בדיקות וניתוח ביוטריבולוגי של סחוס ארטיקולר מחליק נגד מתכת עבור שתלים

הפרוטוקול שלנו מאפשר לבדוק את ההזזה של מתכת עבור שתלים אורתופדיים נגד סחוס פרקי ובכך לחקור את ההשפעות של שתלים מוקדיים או hemiarthroplasty על הפעילות הביוסינתטית של כונדראציטים מסוימים היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מספקת תובנה מקיפה הן את המאפיינים הטריובולוגיים ואת ההשפעות הביולוגיות של טעינה מכנית זיווג הסחוס. טכניקה זו עשויה להחמיא לממצאים הקליניים לאחר ניתוחים כמו השתלת שתלים מתכתיים מוקדיים לטיפול בפגם אוסטאוכונדרלי של הברך או hemiarthroplasty של הירך. הדגמת ההליך תהיה כריסטופר באוור פוסט-דוק מהמעבדה שלי כאן באוניברסיטת הדנובה.

השתמשו בטריבומטר הדדי מסחרי עם צילינדר בתצורת לוח, יכולות טעינה אנכית ומהירות טעינה מתכווננת. בנוסף, נדרש תא נוזלי כדי לבצע את הבדיקות בתספורת סיכה. תקן את הצילינדרים האוסטיאוכונדראליים במחזיק הדגימה התחתון עם הסימון המיושר עם כיוון ההזזה.

התחל בקביעת לחץ המגע בכרום מוליבסנום קובלט על מערכת הסחוס באמצעות סרט מדידת לחץ. מקם את סרט מדידת הלחץ בממשק, והחל עומס סטטי למשך 30 שניות כדי לקבוע לחץ מגע ראשוני, גודל מגע וצורה. הר את צילינדרים כרום מוליבדום קובלט על תא העומס העליון.

מוסיפים את פתרון הבדיקה לתא הנוזלי כדי להטביע את הצילינדר האוסטיאוכונדראלי ולכסות את ממשק ההזזה של סחוס המתכת. הגדר פרמטרי בדיקה כגון מתוארים במשיטת כוח רגילה ומהירות הזזה אשר יישמרו לאורך כל הבדיקה. התחל החלקה הדדית של גליל המתכת נגד הסחוס המותק שקוע בתספור הסיכה.

ניטור מקדם החיכוך לאורך כל הניסוי, לסיים את הניסוי. לאחר תקופת בדיקת הרצון להסיר את התקע osteochondral ממחזיק המדגם לשטוף אותו עם PBS ולאחסן אותו בינוני עד ניתוח ביולוגי נוסף. יש לשמור על דגימות הבקרה ופתרון הבדיקות בטמפרטורת החדר למשך הבדיקה ולנתח אותן יחד עם הדגימות שנחשפו לטעינה מכנית.

מניחים, צלחת 24 באר בקנה מידה ואפס אותו. שוטפים את התקע האוסטיאוכונדרל עם PBS ומ מניחים אותו בצלחת פטרי. לאחר מכן השתמש אזמל לחתוך את הסחוס מן השתל בחתיכה אחת חציית הסחוס בשני חלקים שווים, כך אזור המגע מחולק באותה מידה על שתי חתיכות הסחוס טחון חצי אחד לחתיכות קוביות מילימטר בערך.

השתמש במחצית השנייה לניתוח ביטוי גנים להעביר את הסחוס טחון לתוך באר אחת של מוכן ב 24 צלחת היטב ולקבוע את משקל הרקמה לחזור על תהליך זה עבור כל מדגם ולהוסיף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל באר של הצלחת. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פתרון XTT לכל באר ומערבבים ואז דוגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך ארבע שעות לאחר הדגירה מסירים את העל-טבעי ומעבירים אותו לצינור של חמישה מיליליטר. לחלץ את המוצר tetrazolium על ידי הוספת 500 microliters של DMSO לרקמת הסחוס בכל באר ולהחיל תסיסה רציפה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, להסיר את פתרון DMSO ולמשוך אותו עם פתרון XTT שנאסף בעבר.

מעבירים 100 מיקרוליטרים של כל דגימה בטריליקטים לצלחת של 96 בארות. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את הספיגה באורך גל של 492 ננומטר, ואורך גל התייחסות של 690 ננומטר. כדי לבודד את RNA טחון המחצית השנייה של רקמת הסחוס המתקבלת תקע osteochondral לחתיכות קטנות להעביר את הרקמה לצינור המכיל חרוזים קרמיים 300 microliters של חיץ מורשה.

