Name: מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: למד לקבוע את מצב האוליגומר המקורי של חלבוני קרום באמצעות חלקיקי קרום תא מקוריים ומיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו מספקת נתונים מבניים מדויקים בסביבה דומה לקרום תא טבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפ VCU (לי.ג.) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM132329 (ל- Y.G.) התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים למונטסראט סאמסו וקווין מקרוברטס על תמיכתם הנדיבה בהקלטת וידאו.

1. ביטוי חלבון
<ol><li>לחסן 15 מ"ל של מרק נהדר (TB) מדיה עם אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים עם BL21(DE3) pLysS תאים המכילים את AcrB המביעים פלסמידים ב 50 צינורות מ"ל לילה ב 37 °C (69 °F) עם רועד ב 250 סל"ד.</li>
	<li>בדוק את הצפיפות האופטית של תרבות הלילה ב 600 ננומטר (OD600) ולוודא שזה מעל 2.0.</li>
	<li>לדלל 5 מ"ל של תרבות התא לתוך 1 L של מדיה שחפת המכילה אנטיביוטיקה ספציפית פלסמידים דגירה ב 37 °C (67 °F) עם רועד עד OD600=0.8 ולאחר מכן לגרום עם IPTG כי יש ריכוז סופי של 1 mM.</li>
	<li>לבצע אינדוקציה ב 20 מעלות צלזיוס עם רועד במשך 20 שעות.</li>
	<li>גלולה במורד התאים באמצעות צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ו 4,000 x גרם.</li>
</ol>2. תמוגת תאים ובידוד קרום
<ol><li>Resuspend גלולת התא במאגר A(טבלה 1, להשתמש DDM מאגר A או NCMNs מאגר A בהתאם ערכת טיהור כי הוא לעקוב) באמצעות 80 מ"ל עבור כל 20 גרם של גלולת התא.</li>
	<li>הומוגניזציה כדורי התא resuspended באמצעות homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.</li>
	<li>מעבירים את הדגימה לתוך כיפת מתכת על קרח ו lyse התאים על ידי טעינת אותם לתוך הומוגניזר בלחץ גבוה ב 4 מעלות צלזיוס ו 1,500 בר.<ol>
<li>חזור על תהליך הטעינה של התאים לתוך homogenizer ומאפשר להם לעבור את homogenizer במשך 3-4 מחזורים או עד lysate מתחיל להבהיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה lysate ב 15,000 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את supernatant ולהעמיס לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה ב 215,000 x g עבור 1 שעה ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>להשליך את supernatant ולאסוף את כדורי הממברנה מן הצינורות ultracentrifuge. לאחסן כל גלולה קרום עודף ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת חלקיקי קרום התא המקומי
<ol><li>Resuspend 1 גרם של גלולת ממברנה ב 10 מ"ל NCMNs מאגר A(טבלה 1).</li>
	<li>הומוגניזציה של דגימת קרום התא בשימוש חוזר עם homogenizer Dounce זכוכית ב 20 °C (69 °F).</li>
	<li>העבר את דגימת הממברנה המושעית לצינור פוליפרופילן 50 מ"ל והוסף פתרון מלאי פולימרים פעילים ממברנה ומאגר NCMNs נוסף A כדי להביא את המדגם לריכוז סופי של 2.5% (w / v) ממברנה פולימר פעיל (NCMNP1-1 או NCMNP5-2). הערה: פתרונות מלאי של פולימרים פעילים קרום צריך להתבצע במים מזוקקים כפולים ניתן לשמור בריכוזים שונים, אבל בדרך כלל 10% (w / v).</li>
	<li>לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטעון את המדגם לתוך ultracentrifuge ולהסתובב ב 150,000 x g עבור 1 שעה ב 20 °C (69 °F).</li>
	<li>בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל לאיזון עמודה 5 מ"ל Ni-NTA עם 25 מ"ל של מאגר NCMNs A.</li>
