מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

פרוטוקול זה יעזור לחוקרים לקבוע בצורה מדויקת יותר את המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני הממברנה על ידי שימוש במערכת ננו-חלקיקי ממברנת התא המקומית בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים. היתרון של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת נתונים מבניים מדויקים של חלבוני ממברנה בסביבה דמוית קרום תא מקומי, וניתן להשתמש בה לקביעת מבנה עתידי ברזולוציה גבוהה. מי שידגים את ההליך יהיה קייל קרוק, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.

כדי להכין ננו-חלקיקים מקוריים של קרום התא, השעו מחדש גרם אחד של גלולת הממברנה המעניינת ב-10 מיליליטר של NCMN Buffer A.השתמש בהומוגנייזר זכוכית Dounce כדי להומוגניזציה של דגימת קרום התא המושעה ב-20 מעלות צלזיוס ולהעביר את הדגימה התלויה לצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר. הוסף תמיסת מלאי פולימר פעיל ממברנה ומאגר NCMN A נוסף לדגימה לריכוז סופי של 2.5% פולימר פעיל ממברנה ונער את התמיסה למשך שעתיים ב-20 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה.

במהלך הצנטריפוגה, יש לאזן עמודת NTA ניקל של חמישה מיליליטר עם 25 מיליליטר של מאגר NCMN A.At סוף הצנטריפוגה, להעביר את הסופרנטנט על העמוד ולהשתמש במשאבת מזרק המוגדרת לקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה כדי להעמיס את הסופרנטנט על העמוד ב-20 מעלות צלזיוס. שטפו את קווי מכונת הכרומטוגרפיה הנוזלית של החלבון המהיר עם מספיק מאגר NCMN B כדי לשטוף לחלוטין את המערכת ולחבר את העמודה למכונת הכרומטוגרפיה. שטפו את העמודה עם 30 מיליליטר של NCMN Buffer B בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואספו את הזרימה.

שטפו את העמוד עם 30 מיליליטר של NCMN Buffer C בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואספו את הזרימה. יש לסלק את החלבון עם 20 מיליליטר של NCMN Buffer D בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה ולהשתמש בקולט שברים כדי לאסוף שברים של מיליליטר אחד מהדגימה, ולאחר מכן לאחסן את דגימות החלבון בארבע מעלות צלזיוס באמצעות SDS-PAGE כדי לבדוק את הדגימות התואמות את הפסגות שנצפו בגרף פליטת הכרומטוגרפיה הנוזלית המהירה של החלבון. להכנת רשתות כתמים שליליות, עטפו שקופית זכוכית עם נייר סינון כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה והניחו את הרשתות שישמשו להכנת הדגימה על השקופית.

הנח את שקופית הזכוכית עם רשתות מיקרוסקופ האלקטרונים לתוך תא של מפרק זוהר בין שתי האלקטרודות והחזר את מכסה הזכוכית למקומו וודא שהמכסה מרוכז ואטום היטב. הפעל את מכונת פריקת הזוהר וודא שהאור הסגול שנוצר על ידי הפלזמה נראה. בסיום פעולת המכונה, המתן עד שהתא יגיע ללחץ אטמוספרי לפני הסרת מכסה הזכוכית והנחת המגלשה על הספסל.

התאם את ריכוז דגימות החלבון המטוהר לכ-0.1 מיליגרם למיליליטר וטען 3.5 מיקרוליטר מדגימת החלבון על רשת הפחמן בעובי 10 ננומטר. לאחר דקה אחת, השתמש בפיסת נייר סינון כדי להסיר את הנוזל ממשטח רשת המיקרוסקופ האלקטרונים ולשטוף את משטח הרשת שלוש פעמים עם טיפת מים אחת של שלושה מיקרוליטר לכל שטיפה. לאחר שטיפת המים האחרונה, שטפו את משטח הרשת פעמיים נוספות עם שלוש טיפות מיקרוליטר של אורניום אצטט טרי מסונן, 2% בכל שטיפה.

לאחר שטיפת האורניום אצטט האחרונה, יש לצבוע את הרשת בטיפה של שלושה מיקרוליטר של אורניום אצטט טרי מסונן 2% למשך דקה אחת. בתום הדגירה, השתמש בפיסת נייר סינון חדשה כדי להסיר את הטיפה וייבש את הרשת באוויר למשך דקה אחת לפחות לפני אחסון הרשת בקופסת רשת לשימוש מאוחר יותר. כאן ניתן לצפות בתמונות כתמים שליליים המתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כפי שהודגם.

תמונת הכתם השלילי עבור דגימת חלבון B של תעלת עמידות אקרפלבין מסוג פרא מטוהרת עם חומר ניקוי חושפת תמיסה הומוגנית של חלקיקים חד-מפוזרים כאשר החלבון מציג מבנה רבעוני טרימרי מוגדר היטב. מבנים טרימריים אלה תואמים את כרומטוגרמה של אי הכללת הגודל שנצפתה לאחר הטיהור. לשם השוואה, בתמונת הכתם השלילי עבור המוטציה P223G המטוהרת גם היא עם חומר ניקוי, ניתן להבחין בתמיסה הטרוגנית של ננו-חלקיקים רב-מפוזרים עם נטייה לצבירה אך ללא טרימרים מקומיים הניתנים לצפייה.

תוצאות אלו נתמכות גם על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. תוצאות דומות נצפו עבור חלבונים מסוג בר ומוטנטיים לאחר טיהור עם NCMNP11 הפולימר הפעיל של הממברנה. השימוש בפולימר NCMNP52 מקל על יצירת ננו-חלקיקים מקוריים של קרום התא בגדלים גדולים בהרבה, ומאפשר לדמות טרימרים מרובים של חלבון B של תעלות עמידות לאקרפלבין בחלקיק קרום תא מקומי יחיד.

בדגימה המוטנטית, לעומת זאת, לא נצפו חלקיקי טרימר, גם כאשר מסתכלים על הטלאים הדו-שכבתיים הגדולים של קרום התא הטבעי. ניתוח SDS-PAGE של דגימות החלבון המטוהר מאשר את נוכחותו של עמידות לאקרפלבין B בכל הדגימות עם טוהר של יותר מ-95% במשקל המולקולרי החזוי של החלבון. כאשר משנים פרוטוקול זה עבור חלבונים אחרים, חשוב לקבוע באופן ניסיוני את הכמות המתאימה של שבר הממברנה ואת האורך, הזמן והטמפרטורה לתהליך המסיס.

אם התמונות של הדגימה שלך חושפות תמיסה הומוגנית של חלקיקים חד-מפוזרים עם יחידות מבניות מוגדרות היטב, ניתן להשתמש בדגימה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ אלקטרונים קריו.