אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

אוטומציה של מיקרוסקופ כוח אטומי היא חידוש מרכזי באבולוציה של הטכנולוגיה כלפי יישומים ביו-רפואיים. זה גם פותח גישה לחקירה של המאפיינים הביומכניים של אוכלוסיות תאים. השיטה שלנו מאפשרת להקליט מדידות AFM עבור 1, 000 תא בארבע שעות, לעומת השיטות הרגילות, אשר לוקח ארבע שעות כדי למדוד 10 תאים, זה באמת רווח משמעותי של זמן.

אם אוטומציה היא תנאי מוקדם להבאת טכנולוגיה זו למעבדות בבתי חולים, פרוטוקול הוכחת רעיון זה מרמז על פוטנציאל השימוש שלה בפיתוח אסטרטגיות אבחון רפואיות ספציפיות. פרוטוקול זה משתמש בגזע PDMS רב-תכליתי שניתן למלא במיקרואורגניזמים שונים ומאפשר לחקור מערכות שונות. כדי להכין את חותמת PDMS, לערבב 55 גרם של פתרון PDMS טרום פולימר ביחס מסה 10 עד 1 PDMs, אוליגומרים, וסוכן ריפוי ו degas הפתרון וכתוצאה מכך תחת ואקום בבת אחת 10 כדי שלילי אחד עד פעם אחת 10 כדי שלילי שני ברים במשך חמש עד 10 דקות.

כאשר כל בועות המלכודות הוסרו, יוצקים 20 גרם של הפתרון degassed על תבנית מאסטר סיליקון לעובי של שניים עד שלושה מילימטרים ו degas שוב. לאחר שכל הבועות הוסרו, מרושתים את ה- PDMS ב- 80 מעלות צלזיוס למשך שעה ומשתמשים באזמל כדי לחתוך את החותמת המובנית של מיקרו PDMS במקביל למעלימי המיקרו-מבנה הגלויים. לאחר מכן לקלף את החותמת מתבנית הבסיס סיליקון ומניחים את אתר מבנה מיקרו בולים על שקופית זכוכית עם מבני מיקרו מיושר עם הצד של השקופית.

כדי להכין את התאים עבור המכשיר, צנטריפוגה 600 microliters של השעיית התא של עניין ולהוסיף 200 microliters של supernatant על החותמת. דגה את supernatant תחת ואקום במשך כ 40 דקות. כאשר כל הבועות הוסרו, להחליף את supernatant מפני השטח PDMS עם 200 microliters של פתרון התא לשימוש חוזר עבור דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לטעון את התאים לתוך מבני מיקרו של החותמת, השתמש שקופית זכוכית מוחזק בזווית של 30 עד 50 מעלות כדי להפיץ את התאים על פני החותמת בשני הכיוונים, כמה פעמים לפי הצורך. כאשר קצב מילוי גבוה של microstructures הושגה, להשתמש פיפטה כדי להסיר את ההשעיה התא לשטוף את שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר אצטט לכל לשטוף כדי להסיר את כל התאים קשורים. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בזרימת חנקן כדי לייבש את החלק האחורי של המדגם ומניחים את החותמת בצלחת פטרי.

לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של חיץ אצטט טרי למנה. למיקרוסקופיה של הכוח האטומי של התאים, הניחו את המנה על שלב המיקרוסקופ של הכוח האטומי ומרכזו את הבמה באפס עד אפס. כאשר הבמה כבר מרוכזת, להעביר את המנה לתוך מחזיק צלחת פטרי מיקרוסקופ וליישר את קצה החותמת, כך שהוא ניצב לציר y של מחזיק צלחת פטרי.

לאחר מכן הניחו את ראש כוח המיקרוסקופ האטומי על הבמה, תוך דאגה לכך שמנועי הצעד מורחבים מספיק כדי למנוע את הקצה המתרסק על החותמת. להדמיה, השתמש בידיות המיקרוסקופ כדי למרכז את קצה המיקרוסקופ של הכוח האטומי מעל הפינה השמאלית של בארות מיקרומטר 4.5 על 4.5 בריבוע ובחר את מצב מיפוי הכוח בתוכנת המיקרוסקופ. כדי להגדיר מפת כוח של 64 על 64 על פני אזור של 100 על 100 מיקרומטר, הגדר את נקודת ההגדרה היחסית לשלושה עד חמישה ננו ניוטון, אורך Z לארבעה מיקרומטרים, תנועת Z למשך קבוע, זמן ההארכה ל- 0.01 שניות, השהיית ההרחבה לאפס, השהיית הנסיגה לאפס, מצב ההשהיה לכוח מתמיד שיעור הדגימה ל-2048 הרץ.