	<li>לאסוף את supernatant לאחר ultracentrifugation הושלם לטעון אותו על 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA בטמפרטורת החדר עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.</li>
	<li>לשטוף קווי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) עם מספיק NCMNs מאגר B (טבלה 1) כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs B עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר NCMNs C (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>יש לאלוט את החלבון ב-20 מ"ל של NCMNs Buffer D(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הדגימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.</li>
	<li>אחסן את דגימות החלבון ב-4°C.</li>
	<li>הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE על מנת לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.</li>
</ol>4. אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE
<ol><li>הכינו את תא הליהוק על ידי הידוק הזכוכית למנגנון הליהוק.</li>
	<li>מכינים את ג'ל ההפרדה 12% על פי המתכון המפורט בטבלה 1. הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.</li>
	<li>יוצקים את הג'ל, משאירים 2 ס"מ מתחת לתחתית המסרק עבור ג'ל הערימה.</li>
	<li>הסר את כל הבועות על ידי שכבות החלק העליון של הג'ל עם 100% isopropanol ולחכות ג'ל ההפרדה כדי polymerize.</li>
	<li>הסר את isopropanol ולשטוף את כל העקבות של isopropanol עם מים מזוקקים.</li>
	<li>מכינים את ג'ל הערימה לפי המתכון המפורט בטבלה 1. הערה: לאחר הוספת TEMED הג'ל יתמזג במהירות ולכן רק להוסיף את זה פעם אחת מוכן לשפוך את הג'ל.</li>
	<li>יוצקים את ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה.</li>
	<li>מוסיפים מסרק לתא כדי ליצור את הבארות ומחכים שהג'ל לערום יתוקן לחלוטין.</li>
	<li>מניחים μL אחד של 1 M DTT לתוך צינור microcentrifuge עבור כל מדגם שבר שצריך לרוץ על הג'ל.</li>
	<li>הוסף 7 μL של מאגר טעינה 4x לכל צינור גם כן.</li>
	<li>הוסף 20 μL של מדגם מן השברים כי צריך להיות לרוץ על הג'ל לכל צינור microcentrifuge.</li>
	<li>וורטקס הצינורות המכילים את הדגימות.</li>
	<li>סובבו את צינורות הדגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה על השולחן במשך 3 שניות וודאו שכל הדגימה חזרה לתחתית הצינורות.</li>
	<li>הכינו את תא האלקטרופורזה של הג'ל על ידי אבטחת קלטת ג'ל פוליאקרילמיד 12% למקומו ומילוי התאים הפנימיים והחיצונים של התא במאגר Tris-acetate-EDTA (TAE)(טבלה 1).</li>
	<li>טען את סמן המשקל המולקולרי לנתיב הראשון של הג'ל עם הנפח המתאים הנדרש על פי הוראותיו.</li>
	<li>טען 28 μL של המדגם מכל צינור מעורבב עם DTT ומאגר טעינה.</li>
	<li>הנח את המכסה של תא האלקטרופורזה על גבי התיבה וחבר את המכסה לאספקת החשמל.</li>
	<li>הפעל את ספק הכוח והגדר אותו ל- 100 V ואפשר לו לפעול במשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר 20 דקות, להגדיל את זרם אספקת החשמל ל 140 V ולהמשיך להפעיל אותו עוד 30-40 דקות או עד הלהקה של צבע מאגר טעינה מגיע לתחתית קלטת הג'ל.</li>
	<li>לאחר השלמת כתם אלקטרופורזה ו de-stain הג'ל כדי לדמיין את רצועות החלבון הכלולות בתוך הג'ל.</li>
</ol>5. טיהור חלבונים באמצעות DDM
הערה: מטרת ביצוע תהליך טיהור זה היא לשמש כבקרה לניסויים העושים שימוש בפולימרים הפעילים של הממברנה.
