הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

פרוטוקולים להתמיינות של תאי גזע לתאי כליה פונקציונליים נותרו חמקמקים. שיטה זו מייצרת פודוציטים בוגרים עם ספציפיות ויעילות, ומספקת כלים חדשים לחקר מנגנוני מחלת כליות. שיטה זו משתמשת במדיום תרבית תאים וחלבוני מטריצה חוץ-תאיים עם הרכב מוגדר כימית כדי לייצר פודוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים עם טוהר גבוה ללא שימוש בבחירת תת-אוכלוסייה או מניפולציה גנטית.

ישנן אפשרויות טיפוליות מוגבלות לחולים עם מחלת כליות. לשיטה זו יש השלכות על מידול והבנת מנגנוני מחלה, מה שיכול להקל על פיתוח סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים. כדי להקים תרבית iPSC אנושית ללא מזין, שאפו את התמיסה השיורית של מטריצת ממברנת הבסיס 1 מלוחות מצופים מראש ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם מיליליטר עד שניים לבאר של מדיום בסיסי מחומם.

שאפו את מדיום תרבית התאים המושקעים מתרבית iPSC אנושית ושטפו את התאים שלוש פעמים במדיום מחומם. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים חמה לכל באר לדגירה של דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר אישור קצוות מושבת התאים המעוגלים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמות, שאפו במהירות את תמיסת ניתוק התאים ושטפו בעדינות את התאים במדיום תרבית תאים.

הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבית iPSC אנושי לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם והשתמש במרים תאים כדי לגרד את המושבות. פיפטה בעדינות את תרחיף התאים כדי לעקור תאים דבוקים באופן רופף ושטוף את הצלחת היטב כדי להבטיח קציר של כל התאים. העבירו 500 מיקרוליטר של תאים לכל באר של מטריצת קרום מרתף חדשה 1 צלחת מצופה של שש בארות המכילה שני מיליליטר של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם לכל באר והזיזו את הצלחת בצורה שמונה כדי לפזר באופן שווה את מושבות התאים בתוך הבארות.

מניחים את הצלחת בחממת תרבית התאים, מרעננים את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים לכ-70% מפגש. במידת הצורך, מגרדים באופן אספטי אזורי התמיינות לפני שאיבת הסופרנטנט מהבארות. לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים, נתק את התאים כפי שהודגם ומשוך את תרחיפי התאים המתקבלים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר ערבוב על ידי פיפטינג, הביאו את הנפח הסופי בצינור ל -15 מיליליטר עם מדיום חם ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה במדיום טרי לצנטריפוגה שנייה והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה מזודרם לספירה. לאחר הספירה, השעו מחדש את התאים לאחד מ-10 עד התאים החמישיים למיליליטר של ריכוז מדיום אינדוקציה מזודרם ושאבו את תמיסת המטריצה החוץ-תאית ממטריצת קרום המרתף 2 לוחות מצופים.

שטפו את הצלחות פעמיים במדיום חם וערבבו את תרחיף תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרה על ידי בני אדם עם פיפטינג עדין. הוסף מיליליטר אחד של תאים לכל באר של מטריצת קרום המרתף 2 צלחות מצופות של 12 בארות ונער בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את התאים בצורה אחידה יותר. לאחר מכן הכניסו את הצלחת לחממת תרבית התאים.

בימים 2-15 של ההתמיינות, החלף את מדיום האינדוקציה של המזודרם במיליליטר אחד של מדיום אינדוקציה מזודרם ביניים לכל באר. אם נצפתה צמיחה משמעותית של תאים ודלדול מהיר של חומרים מזינים כפי שמצוין על ידי הצהבה של המדיום, ניתן להגדיל את נפח מדיום ההתמיינות הבינוני של המזודרם ל -1.3 מיליליטר לבאר. ביום ה-16 לתרבית, שטפו את תאי המזודרם הבינוניים במדיום חם ודגרו על התאים עם 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין EDTA לבאר למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כאשר התאים מתחילים להתנתק, מגרדים את התאים בעזרת מרים תאים ומערבבים בעדינות את התאים על ידי פיפטינג. עצור את התגובה עם כשני מיליליטר של תמיסת נטרול טריפסין לבאר והעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הביאו את הנפח עד 50 מיליליטר עם מדיום ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה במדיום אינדוקציה פודוציטים בפעם אחת מ-10 עד התאים החמישיים למיליליטר של ריכוז בינוני והוסיפו את התאים למטריצת קרום המרתף 2 צלחות מצופות. לאחר מכן נער בעדינות את הצלחת כדי לעזור לפזר את התאים בצורה אחידה יותר ולהניח את התאים באינקובטור עד חמישה ימים. באמצעות אסטרטגיית התרבית כפי שהודגמה, ניתן להתמיין תחילה את תאי הגזע לתאי מזודרם המבטאים ברכיוריה, ולאחר מכן להתמיין לתאי מזודרם ביניים חיוביים PAX2, ובסופו של דבר פודוציטים גלומרולרים בכליות בוגרים.

פודוציטים שמקורם בתאי גזע צביעה חיוביים ל-WT1, כמו גם לסמן זיהוי השושלת נפרין. באופן מעניין, הלוקליזציה התת-תאית של נפרין היא בעיקר בתוך תהליכי כף הרגל של הפודוציטים וציטופלזמה של התא, העולה בקנה אחד עם פנוטיפ פודוציטים בוגר. תאים שנזרעו בצפיפות החורגת משמעותית מהצפיפות המומלצת של אחד כפול 10 עד התאים החמישיים לבאר של צלחת של 12 בארות גורמים לאשכולות גדולים של תאים שחסרים את הפנוטיפ המורפולוגי הצפוי של פודוציטים בוגרים בציר הזמן הסטנדרטי של הפרוטוקול.

זריעה בצפיפות המומלצת בפרוטוקול זה, לעומת זאת, מביאה לתרביות של תאים עם המורפולוגיה הרצויה. אנו ממליצים להשתמש בחלבון קרום הבסיס המתאים לניתוק תאים ושמירה על צפיפות זריעת התאים הנכונה לאינדוקציה של מזודרם ופודוציטים. ניתן לשלב שיטת בידול פודוציטים זו עם איברים על שבבים, מערכות מיקרופלואידיות או טכנולוגיות הדפסה ביולוגית תלת מימדית כדי לפתח מודלים פונקציונליים של הכליה האנושית לסינון תרופות ובדיקת נפרוטוקסיות.

היעדר מודלים מתאימים של תרביות תאים עיכב את ההתקדמות בהבנת מנגנוני מחלת כליות. פרוטוקול זה מספק לחוקרים מקור בלתי נדלה של פודוציטים שמקורם בחולה למידול מחלות.