בטל את הסימון של לולאה סגורה Z ובדוק את התמונה המרובעת. הגדר את הגישה המהירה ל- 100 מיקרומטר, את הציר האיטי ל- 100 מיקרומטר, את היסט X לאפס מיקרומטר, את היסט ה- Y לאפס מיקרומטר, את זווית הרשת לאפס מעלות, את הפיקסלים ל- 64 על 64 ואת יחס הפיקסלים לאחד לאחד. בשלב הבא פתח את תוכנת האוטומציה.

בחלון הנפתח, בחרו בנתיב לכיוון קובץ הסקריפט. הזן את קואורדינטת W1 בקו המשתנה P1 239 של מקטע תיבת הקלט של קובץ ה- Script של gyfon ואת ערך הקואורדינטות W2 בשורת המשתנה P2 241. ייחס את ערך המגרש לשורת משתנה המגרש 245 של הסקריפט והזן את ממד הבאר, שניתן לקבוע מעיצוב תבניות הבאר לקו המשתנה W-S 248.

כתוב נתיב לספריית השמירה בשורה 251 כדי לשמור את הנתונים במקום הרצוי והגדר את קו משתנה האזור הכולל 254 לרצון לסוף מרובה של 100 מיקרומטר. לאחר מכן הגדר את השורה והעמודה של מטריצת עקומות הכפייה שנרשמו לכל באר בשורת המשתנה סריקות המספרים 257 ולחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית. כדי לנתח את הנתונים, השתמש בתוכנת הקוד של אולפן הווידאו כדי לפתוח את קובץ ה- Script של פייתון ולבצע את קבצי ההעתקה של סקריפט פייתון כדי לארגן את קבצי העקומה הכפויים לתיקיה אחת.

הזן את הנתיב לתיקיה הכללית שבה יאוחסנו הנתונים. כדי לנתח את עקומות הכוח, פתח את תוכנת עיבוד הנתונים של יצרן המיקרוסקופ האטומי. בתפריט הקובץ, בחרו אצווה של עקומות ספקטרוסקופיה.

לאחר מכן בחר את תהליך הקובץ והטעינה ובחר את תהליך הנוקשות. בחר את השלב האחרון של התהליך ולחץ לשמור ולהחיל על כל כך כל עקומות כוח יקבלו את אותו טיפול. כדי לפתוח את קובץ ה- Script R, טען את הקבצים המכילים את המידע שחולץ באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים לתוכנת R studio.

בחלון הסביבה, לחצו על 'ייבוא ערכת נתונים' ומקורא מלל בחלון הנפתח, לחצו על 'עיון' לאיתור קובץ ה-TSV של הנקודות. לאחר טעינת הקובץ, בחר אזור הפעלת קוד והפעל הכל כדי להפעיל את כל הקוד. כאן מוצגות היסטוגרמות טיפוסיות שהושגו באמצעות הפרוטוקול כפי שהוכח.

בניתוח זה, הנוקשות repartition נרשם על 957 תאים מקומיים, בעוד בניתוח זה, הנוקשות של 574 תאים שטופלו caspofungin נמדדו. דע כי שימוש במאות תאים מאפשר התפלגות דו-מודאלית של הערכים שיש לצפות בהם. בדגימות קטנות יותר, התפלגות אחת נצפית בדרך כלל ויכולה לגרום לחוסר התבוננות בהטרוגניות האוכלוסייה.

השוואה של שני התנאים מדגיש את ההשפעות של Caspofungin על הפחתת נוקשות התא. שני התנאים, שנחשפו על ידי השוואת ANOVA בין התאים המקומיים והמטופלים, מציגים נוקשות שונה מאוד ושונה באופן משמעותי. ערך זה הושג בשל המספר הגדול של תאים מנותחים, מתן ביטחון רב יותר בתוצאות שהושגו.

הוספת supernatant לחותמת PDMS לפני שטיפה חוזרת ונשנית של התאים לתוך בארות עד החותמת מלאה, הוא קריטי להצלחת הניתוח. בהוכחת מושג זו, תאי קנדידה אלביקנס נותחו אך ניתן להחיל את הפרוטוקול על כל קבוצה של תאי דפוס, מולקולות או חומרים.