Name: הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: למד הזרקת מיקרו של אקטין מצומד לרודמין לעוברי דרוזופילה לחקירת הרכבת מוטות אקטין תוך-גרעיניים בתגובה ללחץ חום. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת אקטין במגוון הקשרים ניסיוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים בהכרת תודה על עבודתם של ליוליו ז'נג וזנגווי שו, שעזרו לחלוץ טכניקה זו במעבדת סוקאק, כמו גם חסן סד שעזר בניתוח. העבודה למחקר זה ממומנת על ידי מענק מ- NIH (R01 GM115111).

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

משמעותה של שיטה זו היא שהיא משתמשת בפרוטוקול מבוסס היטב של microinjection בעוברים Drosophila 21,22,23,24,25,26,27 כדי לאפשר מחקר חדש לגבי ASR וליווי הרכבת מוט actin. היתרון העיקרי של הזרקת אדום G-actin לעוברים חיים הוא כי ASR ניתן ללמוד תחת מגוון רחב של הקשרים. עבור מחקרי...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להזריק G-actinאדום כדי לדמיין את ההרכבה של מוטות actin תוך גרעיני בעוברים לחוצים חום שעוברים תגובת מתח Actin בלתי ניתנת לערעור (ASR)1. פיתחנו פרוטוקול זה כדי לסייע במחקרים של ASR, אשר בעוברים מוביל מורפוגנזה משובשת וכדאיות מופחתת, ובסוגי תאים אנושיים בוגרים קשורה פתולוגיות כולל אי ספיקת כליות2, מיופתיות שרירים3, אלצהיימר ומחלת הנטינגטון4,5,6,7,8. זה ASR הוא המושרה על ידי לחצים תאיים רבים, כולל הלם חום9,10,11, מתח חמצוני4,6, סינתזת ATPמופחתת 12, ו האנטינטין חריג או אוליגומריזציה עמילואיד β4,5,6,7,9,13,14,15,16. סימן ההיכר של ASR הוא הרכבה של מוטות אקטין חריגים בציטופלסמה או בגרעין של תאים מושפעים, המונע על ידי היפראקטיביות הנגרמת על ידי מתח של חלבון אינטראקציה actin, Cofilin1,5,6,10. למרבה הצער, פערי ידע מרכזיים נשארים לגבי ASR. לדוגמה, הפונקציה של מוטות actin אינו ידוע. איננו מבינים מדוע מוטות נוצרים בציטופלסמה של סוגים מסוימים של תאים, אלא בגרעין של אחרים. כמו כן לא ברור אם ASR הוא מגן או לא מתאים עבור תאים או עוברים שעברו מתח. לבסוף, אנחנו עדיין לא יודעים את המנגנונים המפורטים שבבסיס היפראקטיביות Cofilin או הרכבה מוט actin. לפיכך, פרוטוקול זה מספק בדיקה מהירה ורב-תכליתית כדי לחקור את ASR על ידי הדמיה היווצרות מוט actin ודינמיקה במערכת ניסיונית ניתנת להפעלה מאוד של עובר זבוב הפירות החי.
הפרוטוקול כדי microinject G-actinאדום לתוך עוברים חיים Drosophila פותחה בתחילה כדי ללמוד את הדינמיקה של מבנים נורמליים cytoplasmic actin17 במהלך אירועי בניית רקמות. במחקרים אלה, מצאנו כיהזרקת אדום G-actin לא השפיעה לרעה על תהליכים התפתחותיים מוקדמים בעובר, כולל ציטוקינזיס או גסטריולציה17,18. לאחר מכן שינינו את הפרוטוקול, התאמת הטיפול בעוברוהזרקת אדום G-actin כדי לאפשר הדמיה של מוטות actin בחום עוברים ASR1. שיטות אחרות מלבדהזרקת אדום G-actin ניתן להשתמש כדי לדמיין actin בעוברים. שיטות אלה מסתמכות על ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים (FPs) המתויגים לפעול או לתחומים של חלבונים מחייבים actin, כגון Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP, ו Moesin-GFP (נבדק בשנת19). עם זאת, באמצעות בדיקות FP אלה דורש זהירות כי הם יכולים לייצב או לשבש כמה מבנים actin, לא באותה מידה תווית כל מבני actin20, ובמקרה של actin-GFP, הם מוגזמים מאוד – בעייתי לניתוח של הרכבת מוט אשר לא רק תלוי מתח אלא גם actin ריכוז תלוי1. לכן, G-actinאדום הוא החללית המועדפת על מחקרי מוט בעוברים לעוף, ואת הגודל הגדול של העובר מאפשר הזרקה קלה שלה.
זרימת העבודה של פרוטוקול זה דומה לטכניקות microinjection מבוססות אחרות ששימשו להזרקת חלבונים, חומצות גרעין, תרופות, אינדיקטורים פלואורסצנטיים לתוך עוברי Drosophila 21,22,23,24,25,26,27. עם זאת, בעקבות microinjection של אדום G-actin כאן, עוברים נחשפים ללחץ חום קל כדי לגרום ASR והרכבה מוט actin תוך-גרעיני. עבור מעבדות עם גישה זבובים אסדת הזרקה, שיטה זו צריכה להיות מיושמת בקלות להתאמה עבור קווי לימוד ספציפיים לגבי ASR, כולל אינדוקציה שלה על ידי לחצים שונים או אפנון ברקעים גנטיים שונים.

