממספר התאים המתים. כאשר פאנל של מטעני ציטוטוקסיות הושווה עם הדרה כחולה trypan, נמצא כי MTT ואת Alamar כחול מתנסה נמדד באופן לא מדויק הכדאיות התאית.אלה מיטוכונדריאלי אנזימים מבוססי assays הראו כדאיות נמוכה באופן משמעותי בהשוואה להדרה כחולה trypan. הכתמים הכפולים עם Hoechst 33342 ו- PI היו השילוב הטוב ביותר של חוסן, רגישות ועקביות עם כתמים כחולים טריפאן והחריגה החציונית הקטנה ביותר משיטת ההדרה הכחולה של trypan לאחר טיפול מק"ס או 2-DG. החיבור Hoechst PI היה יעיל גם בקביעת הכדאיות התאית לאחר טיפול עם מולקולות מיקוד המיטוכונדריה רוטנונה ושלוש ברומופירובאט.זה היה מאומת עוד יותר עם פאנל של קווי תא לוקמיה. תאים אלה השתנו ברגישות רוטנונה החל רגיש מאוד לתאי התנגדות. ביצועים לא נאותים של ההתרגם עלולים לסכן את דיוקו.מספר תוצאות שנפרצו מוצגות כאן. נטיפת יתר עם PI, הזנחת שלב הצנטריפוגה, או תפוקת יתר בערוץ Hoechst, תגרום לתוצאות תת-אופטימליות. בעת תזמון פרוטוקול זה, זכור לייעל את ריכוז הצבע ואת זמן הכתמים עבור כל קו תא.כמו כן, ציפוי עבור צלחת מדגם, יש צורך להבטיח איכות הדמיה. לאחר זיהוי של תרכובות של אפקט cytotoxicity על תאים סרטניים, החוקרים עשויים להמשיך עם מחקרים מכניים כדי לזהות את המטרות הרלוונטיות שלהם. סינון ספריות מולקולות קטנות בטכניקה זו במקביל לבדיקות MTT קונבנציונליות, יאפשר לזהות במהירות מולקולות שמכוונות לתפקוד המיטוכונדריאלי.

an-automated-differential-nuclear-staining-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים שיטת צביעה גרעינית לזיהוי ההשפעה ציטוטוקסית של מיטוקן על תאי סרטן רגישים לתרופות ועל וריאנטים בריאים. הצביעה הכפולה עם צבעים קושרי DNA כגון יודיד פרופידיום וצבע Hoechst מספקת הבחנה ברורה בין תאים מתים וחיים, ובכך מסייעת להעריך את ציטוטוקסיות של התרופה.

בדיקת צביעה גרעינית דיפרנציאלית: בדיקה לקביעת ציטוטוקסיות מיטוקאן על ידי פרופידיום יודיד וצביעה כפולה של הוכסט

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

Assay כל cytotoxicity הדם (אש"ל) הוא assay cytotoxicity שפותח על ידי שילוב טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועיבוד תמונה אוטומטי. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן לנתח תאי הלימפומה שטופלו בנוגדן anti-CD20 בזמן אמת בכל דם אדם כדי לספק ניתוח cytotoxicity סלולארי כמותי.

בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם

מיטוגנזה של לימפוציטים מסוג T מלווה בטרנספורמציה בלסטוגנית, שבה נפח התא גדל לפני חלוקת התא. כאן, אנו מתארים שיטה לכימות בלסטוגנזה בלימפוציטים מסוג T באמצעות מונה תאים אוטומטי עם יכולת מדידת קוטר תאים.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

הבחנה בשיטת החוץ הגופית היא שיטה מבוססת היטב להערכת הרעילות והרעלת הציטוזה, אך הבקיע את השימוש במיקרוסקופיה ידנית, הוא מפרך וסובל מהבדלים בין השונות לבין השערים. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לבצע גרסה אוטומטית לחלוטין של השיטה באמצעות זרימת הדמיה רב ספקטנטרי.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בדיקה מבוססת היטב לכימות נזק לדנ"א. עם זאת, ניקוד הבדיקה באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה ידנית או ניתוח תמונה מבוסס תכונות הוא מייגע ומאתגר. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לפיתוח מודל בינה מלאכותית כדי להבקיע את מבחן MN באמצעות נתוני ציטומטריה של זרימת הדמיה.

אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית

ניתן לחקור ביו-אנרגטיקה של תאי CD8 T באמצעות מבחן מאמץ מיטו. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תכנות מטבולי אקוטי וכרוני. פרוטוקול זה מתאר גישות לבחינת הקשרים בין ביולוגיה של קולטני תאי T לניתוח ביו-אנרגטי.

מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של תאי CD8 T נאיביים ואפקטורים

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

למדו לבצע ניתוח אוטומטי של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעת ציטוקוקסיות מיטוכונדריאלית. שיטה זו מאפשרת הערכת חייות תאים בלתי תלויה בפעילות מיטוכונדריאלית, מתאימה לסינון תרופות בקיבולת גבוהה ומספקת תוצאות מהירות ומדויקות.

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

גלה סרטונים נוספים