<ol><li>Resuspend 6-10 גרם של גלולת ממברנה, משלב 2.6, ב DDM Buffer A (טבלה 1) באמצעות 5 מ"ל / גרם של גלולת ממברנה.</li>
	<li>הומוגניזציה מדגם resuspended עם homogenizer Dounce זכוכית ב 4 מעלות צלזיוס או אם בטמפרטורת החדר הקפד לשים על קרח מיד לאחר.</li>
	<li>להעביר מדגם 50 מ"ל של צינור פוליפרופילן ולהוסיף DDM ומאגר DDM נוסף A להביא את המדגם לריכוז הסופי של 2% DDM.</li>
	<li>לנער את המדגם במשך 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>טען את הדגימה לתוך צינורות ultracentrifuge וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס ו 150,000 x גרם.</li>
	<li>בעוד המדגם הוא להיות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין את 5 מ"ל של עמודה Ni-NTA על ידי כביסה עם 25 מ"ל של מאגר DDM A (טבלה 1).</li>
	<li>לאחר השלמת ultracentrifugation, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו על 5 מ"ל Ni-NTA עמודה ב 4 °C (69 °F) עם קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק.</li>
	<li>שטיפת קווי FPLC עם מספיק DDM Buffer B + 0.05% DDM (טבלה 1)כדי לרוקן לחלוטין את המערכת ולאחר מכן לחבר את העמודה למכונת FPLC.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM B + 0.05% DDM עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>לשטוף את העמודה עם 30 מ"ל של מאגר DDM C + 0.05% DDM (טבלה 1) עם קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה ולאסוף את הזרימה דרך.</li>
	<li>יש לטבול את החלבון ב-20 מ"ל של DDM Buffer D + 0.05% DDM(טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף את הזרימה באמצעות אספן שברים והשברים שכל אחד מהם מוגדר ל-1.0 מ"ל.</li>
	<li>בחר את השברים המכילים את שיא elution עבור איגום והתרכזות באמצעות רכז צנטריפוגלי צנטריפוגה ב 4,000 x g ו 4 °C (60 °F) עד להגיע 500 μL.</li>
	<li>באמצעות לולאת μL 500 לטעון את המדגם לתוך מכונת FPLC ולאחר מכן על עמודת אי הכללה בגודל 25 מ"ל ב 4 °C (69 °F). יש להשתמש ב-30 מ"ל של DDM Buffer E + 0.05% DDM (טבלה 1)בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה ולאסוף כשברים כשגדלי השבר מוגדרים כ- 0.5 מ"ל לשבר.</li>
	<li>קח את השברים ולמדוד את ריכוז החלבון באמצעות ספיגה של 280 ננומטר כדי לאשר עקומת UV-Vis מגרף elution FPLC.</li>
	<li>לאסוף 20 μL מכל שבר מדגם התואמים פסגות שנצפו על גרף elution FPLC ואושרו להיות מדויק עם בדיקת הספיגה.</li>
	<li>להקפיא את שאר שברי מדגם אלה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש aliquots הרצוי ולאחסן דגימות חלבון ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל בדיקת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE כפי שתואר קודם לכן כדי לבדוק את הדגימות המתאימות לפסגות שנצפו בגרף elution FPLC.</li>
</ol>6. הכנת רשת כתמים שלילית
<ol><li>מניחים את הרשתות כי הם הולכים לשמש להכנת מדגם על שקופית זכוכית עטוף נייר מסנן עם צד הפחמן פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מניחים את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים לתוך התא של הפרש זוהר בין שתי האלקטרודות ולהחליף את מכסה הזכוכית לוודא שהוא ממורכז ואטום היטב.</li>
	<li>הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על-ידי הפלזמה נראה לעין.</li>
	<li>כאשר המכונה נעשית פועל, לחכות עד התא הגיע ללחץ אטמוספרי כדי להסיר את מכסה הזכוכית ולאחר מכן להחזיר את השקופית עם הרשתות לספסל שבו דגימות יהיה טעון עליהם.</li>
	<li>להתאים את הריכוז של דגימות חלבון מטוהרים על 0.1 מ"ג / מ"ל על ידי דילול המדגם עם המאגר המתאים או להתרכז באמצעות רכז צנטריפוגלי.</li>
	<li>לטעון 3.5 μL של דגימת חלבון על רשת פחמן 10 ננומטר עבה ולחכות 1 דקות.</li>
	<li>הסר את הנוזל מפני השטח של רשת EM עם נייר מסנן.</li>
	<li>לשטוף את משטח הרשת 3x על ידי להרים 3 טיפות μL של מים עם הרשת והסרת המים מהרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.</li>
	<li>לשטוף את משטח הרשת 2x על ידי להרים 3 טיפות μL של טרי, מסונן 2% אורניום אצטט ולהסיר את פתרונות לשטוף על הרשת עם נייר מסנן בין להרים כל טיפה.</li>
	<li>הכתים את הרשת עם טיפה 3 μL של טרי, מסונן 2% אצטט אורניום במשך 1 דקות.</li>