<table><tbody><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>Millipore-Sigma A23835G</td><td></td><td>רכיב של G buffer</td></tr><tr><td>מיץ תפוחים, Mott's, 64 אונקיות נוזל</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>רכיב של צלחות מיץ תפוחים</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>רכיב של צלחות מיץ תפוחים</td></tr><tr><td>אקונומיקה, קוטל חיידקים PureBright, 6.0% נתרן היפוכלוריט</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>לעוברים מפרקים</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Millipore-Sigma C1016500G</td><td></td> רכיב של <td></td></tr><tr><td>מסננת תאי חיץ G, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>לאיסוף עוברים מפורקים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי, LSM 880 34 ערוצים עם Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>להדמיית מוטות אקטין תוך-גרעיניים</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>לייבוש עוברים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח, סטריאוסקופ Stemi 508 עם זום 8:1</td><td></td><td>Zeiss 4350649000000</td><td>לסידור עוברים על טריז אגר</td></tr><tr><td>מחט ניתוח, 5 ב</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>לסידור עוברים על טריז אגר</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td> רכיב של סרט דו צדדי <td>מאגר G</td></tr><tr><td>, סקוטי קבוע, 0.5 אינץ' x 250 ב</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>להכנת דבק עוברי</td></tr><tr><td>כלוב איסוף עוברים</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>לשיכון זבובים בוגרים ואיסוף עוברים</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה, פינצטה דומונט, סגנון 5</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72701D</td><td>לסידור עוברים על טריז אגר</td></tr><tr><td>נימי זכוכית, זכוכית בורוסילקטית, דקה 1 מ"מ x 0.75 מ"מ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>למיקרו-מחטים</td></tr><tr><td>שמן הלוקרבון 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>להידרציה של עוברים</td></tr><tr><td>אינקובטור שלב מחומם</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>להדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>מגבי רקמות מעבדה, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>מגבי רקמות מעבדה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור, Invertoskop 40C ניגודיות פאזה הפוכה מיקרוסקופ,</td><td>מיקרוסקופ הזרקה</td>משופץ <td>Zeiss</td><td>שהופסק</td></tr><tr><td>מתיל-4-הידרוקסיבנזואט</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>רכיב של צלחות מיץ תפוחים</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>מיקרו-מזרק</td></tr><tr><td>מיקרו טיפים למעמיס, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>להעמסת מיקרו-מחטים</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ושלב הזרקה עם חוגות x,y,z להתאמת מחט</td><td>Bernard Instruments, Inc (יוסטון, טקסס)</td> <td>מותאם אישית</td><td>לביצוע מיקרו-הזרקות</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה, דגם P-97, מכשירי סאטר בוערים/חומים</td><td></td><td>P97</td><td>למשיכת