עם 1%beta mercaptoethanol להשתמש lysate מסחרי כדי הומוגניזציה הרקמה החלת 6, 500 סל"ד במשך 20 שניות ארבע פעמים עם שלב קירור 20 דקות לאחר כל ריצה. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של חלבון K ו-580 מיקרוליטרים של מים חופשיים של RNAs לכל דגימה, והדגירה אותם ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. צנטריפוגה הדגימות במשך שלוש דקות ב 10, 000 פעמים G ולהעביר את העל טבעי ל 1.5 צינורות מיליליטר.

מוסיפים 0.5 כרכים של 90%אתנול לכל צינור ומערבבים ואז מעבירים 700 מיקרוליטרים של המדגם לעמודת איגוד RNA בצינור איסוף של שני מיליליטר וצנטריפוגה ב-8,000 פעמים G למשך 15 שניות. השלך את הזרימה דרך ולחזור על שלב הצנטריפוגה לשאר lysate. הוסף עמודה 350 מיקרוליטרים של RW של מאגר.

צנטריפוגה זה ב 8, 000 פעמים G במשך 15 שניות ולהשליך את הזרימה דרך. מערבבים 10 מיקרוליטרים של פתרון מלאי DNA ו-70 מיקרוליטרים של RDD של חיץ. מוסיפים את הפתרון לממברנה לטיהור RNA וגוררים אותו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ואז מוסיפים 350 מיקרוליטרים של מאגר RW אחד לעמודה.

צנטריפוגה זה ב 8, 000 פעמים G במשך 15 שניות ולזרוק את הזרימה דרך להוסיף 500 microliters של RPE חיץ לעמודת טיהור RNA וצנטריפוגה אותו ב 8, 000 פעמים G במשך 15 שניות להשליך את הזרימה דרך ולהוסיף עוד 500 microliters של RPE חיץ לעמודה טיהור RNA ואז צנטריפוגה אותו ב 8, 000 פעמים G במשך שתי דקות למקם את העמודה בצינור אוסף חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 30 microliters של RNAs צנטריפוגה מים חינם הצינור ב 8, 000 פעמים G לדקה אחת, כדי לדגום את cDNA מסונתז RNA באמצעות ערכת מסחרי להפשיר ולערבב את כל האזורים, להוסיף את דגימת RNA ולבצע את התגובה ואת האופניים התרמיים כמתואר בכתב היד טקסט. הוסף תשעה microliters של RTQ PCR לערבב הראשי, ומיקרוליטר אחד של cDNA לכל באר של צלחת 96 גם עם כל מדגם ב triplicates זוהר צלחת PCR עם שמן תקרה צנטריפוגה זה 877 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לבצע RTQ PCR ו רוכב מחזור דיוק תרמי. לפי הוראות כתב היד.

לפני בדיקת אזור המגע ולחץ המגע בממשק הסחוס ממתכת יש לאשר באמצעות סרט מדידת לחץ. לאחר מכן ניתן לאשר את מצב הטעינה הפיזיולוגי על ידי השוואת ההטבעה המתקבלת עם מסקנת הפניה למגע מוגדר מקדם חיכוך נמוך יכול להישמר לפחות שעה אחת עם אזור מגע נודד. הרכב ומבנה מטריצה חוץ תאית ניתן לקבוע עם זעפרן וכתמי O.

עוצמת הזעפרן וכתמי O פרופורציונלית לתוכן הפרוטוגליקני. התוכן proteoglycan משתנה על פני השטח של כלי הדם אבל צריך להיות אחיד לאורך כל סעיף הרקמה בדגימות בסיסיות, להראות מיצוי של glycosaminoglycans אשר ניתן לנטרל על ידי טעינה מכנית. פעילות מטבולית של כונדריקיטים פרקי שור אינה תלויה באתר הקציר אך מראה עלייה עם טעינה מכנית.

רמות ביטוי הגנים של גנים ספציפיים לסחוס עלו עם תנאי טעינה פיזיולוגיים. בעוד גנים קטבוליים הם up-regulated עם אזור מגע נייח. בעקבות הליך זה, ניתוח נוסף יכול להתבצע כולל קביעת מוצרי אינטרנט סחוס וניתוח של משטח articular באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה, יתר על כן אנו מנסים לייעל שימון של סחוס פרקים זיווגים טריבולוגיים שונים.