	<li>הסר את פתרון אצטט אורניום על פני השטח של רשת EM עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשת לפחות 1 דקות.</li>
	<li>אחסן את הרשת בתיבת רשת לשימוש במועד מאוחר יותר.</li>
</ol>7. הדמיה EM
<ol><li>טען את הרשת המוכנה למחזיק הרשת בשולחן עבודה בטוח.</li>
	<li>מכינים את המיקרוסקופ על ידי הצבת המיקרוסקופים dewar לתוך תיבת פוליסטירן ולמלא את dewar 3/4th מלא חנקן נוזלי.</li>
	<li>ודא כי כיסוי הגומי של חלון המיקרוסקופ מכסה אותו ולאחר מכן לטעון את dewar על המיקרוסקופ על ידי הצבת חוטי נחושת לתוך dewar עד שהוא מתאים על הפלטפורמה.</li>
	<li>ממלאים את שארית החנקן בנוזל ומניחים כובע על גבי ה dewar כדי לכסות אותו.</li>
	<li>להפעיל את המתח הגבוה, להתנות את המיקרוסקופ, ולחכות מיקרוסקופ להתחמם וליצור רמת ואקום בטוח לשימוש.</li>
	<li>ברגע שהמיקרוסקופ מוכן לפתוח את שסתום העמודה ולאשר את הקרן קיימת על ידי הסרת כיסוי הגומי על חלון המיקרוסקופ.</li>
	<li>בדוק את סטיגמות הקרן על ידי התפשטות פנימה והחוצה על ידי התאמת עוצמת הקרן. אם אסטיגמציה קיימת הקרן תהיה צורה אליפטית כמו אחד נע מן הצלבה ואת הקרן צריכה להיות באותה צורה אליפטית משני הצדדים.</li>
	<li>התאם את משקפת המיקרוסקופ כך שתהיה הגובה והמרחק הנכונים לפי עיניו של הצופה.</li>
	<li>בדוק את מיקום הקרן עבור מצבי חיפוש, מיקוד וחשיפה על-ידי רכיבה על אופניים בכל שלושת המצבים עד שהקרן תמרכז בכל אחד מהם.</li>
	<li>סגור את שסתום העמודה והמשך לטעון את מחזיק הרשת למיקרוסקופ האלקטרונים.</li>
	<li>התאם את המיקרוסקופ לגובה האוצנטרי באמצעות התכונה microscopes wobbler והתאמת תנועת הבמה באמצעות ציר Z עד שלא תהיה תנועה מצד לצד של המדגם במרכז.</li>
	<li>באמצעות מצב חיפוש במינון נמוך על מיקרוסקופ לחפש את הרשת עבור אזור רצוי של ניגודיות סבירה עם מולקולות מדגם נוכח להתמקד במדגם.</li>
	<li>התמקד בדוגמה במצב מיקוד באמצעות גודל שלב גבוה עד שהדוגמה תיראה ולאחר מכן הקטן שלבים למציאת רמת המוקד הנכונה.</li>
	<li>אפס וריק הקרן ולאחר מכן להיות בטוח כרית הגומי מכסה את חלון המיקרוסקופ.</li>
	<li>במצב חשיפה, צלם את התמונה של אזור הרשת הרצוי לחשיפה של 1 שניות בהגדלה של 62,000x ובדוק את התמונה שהתקבלה.</li>
	<li>כאשר נעשה הדמיה רשת לסגור את שסתומי העמודה ולהסיר את מחזיק הרשת מהעמודה.</li>
	<li>כאשר סיים לדמיין את כל רשתות העניין לכבות את המיקרוסקופ על ידי כיבוי כוח חוטים והסרת חנקן נוזלי dewar מן המיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים משהו לספוג לחות על הדוכן שבו דיואר ישב לתפוס עיבוי מן סלילי הנחושת של המיקרוסקופ.</li>
	<li>הפעל את מצב מחזור Cryo וודא שמשאבת הטורבו כבויה.</li>
</ol>

<ol><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Huang, H., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+recall+estimates+for+two-hybrid+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Precision and recall estimates for two-hybrid screens.</a> Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+system+and+false+positives.+Approaches+to+detection+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination.</a> Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).</li>
<li>Ngounou Wetie, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+stable+and+transient+protein-protein+interactions%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future.</a> Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).</li>
<li>Schaufele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+quantitative+accuracy+and+reproducibility+of+Forster+resonance+energy+transfer+measurement+for+screening+by+high+throughput+widefield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy.</a> Methods. 66 (2), 188-199 (2014).</li>
<li>Berney, C., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+or+no+FRET%3A+a+quantitative+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRET or no FRET: a quantitative comparison.</a> Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).</li>
<li>Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+human+membrane+proteome%3A+a+majority+of+the+human+membrane+proteins+can+be+classified+according+to+function+and+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin.</a> BMC Biology. 7, 50(2009).</li>
<li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+drug+targets+are+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">How many drug targets are there.</a> Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).</li>
<li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Overduin, M., Esmaili, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memtein%3A+The+fundamental+unit+of+membrane-protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).</li>
<li>Qiu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+activity+of+lipid+bilayer+within+a+membrane-protein+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).</li>
<li>Knowles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+solubilized+intact+in+lipid+containing+nanoparticles+bounded+by+styrene+maleic+acid+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).</li>
<li>Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+Lipid+Nanodisk+Formation+by+Styrene-Maleic+Acid+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers.</a> Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).</li>
<li>Parmar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+SMALP+platform+to+determine+a+sub-nm+single+particle+cryo-EM+membrane+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+and+Biophysica+Acta+Biomembrames%22%5BJournal%5D)">Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure.</a> Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).</li>
<li>Yu, L., Lu, W., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrB+trimer+stability+and+efflux+activity%2C+insight+from+mutagenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies.</a> PLoS One. 6 (12), 28390(2011).</li>
<li>Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy+as+demonstrated+by+measuring+the+activation+of+the+serine%2Fthreonine+kinase+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt.</a> Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).</li>
<li>Ma, L., Yang, F., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).</li>
<li>Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+electronic+energy+transfer+in+the+determination+of+lipid+nanodomain+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).</li>
<li>Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal%2Fnoise+analysis+of+FRET-based+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Signal/noise analysis of FRET-based sensors.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+oligomeric+states+of+a+wild+type+and+mutant+trimeric+inner+membrane+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter.</a> Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).</li>
<li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+on+Negative+Stain+Electron+Microscopy+Methods%3A+Tools+for+Tackling+Challenging+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).</li>
<li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li>
<li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLebon%2C+G+%22Structure+and+Function+of+GPCRs%22">Structure and Function of GPCRs</a>. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).</li>
<li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+negative+staining%3A+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).</li>
<li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li>
<li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li>
<li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene%2FMaleic+Acid+Copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li>
</ol>

י.ג. רשום כממציא מערכת הפולימר הפעילה של הממברנה NCMNP5-2 ו- NCMN.

אינטראקציות חלבון חלבון חשובות לשלמות המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה. גישות רבות פותחו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון. בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני ממברנה ו- PPIs שלהם קשה יותר ללמוד בשל המאפיינים המהותיים הייחודיים של חלבוני ממברנה. קושי זה נובע בעיקר מהדרישה של חלבוני ממברנה להיות מוטבע בסביבה bilayer השומנים המקומי עבור יציבות מבנית ופונקציונליות. זה הופך להיות בעייתי כי על מנת לקבוע מבנים ברזולוציה גבוהה של החלבונים הם חייבים להיות מופקים מן קרום התא. FRET כבר טכנולוגיה פופולרית לחקור אינטראקציות חלבון חלבון על...

אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי1. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.
יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים5. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.
חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד11. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)12 בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)13 שדווחה בעבר.
SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH14. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Åרזולוציה 12,15. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.
טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli12. ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג'ל כחול יליד16. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי16. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20.
לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs12. באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs12. בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי21. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.
כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% אקרילאמיד/BIS SOL (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (מאגר טעינה)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית Glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 אבקת כתמי חלבון</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol) (> 99% טהור) ללא פרוטאז</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Goldbio</td><td></td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>עדיין לא זמין מסחרית</td><td>הגש בקשה להשגה למחבר</td><td></td>המקביל</tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>Cray Valley</td><td>הגש בקשה להשגה למחבר</td><td></td> המקביל</tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth Media</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>אמבינטר</td><td>Amb22348393</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>בקמן קולטר</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>בקמן קולטר</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים פחמן (10 ננומטר)</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>CF300-Cu-TH</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות מומנט</td><td>אברבך</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiמערכת ניקוי פריקת זוהר</td><td>זוהר טד פלה</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות טחינה בטוחה של Potter-Elvehjem Wheaton</td><td></td><td>358013</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac ספק כוח בסיסי</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Razel R99-E משאבת</td> <td>מזרק במהירות משתנהRazel Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 להגדיל 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti רוטור זווית קבועה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים כלליים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 מ"ל Amicon Ultra-4 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA טהור 25 L1 FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 עמודה מ"ל</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24a</td><td>EMD Biosciences</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

אינטראקציות חלבון-חלבון במערכות קרום התא ממלאות תפקידים מכריעים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, החל מאינטראקציות בין תא לתא ועד העברת אותות; החל מחישה של אותות סביבתיים ועד לתגובה ביולוגית; מוויסות מטבולי לבקרה התפתחותית. מידע מבני מדויק של אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים של קומפלקסים של חלבוני ממברנה ולעיצוב מולקולות ספציפיות מאוד לווסת חלבונים אלה. גישות רבות in vivo ו- in vitro פותחו לגילוי וניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון. ביניהם הגישה הביולוגית המבנית היא ייחודית בכך שהיא יכולה לספק מידע מבני ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית. עם זאת, הביולוגיה המבנית של חלבון הממברנה הנוכחי עדיין מוגבלת במידה רבה לשיטות מבוססות חומר ניקוי. החיסרון העיקרי של שיטות מבוססות חומר ניקוי הוא שהם לעתים קרובות לנתק או denature קומפלקסים חלבון קרום פעם הסביבה המקומית שלהם bilayer השומנים מוסר על ידי מולקולות דטרגנט. פיתחנו מערכת ננו-חלקיקים של קרום התא המקומי לביולוגיה מבנית של חלבון קרום. כאן, אנו מדגימים את השימוש במערכת זו בניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא עם מקרה מבחן של המצב האוליגומרי של AcrB.

באמצעות ההליכים המוצגים כאן, דגימות של סוג פראי E. coli AcrB ו E. coli מוטציה AcrB-P223G טוהרו. הדגימות נספגו אז לרשתות מיקרוסקופיות של אלקטרון כתם שלילי פחמן ומוכתמות באמצעות אורניל אצטט בשיטת הכתםהצדדית 22. תמונות כתם שליליות נאספו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תמונת הכתם השלילית של דגימת סוג הבר AcrB המטוהרת באמצעות DDM חושפת פתרון הומוגני של חלקיקים חד-ממדיים כאשר החלבון מציג מבנה רבעוני שלישוני מוגדר היטב (איור 1A). מבנים טרימריים אלה תואמי...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

פרוטוקול זה יעזור לחוקרים לקבוע בצורה מדויקת יותר את המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני הממברנה על ידי שימוש במערכת ננו-חלקיקי ממברנת התא המקומית בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת נתונים מבניים מדויקים של חלבוני ממברנה בסביבה דמוית קרום תא מקומי, וניתן להשתמש בה לקביעת מבנה עתידי ברזולוציה גבוהה. מי שידגים את ההליך יהיה קייל קרוק, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.כדי להכין ננו-חלקיקים מקוריים של קרום התא, השעו מחדש גרם אחד של גלולת הממברנה המעניינת ב-10 מיליליטר של NCMN Buffer A.השתמש בהומוגנייזר זכוכית Dounce כדי להומוגניזציה של דגימת קרום התא המושעה ב-20 מעלות צלזיוס ולהעביר את הדגימה התלויה לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר. הוסף תמיסת מלאי פולימר פעיל ממברנה ומאגר NCMN A נוסף לדגימה לריכוז סופי של 2.5% פולימר פעיל ממברנה ונער את התמיסה למשך שעתיים ב-20 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה.במהלך הצנטריפוגה, יש לאזן עמודת NTA ניקל של חמישה מיליליטר עם 25 מיליליטר של מאגר NCMN A.At סוף הצנטריפוגה, להעביר את הסופרנטנט על העמוד ולהשתמש במשאבת מזרק המוגדרת לקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה כדי להעמיס את הסופרנטנט על העמוד ב-20 מעלות צלזיוס. שטפו את קווי מכונת הכרומטוגרפיה הנוזלית של החלבון המהיר עם מספיק מאגר NCMN B כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולחבר את העמודה למכונת הכרומטוגרפיה. שטפו את העמודה עם 30 מיליליטר של NCMN Buffer B בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואספו את הזרימה.שטפו את העמוד עם 30 מיליליטר של NCMN Buffer C בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואספו את הזרימה. יש לסלק את החלבון עם 20 מיליליטר של NCMN Buffer D בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה ולהשתמש בקולט שברים כדי לאסוף שברים של מיליליטר אחד מהדגימה, ולאחר מכן לאחסן את דגימות החלבון בארבע מעלות צלזיוס באמצעות SDS-PAGE כדי לבדוק את הדגימות התואמות את הפסגות שנצפו בגרף פליטת הכרומטוגרפיה הנוזלית המהירה של החלבון. להכנת רשתות כתמים שליליות, עטפו שקופית זכוכית עם נייר סינון כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה והניחו את הרשתות שישמשו להכנת הדגימה על השקופית.הנח את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים לתוך תא של מפרק זוהר בין שתי האלקטרודות והחזר את מכסה הזכוכית למקומו וודא שהמכסה מרוכז ואטום היטב. הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על ידי הפלזמה נראה. בסיום פעולת המכונה, המתן עד שהתא יגיע ללחץ אטמוספרי לפני הסרת מכסה הזכוכית והנחת המגלשה על הספסל.התאם את ריכוז דגימות החלבון המטוהר לכ-0.1 מיליגרם למיליליטר וטען 3.5 מיקרוליטר מדגימת החלבון על רשת הפחמן בעובי 10 ננומטר. לאחר דקה אחת, השתמש בפיסת נייר סינון כדי להסיר את הנוזל ממשטח רשת המיקרוסקופ האלקטרונים ולשטוף את משטח הרשת שלוש פעמים עם טיפת מים אחת של שלושה מיקרוליטר לכל שטיפה. לאחר שטיפת המים האחרונה, שטפו את משטח הרשת פעמיים נוספות עם שלוש טיפות מיקרוליטר של אורניום אצטט טרי מסונן, 2% בכל שטיפה.לאחר שטיפת האורניום אצטט האחרונה, יש לצבוע את הרשת בטיפה של שלושה מיקרוליטר של אורניום אצטט טרי מסונן 2% למשך דקה אחת. בתום הדגירה, השתמש בפיסת נייר סינון חדשה כדי להסיר את הטיפה וייבש את הרשת באוויר למשך דקה אחת לפחות לפני אחסון הרשת בקופסת רשת לשימוש מאוחר יותר. כאן ניתן לצפות בתמונות כתמים שליליים המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כפי שהודגם.תמונת הכתם השלילי עבור דגימת חלבון B של תעלת עמידות אקרפלבין מסוג פרא מטוהרת עם חומר ניקוי חושפת תמיסה הומוגנית של חלקיקים חד-מפוזרים כאשר החלבון מציג מבנה רבעוני טרימרי מוגדר היטב. מבנים טרימריים אלה תואמים את כרומטוגרמה של אי הכללת הגודל שנצפתה לאחר הטיהור. לשם השוואה, בתמונת הכתם השלילי עבור המוטציה P223G המטוהרת גם היא עם חומר ניקוי, ניתן להבחין בתמיסה הטרוגנית של ננו-חלקיקים רב-מפוזרים עם נטייה לצבירה אך ללא טרימרים מקומיים הניתנים לצפייה.תוצאות אלו נתמכות גם על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. תוצאות דומות נצפו עבור חלבונים מסוג בר ומוטנטיים לאחר טיהור עם NCMNP11 הפולימר הפעיל של הממברנה. השימוש בפולימר NCMNP52 מקל על יצירת ננו-חלקיקים מקוריים של קרום התא בגדלים גדולים בהרבה, ומאפשר לדמות טרימרים מרובים של חלבון B של תעלות עמידות לאקרפלבין בחלקיק קרום תא מקומי יחיד.בדגימה המוטנטית, לעומת זאת, לא נצפו חלקיקי טרימר, גם כאשר מסתכלים על הטלאים הדו-שכבתיים הגדולים של קרום התא הטבעי. ניתוח SDS-PAGE של דגימות החלבון המטוהר מאשר את נוכחותו של עמידות לאקרפלבין B בכל הדגימות עם טוהר של יותר מ-95% במשקל המולקולרי החזוי של החלבון. כאשר משנים פרוטוקול זה עבור חלבונים אחרים, חשוב לקבוע באופן ניסיוני את הכמות המתאימה של שבר הממברנה ואת האורך, הזמן והטמפרטורה לתהליך המסיס.אם התמונות של הדגימה שלך חושפות תמיסה הומוגנית של חלקיקים חד-מפוזרים עם יחידות מבניות מוגדרות היטב, ניתן להשתמש בדגימה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ אלקטרונים קריו.

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

מחקר זה מתאר את ההליך לשיקום חלבון הממברנה הרגיש לחומצה ב-TWIK, ערוץ K+ 2 (משימה 2) לננו-דיסקים. ההרכבה המוצלחת אושרה על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרון חד-חלקיק, שהניב ממוצעים דו-ממדיים מוגדרים היטב.

טכניקה לייצוב חלבוני ממברנה בננו-דיסקים

למד לקבוע את מצב האוליגומר המקורי של חלבוני קרום באמצעות חלקיקי קרום תא מקוריים ומיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו מספקת נתונים מבניים מדויקים בסביבה דומה לקרום תא טבעי.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

גלה סרטונים נוספים