צינורות נימיים לייצור מיקרו-מחטים</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 24x50-1.5</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12544E</td><td>להרכבת עוברים</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ, לילך קולפרוסט, נקי מראש, 25 x 75 x 1 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22037081</td><td>להרכבת עוברים להזרקה</td></tr><tr><td>n-Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>רכיב של דבק עובר</td></tr><tr><td>מטרה, 10x</td><td>Zeiss</td><td>הופסק</td><td>10x מטרה למיקרוסקופ</td></tr> <tr><td>הזרקהאובייקטיבי, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>מטרת מים 40x למטרה קונפוקלית</td></tr><tr><td>, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 לטבילה בשמן, מים, שמן סיליקון או גליצרין (D=0-0.17 מ"מ) (WD=0.57 מ"מ ב-D=0.17 מ"מ)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x מטרת טבילה מעורבת למטרה קונפוקלית</td></tr><tr><td>, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td></td><td>4207829900799-63x מטרת שמן עבור קונפוקלי</td></tr><tr><td>מכחול, רוברט סימונס ביטוי E85 מחודד בגודל עגול 2</td><td>038372016954 Daler-Rowney</td><td></td><td>להעברת עוברים</td></tr><tr><td>מגבות נייר, מגבות נייר קלינקס C-fold, 884266344845</td><td>קימברלי-קלארק</td> לבן <td></td><td>למסננת תאים</td></tr> פסטר<tr><td>, 5 3/4 בפישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>1367820A</td><td>לכיסוי עוברים</td></tr><tr><td>בשמן צלחת פטרי, זכוכית, 100 x 20 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>3160102</td><td>לתא דגירה לח</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, פלסטיק, 60 x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>לצלחות מיץ תפוחים</td></tr><tr><td>פיפטה, אפנדורף התייחסות 0.5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>להעמסת קצה הפיפטה המיקרו-מחט</td></tr><tr><td>, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>להוספת דבק עוברי לכיסוי</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>לחיתוך טריז אגר, סרט, קצות פיפטה</td></tr><tr><td>אקטין כדורי מצומד רודמין, טסיות דם אנושיות (לא שריר; 4x10 &mu; ז)</td> <td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^ בקבוקון</td></tr><tr><td>נצנוץ אדום, 20 מ"ל בורוסיליט זכוכית עם תוחם פוליאתילן ומכסי אוריאה</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>להכנת דבק עוברי</td></tr><tr><td>צנצנת עליונה בורגית, 16 אונקיות</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>לייבוש עוברים</td></tr><tr><td>שלב מיקרומטר</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>602104PG</td><td>לכיול נפח הזרקת G-actin</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>רכיב של צלחות מיץ תפוחים</td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Millipore-Sigma T15031KG</td><td></td><td>רכיב של</td></tr><tr><td>שמרי G buffer, שמרי Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 אונקיות</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>רכיב של משחת שמרים</td></tr></tbody></table>

הדמיה מוטות actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

מטרת פרוטוקול זה היא לדמיין מוטות אקטין תוך-גרעיניים המתכנסים בעוברים חיים של דרוזופילה מלנוגאסטר בעקבות עומס חום. מוטות אקטין הם סימן היכר של תגובת מתח Actin שמורה ובלתי ניתנת להכנעה (ASR) המלווה פתולוגיות אנושיות, כולל מחלה נוירודגנרטיבית. בעבר, הראינו כי ASR תורם כשלים morphogenesis וכדאיות מופחתת של פיתוח עוברים. פרוטוקול זה מאפשר את המשך המחקר של מנגנונים שבבסיס הרכבת מוט actin ו ASR במערכת מודל כי הוא מאוד נוח הדמיה, גנטיקה וביוכימיה. עוברים נאספים ומורכבים על כיסוי כדי להכין אותם להזרקה. אקטין כדורי מצומד רודמין (G-actinאדום)מדולל וטעון לתוך microneedle. זריקה אחת נעשית למרכזו של כל עובר. לאחר ההזרקה, העוברים הם דגירה בטמפרטורה גבוהה מוטות actin תוך גרעיניים הם דמיינו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאוששות פלואורסצנטית לאחר ניסויים photobleaching (FRAP) ניתן לבצע על מוטות actin; ומבנים אחרים עשירים באקטין בציטופלסמה יכולים גם הם להדמיינו. אנו מוצאים כי G-actinאדום polymerizes כמו G-actin אנדוגני ואינו, בכוחות עצמו, להפריע להתפתחות העובר נורמלי. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי יש לנקוט טיפול במהלך ההזרקה, כדי למנוע פגיעה חמורה בעובר. עם זאת, עם תרגול, הזרקת G-actinאדום לתוך עוברים Drosophila היא דרך מהירה ואמינה לדמיין מוטות actin והוא יכול לשמש בקלות עם זבובים של כל גנוטיפ או עם כניסתה של לחצים הסלולר אחרים, כולל היפוקסיה ומתח חמצוני.

זרימת עבודה סכמטית של טיפול בעובר מתוארת באיור 1, ולוח זמנים לניסוי טיפוסי מוצג בטבלה 1. הערכה לתוצאה ניסיונית טובה היא שעל כל 10 עוברים שהוזרקו, לפחות מחצית מהעוברים שנצפו יהיו בשלב ההתפתחותי הנכון, לא ניזוקו, ויפגינו ASR חזק עם עומס חום ב 32 מעלות צלזיוס. ASR זה יתגלה על ידי הרכבה של מוטות אקטין תוך-גרעיניים כפי שמוצג בתמונת תצוגת פני השטח הייצוגית של עובר באיור 2A (לוח ימני). מוטות אקטין יופיעו במספר כיוונים (מקבילים או בניצב למישור ההדמיה) ...

המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא משתמש בטכניקה המבוססת של מיקרו-הזרקה בעוברי דרוזופילה כדי לאפשר מחקר חדש על תגובת הלחץ של האקטין והרכבת מוט האקטין הנלווית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקור את תגובת הלחץ של אקטין במגוון הקשרים, כגון מסך מוטנטי או בתנאי לחץ שונים. אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו בעבר עלול להתקשות בטיפול בעוברים ובביצוע המיקרו-הזרקה.אנו ממליצים לתרגל את השלבים הללו עד שהמשתמש ירגיש בנוח. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הטיפול, המיקום וההרכבה של העובר הן עבור מיקרו-הזרקה והן עבור הדמיה עשויים שלא להיות ברורים מהוראות כתובות בלבד. הכן כוסות איסוף עוברים וצלחות אגר מיץ תפוחים לפי הוראות כתב היד.כדי לקדם את הטלת הביצים הנדיבה ביותר, הקימו כוסות איסוף עם זבובים יומיים לפני הניסוי. הוסף לפחות 100 נקבות ו -50 זבובים זכרים לכל איסוף, ואז כסה אותה בצלחת מיץ תפוחים. הכינו תמיסת עבודה של G-actin red ואחסנו אותה על קרח עד שהיא נטענת לתוך המיקרו-מחט.אפשר לזבובים להטיל עוברים במשך 30 דקות על צלחות מיץ התפוחים עם רסק שמרים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. בזמן שהזבובים מטילים, גזרו טריז מלבני של ארבעה על סנטימטר של אגר מיץ תפוחים בעזרת סכין גילוח והניחו אותו על מגלשת זכוכית בגודל 25 על 75 מילימטר. קצרו את הצלחת מהאוסף ופרקו את העוברים על ידי שפיכת תמיסת

imaging-intranuclear-actin-rods-live-heat-stressed-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למד הזרקת מיקרו של אקטין מצומד לרודמין לעוברי דרוזופילה לחקירת הרכבת מוטות אקטין תוך-גרעיניים בתגובה ללחץ חום. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת אקטין במגוון הקשרים ניסיוניים.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים