Name: ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: למדו כיצד להרכיב ננו-מטריקס ביומימטי מצינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין לקידום הידבקות תאי גזע מזנכימליים אנושיים. שיטה זו מחקה את המטריצה החוץ-תאית ומציעה פוטנציאל לשיקום שברי עצם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת כספית על ידי NIH (מענקים 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), פרס הקריירה של NSF (1653702) ואוניברסיטת קונטיקט.

1. סינתזה של JBNTs
הערה: מונומר JBNT הוכן כפי שפורסם בעבר11.
<ol><li>סינתזה של תרכובת A1<ol>
<li>הכן פתרון המכיל 8.50 גרם של חומצה 2-ציאנואצטית ו 9.80 גרם של אתילקרבמאט ב 25 מ"ל של טולואן ו 2.5 מ"ל של N, N-dimethylformamide. הוסף 4.90 מ"ל של זרחן כלוריד dropwise. לאחר מכן מחממים את התערובת ל 70 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 1.5 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ויוצקים פנימה 100 גרם מי קרח. לחלץ את השכבה מימית עם אצטט אתיל (3 x 250 מ"ל), ולשטוף עם 100 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים נדיפים תחת ואקום כדי לקבל מוצק צהוב חיוור.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (3% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 15.61 גרם של תרכובת A1 כאבקה לבנה.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A2<ol>
<li>מערבבים 3.12 גרם של תרכובת A1 ו 2.75 גרם של אשלגן פחמתי ב 50 מ"ל של N, N-דימתילפורממיד. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.</li>
		<li>הוסף 2.6 מ"ל של פחמן דיסולפיד להשעיית התגובה. ממשיכים לבחוש במשך 4 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתנול מוחלט לתערובת התגובה ב 0 מעלות צלזיוס. מסננים את הצהוב מזרזים החוצה ולשטוף עם אתר diethyl. יבש תחת ואקום בן לילה כדי להניב 6.18 גרם של תרכובת A2 כמו מוצק צהוב חיוור.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A3<ol>
<li>הוסף 2.7 מ"ל של מתיל יודיד ב 15 מ"ל של אצטוניטריל. כמו כן, בנפרד להכין פתרון של תרכובת A2 על ידי הוספת 6.18 גרם של A2 כדי 80 מ"ל של מים / אצטוניטריל (יחס 7:3). מערבבים את שני הפתרונות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
		<li>מחממים את תערובת התגובה ל 95 מעלות צלזיוס וממשיכים לבחוש במשך 3 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר, ואז מתאדים את הנדיפים תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את השאריות 3x עם 100 מ"ל של אתיל אצטט ולשטוף עם מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפיף את מוצק צהוב כדי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (30% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 4.52 גרם של המתחם A3 כמו מוצק צהוב בהיר.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A4<ol>
<li>הכן פתרון אליאמין על ידי הוספת 925 μL של אליאמין ב 20 מ"ל של אתנול. הוסף פתרון זה dropwise לפתרון של תרכובת A3, מוכן על ידי הוספת 3.14 גרם של A3 ב 75 מ"ל של אתנול מוחלט, מעל 30 דקות. לאחר מכן מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>מצננים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר ומאדים את הנדיפים כדי לתת מוצק צהוב.</li>
		<li>הכפפ את המוצק הצהוב לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (50% אתיל אצטט/הקסנים ל-2% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.80 גרם של תרכובת A4 כקריסטל לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A5<ol>
<li>הוסף 2.05 גרם של גואנידיניום הידרוכלוריד ו 7.8 מ"ל של נתרן אתוקסיד (21 wt% באתנול) ב 14 מ"ל של אתנול מוחלט. מחממים את התערובת ל 45 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.</li>
		<li>לסנן את החומר מסיס ולהוסיף את הסינון ישירות לתוך הפתרון של תרכובת A4, מוכן על ידי הוספת 2.70 גרם של A4 ב 40 מ"ל אתנול מוחלט. מחממים את תערובת התגובה לרפלוקס במשך 16 שעות.</li>
		<li>לסנן את המשקעים החוצה כדי לקבל 2.65 גרם של תרכובת A5 כמו מוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A6<ol>
<li>הוסף 24.9 מ"ל של טריאתילאמין לאט לתערובת תרחיף המתקבל על ידי הוספת 2.11 גרם של תרכובת A5 ו 1.10 גרם של 4-דימתילאמינופירידין ב 120 מ"ל של טטרהידרופורן מעל 1 דקות. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 20.7 מ"ל של די-טרט-בוטיל דיקרבונט לתערובת התגובה וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 40 שעות.</li>
		<li>הוסף 20 מ"ל של מים כדי להרוות את התגובה. לאדות את volatiles תחת ואקום.</li>
		<li>לחלץ את שאריות צמיג אדום עם 500 מ"ל של אתיל אצטט. לאחר מכן, לשטוף אותו עם 250 מ"ל של מים, 75 מ"ל של 10% חומצת לימון, 2x עם 200 מ"ל של מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח. יבשו את השכבה האורגנית מעל נתרן גופרתי נטול מים, מסננים ומאדים את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצק אדום/כתום.</li>
		<li>הכפיף את מוצק chromatography עמוד פלאש ג'ל סיליקה (0-20% אתיל אצטט / הקסנים) כדי להניב 3.87 גרם של תרכובת A6 כמו קצף לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A7<ol>
<li>הוסף N-מתילמורפוליין N-תחמוצת (50 wt.% במים, 1.64 מ"ל) dropwise לפתרון של תרכובת A6 (2.93 גרם) באצטון / מים (8:1, 58.5 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>מוסיפים אוסמיום טטראוקסיד (4% פתרון מימי) טיפה לתערובת על פני תקופה של 3 דקות וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את התגובה עם 1.0 M מימית נתרן גופרתי עד הפתרון הופך חסר צבע. הסר את volatiles תחת ואקום כדי לגרום תרחיף לבן במים. לחלץ את השאריות עם 350 מ"ל של dichloromethane ולאחר מכן לשטוף עם 150 מ"ל של מים ואחריו לשטוף עם 150 מ"ל של מלח.</li>
		<li>יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להניב 2.45 גרם של תרכובת A7 כמוצק לבן.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A8<ol>
<li>הוסף 760 גרם של תקופת נתרן לתערובת של 1.36 גרם של תרכובת A7 ב 35 מ"ל של דיכלורומתאן / מים (6:1, 35 מ"ל) ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 42 שעות.</li>
		<li>מסננים את החומר הבלתי מסיס ומרכזים את הסינון תחת ואקום. לחלץ את השאריות וכתוצאה מכך עם 250 מ"ל של dichloromethane, ולאחר מכן לשטוף עם 100 מ"ל של מים ו 100 מ"ל של מלח. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי לתת את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפפ את המוצר הגולמי לכרומטוגרפיה של עמודת פלאש ג'ל סיליקה (5-40% אתיל אצטט/הקסנים, ולאחר מכן 5% מתנול/דיכלורומתאן) כדי להניב 1.08 גרם של תרכובת A8.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של תרכובת A9<ol>
<li>הכן פתרון של 830 מ"ג של תרכובת A8 ב 15 מ"ל של 1,2-dichloroethane. הוסף את הפתרון של dropwise לתערובת של 6-בנזילוקסיקקרבונילמינו-2-L-אמינו-hexanoic חומצה טרימתילסיליל אתיל אסתר (649.5 מ"ג) ו N,N-diisopropylethylamine (591 μL) ב 24 מ"ל של 1,2-dichloroethane מעל 3 דקות ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
		<li>מוסיפים 360.3 מ"ג נתרן triacetoxyborohydride לפתרון וממשיכים לבחוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.</li>
		<li>להרוות את תערובת התגובה עם 6 מ"ל של מים. לחלץ את תערובת התגובה 3x עם 200 מ"ל של דיכלורומתאן ולשטוף עם 200 מ"ל של 10% חומצת לימון במים, 2x עם 200 מ"ל מים, 200 מ"ל של סודיום ביקרבונט רווי, ו 200 מ"ל של מלח בסדר זה. יבש את השכבה האורגנית על נתרן גופרתי נטול מים, סנן ואייד את הנדיפים תחת ואקום כדי להשיג את המוצר הגולמי.</li>
		<li>הכפיפה את המוצר הגולמי כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה (5-30% אתיל אצטט / הקסנים) להניב 885 תרכובת מ"ג A9.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזה של מונומר JBNT<ol>
<li>להמיס 0.54 גרם של תרכובת A9 (0.54 גרם) ב 10 מ"ל של 94% תמיסת חומצה trifluoroacetic / thioanisole ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 72 שעות.</li>
		<li>מוסיפים אתר diethyl (80 מ"ל) לתערובת התגובה וצנטריפוגה משקעים למטה. יוצקים את החומצה trifluoroacetic ברור המכיל supernatant החוצה ולשטוף את המשקעים הלבנים עם אתר diethyl ומתנול להניב 168.6 מ"ג מונומר JBNT גס (קובץ משלים 1).</li>
		<li>טיהור מונומר JBNT גולמי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת פאזה הפוכה. תוכנית הבידוד מפורטת להלן: ממס A: 100% מים; ממס B: 100% אצטוניטריל; ממס C: pH = 1 פתרון מים HCl; קצב זרימה: 3 מ"ל / דקה (ראה טבלה 1).</li>
		<li>לאסוף את הפסגה הגדולה ביותר בערך 7.2 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ייצור עבור JBNT / FN
<ol><li>הוסף 80 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNT פתרון מימית 40 μL של 1 מ"ג / מ"ל FN פתרון מימית פיפטה מספר פעמים.</li>
	<li>בדוק אם יש נוכחות של מתלה מוצק לבן לאחר pipetting במשך כ 10 s. הערה: סרטון צולם כדי ללכוד את תהליך ההרכבה העצמית של NM (קובץ משלים 2).</li>
</ol>3. התבוננות בדגימות לויאופיליות
הערה: שלב זה מבוצע כדי להציג את מבנה הפיגומים של NM עשוי JBNTs ו- FN.
<ol><li>הכן פתרונות FN, JBNT ו- FN / JBNT NM לתצפית חומרים ליאופיליים. לדלל 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של FN עם 40 μL של מים מזוקקים לעשות פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל של FN.</li>
	<li>הכן 100 מ"ג / מ"ל פתרון של JBNTs על ידי דילול 5 μL של 1 JBNTs מ"ג / מ"ל ב 45 μL של מים DI.</li>
	<li>מערבבים 10 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs ב 35 μL של מים DI כדי ליצור את הפתרון NM.</li>
	<li>מעיל שלוש בארות של מיקרופלטות עגולות עגולות ברורות 96-היטב עם FN, פתרון JBNT ופתרון NM, בהתאמה. כל באר מקבלת 50 μL של הפתרון.</li>
	<li>בצע lyophilization, כמתואר להלן, כדי לדמיין את מבנה הפיגומים של NM.<ol>
<li>להקפיא את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
		<li>הפעל את המכשיר lyophilized ומשאבת ואקום.</li>
		<li>לחץ על כפתור הקירור כדי להפחית את הטמפרטורה של המערכת ל -50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מכניסים את הצלחת הקפואה לתוך המכשיר lyophilized ולסגור את כל פתחי המכשירים.</li>
		<li>לחץ על לחצן התחל כדי להפחית את לחץ המערכת ל- 0.9 mbar.</li>
		<li>לאחר 4 שעות, לחץ על כפתור aerate ולפתוח את השסתום כדי להגביר את לחץ המערכת ללחץ האטמוספרי.</li>
		<li>תוציא את הצלחת מהמכשיר הליאופילי.</li>
		<li>השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן ב- FN, JBNTs וב- NM שהרכיב את עצמו. צלם מספר תמונות עם מצלמה לחומרים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. מדידת ספקטרום ספיגה
הערה: השתמש בשינוי הספקטרום עבור FN ו- JBNTs כדי להציג את JBNT / FN NM12שהרכיב את עצמו .
<ol><li>מערבבים 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 15 μL של מים מזוקקים ו 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNTs להכין את הפתרון JBNT / FN NM. השעיה מוצקה לבנה ניתן לראות לאחר pipetting הפתרון מספר פעמים. הערה: הריכוזים הסופיים של JBNTs ו- FN בתמיסה הם 100 מיקרוגרם / מ"ל ו 60 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. פתרונות JBNTs ו- FN באותו ריכוז לזה המשמש בפתרון NM הוכנו גם כפתרונות בקרה.</li>
	<li>לדלל 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל של JBNTs עם 45 μL של מים מזוקקים כדי להכין פתרון בקרת JBNT.</li>
	<li>לדלל 30 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל FN עם 20 μL של מים מזוקקים כדי להכין את פתרון בקרת FN.</li>
	<li>למדוד את ספקטרום הספיגה UV-vis של פתרונות FN, JBNT ו JBNT / FN NM עם ספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים)כדי לאפיין את ההרכבה של NM.<ol>
<li>לחץ על לחצן UV-Vis. לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של מים מזוקקים על זה. למדוד אותו ריק מ 190-850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון FN על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה UV-Vis של פתרון FN מ 190 ננומטר עד 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
		<li>לנקות את משטח הבדיקה של ספקטרופוטומטר ושחרר 2 μL של פתרון JBNT / FN NM על זה. למדוד את ספקטרום הספיגה של פתרון JBNT / FN NM מ 190 ננומטר ל 850 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הכנת JBNT / FN NM להעברת מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM)
<ol><li>נקה מספר רשתות לפני כתמים שליליים עם מנקה פלזמה בסיסי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את הכתמים השליליים לדגימות לאחר שני תהליכים שונים.<ol>
<li>שחרר 3 μL של 1 מ"ג / מ"ל של פתרון מימי JBNTs ו 3 μL של פתרון JBNT / FN NM על רשתות מופרדות ולהשאיר אותו במשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף כל רשת עם 100 μL של 0.5% Uranyl אצטט (UA) פתרון. מסננים את הפתרון העודף עם נייר מסנן ואוויר לייבש את הרשתות.</li>
		<li>לערבב 9 μL של פתרון JBNT / FN NM עם 3 μL של 2.0% פתרון UA ופיפט אותו מספר פעמים. פיפטה הפתרון המעורב על הרשתות ולשמור אותו על הרשתות במשך 2 דקות. השתמש בנייר סינון כדי להסיר את הפתרון המעורב מהרשתות ולייבש את הרשתות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבסוף, לאפיין את הדגימה עבור JBNTs, JBNT / FN NM מוכתם בשלב 5.2.1, ו JBNT / FN NM מוכתם עם שלב 5.2.2 עם TEM.</li>
</ol>6. במבחנה ביולוגית פונקציה מבחנה
<ol><li>הוסף 200 μL של פקדים שליליים (NC, PBS), JBNTs, FN ופתרונות JBNT / FN NM לבאר אחת של שקופית 8 בארות, בהתאמה.</li>
	<li>להקפיא לייבש את כיסוי 8-היטב תאים עם המכשיר lyophilized לציפוי חומרים בתחתית בארות. הפרוטוקול לייבוש הקפאה זהה לשלב 3.5.</li>
	<li>לאחר מכן להוסיף 10,000 תאים / בארות hMSCs (מעבר 3) לתוך הבארות ולהדגיר אותם במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, פיפטה את מדיום תרבות התא מן הבארות ולשטוף את התרבות עם פתרון 1x PBS.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הפתרון המתקן לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 5 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>מדללים 1% טריטון-X 100 עד 0.1%. הוסף 100 μL של 0.1% טריטון-X 100 לכל באר עם תאים ולהשאיר במשך 10 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לדלל את הרודמין Phalloidin ל 1.65 מיקרומטר. להוסיף 100 μL של רודמין Phalloidin לכל באר עם תאים דגירה כיסוי התאי שמירה על אור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1x PBS פעמיים.</li>
	<li>לכוד את תמונות התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>ספירת מספרי התאים בתמונות פלואורסצנטיות עבור כל קבוצה. לחשב את צפיפות הידבקות התא על ידי ממוצע של שלושה אזורים אקראיים בכל באר.</li>
	<li>הצג את כל הנתונים כסטיית תקן (SD) ± ממוצעת. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t חד-זנבי, ואחריו ניתוח שונות (ANOVA) עם p<0.05, הנחשב מובהק סטטיסטית.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li>
<li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li>
<li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells%3A+interplay+of+genes%2C+aging%2C+environmental+factors+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li>
<li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li>
<li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li>
<li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li>
<li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+Rosette+Nanotubes%3A+Design%2C+Self-Assembly%2C+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+rosette+nanotube%2Fhydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li>
<li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells%3A+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li>
<li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy%3A+a+long%2C+thin%2C+flexible+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li>
<li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. U. S. Patent. , 20170362238A1 (2017).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+and+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li>
<li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li>
<li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li>
<li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li>
<li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+promotes+higher+adhesion%2C+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068(2015).</li>
<li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li>
<li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של NanoDe Therapeutics בע"מ.

במחקר זה פיתחנו NM ביומימטי בהרכבה עצמית, אשר נוצר עם JBNTs בהשראת DNA ו- FN. בעת הכנת פתרון JBNT, אבקת lyophilized JBNT צריך להיות מומס לתוך המים במקום PBS כי PBS יגרום agglomeration של JBNTs, אשר מעכב את ההרכבה שלהם. יתר על כן, NM צריך גם להיות מורכב במים אם אנחנו רוצים לבחון את המבנים ננו סיבי של NM, כי המלח ב- PBS יהיה צרור עם סיבי NM, אשר יכול להפחית מאוד את הרזולוציה של התמונות.
NM הראה פוטנציאל גדול לשמש פיגום הנדסת רקמות חדשני למרות הרבה מאמצים נעשו כדי להמציא פיגומים רגנרטיביים רקמות,...

תאי גזע mesenchymal האנושי (hMSCs) הראו את הפוטנציאל להתחדשות עצמית ובידול עצמי לאורך שושלת mesenchymal שונים, אשר מסייע התחדשות ותחזוקה שלרקמות 1. בהתבסס על פוטנציאל הבידול, hMSCs נחשבים כמועמדים לפציעות רקמה mesenchymal וטיפול בהפרעה hematopoietic2. hMSCs הראו את היכולת לקדם ריפוי פצעים על ידי הגדלת תיקון רקמות, אנגיוגנזה, והפחתת דלקת3. עם זאת, ללא סיוע ביוכימי או ביו-חומרים, היעילות של hMSCs להגיע לרקמת יעד ולתפקד במיקום הרצוי היא נמוכה4. למרות פיגומים מהונדסים שונים נוצלו כדי למשוך hMSCs לדבוק בנגעים, אתרים מסוימים כגון שבר צלחת צמיחה, באמצע עצם ארוכה, אינם נגישים בקלות על ידי פיגומים קונבנציונליים מראש מפוברק, אשר לא יכול להתאים באופן מושלם לתוך אתר פצוע בצורה לא סדירה.
כאן, פיתחנו ננו-חומר ביו-מימטי שיכול להרכיב את עצמו במקום ולהזריק אותו לאזור מטרה שקשה להגיע אליו. NM ביו פיגום להזרקה מורכב צינורות בסיס יאנוס (JBNTs) ו פיברונקטין (FN). JBNTs, הידוע גם בשם צינורות רוזט (RNTs), נגזרים זוגות בסיס DNA, במיוחד תימין אדנין, כאן5,6,7. כפי שניתן לראות באיור 1, הננו-צינוריות נוצרות כאשר שש מולקולות של בסיס הדנ"א הנגזר מרכיבות את עצמן באמצעות קשרי מימן ויוצרותמישור 6. שש מולקולות נערמות זו על זו במישור באמצעות אינטראקציית pi-stacking חזקה7, אשר יכול להיות עד 200-300 מיקרומטר אורך. JBNTs נועדו לחקות מורפולוגית סיבי קולגן כך FN יגיב איתם.
FN הוא דבק במשקל מולקולרי גבוה גליקופרוטאין, אשר ניתן למצוא במטריצה חוץ תאית (ECM)9. אלה יכולים לתווך את ההחזקה של תאי גזע לרכיבים אחרים של ECM, במיוחד קולגן10. עיצבנו JBNTs לחקות סיבי קולגן באופן מורפולוגי כך FN יכול להגיב איתם כדי ליצור NM בעוד כמה שניות באמצעות מליטה noncovalent. לכן, NM הוא ביו פיגום מבטיח להיות מוזרק לתוך אתר שבר עצם כי לא יכול להיות נגיש על ידי פיגומים מפוברק קונבנציונלי. כאן, NM להזרקה מציג יכולת מצוינת כדי לשפר את מעגן hMSC במבחנה, מציג את הפוטנציאל שלהם לשמש פיגום עבור התחדשות רקמות.

<table><tbody><tr><td>1,2-דיכלורואתאן</td><td>אלפא Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-חומצה ציאנואצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td> <td>מוחלטתרמו פישר</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>אלילמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה בסיסי</td><td>האריק פלזמה</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td> מרוכז 251275 <td></td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td><td>תרמו פישר</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>די-טרט-בוטיל דיקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>אתילקרבמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>תרמו פישר</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קיבוע (4% פורמלדהיד מוכן ב-PBS)</td><td>תרמו פישר</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>גואנידיניום הידרוכלוריד</td><td>אלפא Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>הקסנים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>אנושי תאי גזע מזנכימליים</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>מתיל יודיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-מתילמורפולין N-אוקסיד</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטראוקסיד</td><td>אלפא Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ פוספט</td><td>תרמו פישר</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>זרחן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פחמתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>עמודת שלב הפוך</td><td>תרמו פישר</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>רודמין פלואידין</td><td>תרמו פישר</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>סיליקה ג'ל</td><td>TCI אמריקה</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אתוקסיד</td><td>אלפא Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פריובידיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סולפיט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טריאצטקסיבורוהידריד</td><td>אלפא Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>צמיחת תאי גזע בינוני BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>טולואן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Alfa</td><td>Aesar A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA</td><td>תרמו פישר</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

NM ביומימטי פותחה כדי לשמש פיגום ביולוגי הנדסת רקמות, אשר יכול לשפר את עגינה תאי גזע. ה- NM הביומימטי נוצר מ- JBNTs ו- FN באמצעות הרכבה עצמית בתמיסה מימית. JBNTs למדוד 200-300 מיקרומטר אורך עם ערוצי חלול הידרופובי פנימי משטחים הידרופיליים החיצוניים. JBNTs מחויבים באופן חיובי ו- FNs מחויבים באופן שלילי. לכן, כאשר מוזרק לתוך פתרון מימית ניטרלי, הם מלוכדים יחד באמצעות מליטה noncovalent כדי ליצור את חבילות NM. תהליך ההרכבה העצמית הושלם תוך שניות ספורות ללא יוזמים כימיים, מקור חום או אור UV. כאשר רמת ה- pH של פתרון NM נמוכה מהנקודה האיזואלקטרית של FNs (pI 5.5-6.0), חבילות NM יופצו באופן עצמאי עקב נוכחות של FN טעון באופן חיובי.
NM ידוע לחקות את המטריצה חוץ תאית (ECM) מורפולוגית ולכן, יכול לשמש פיגום להזרקה, אשר מספק פלטפורמה מצוינת כדי לשפר את הידבקות hMSC. ניתוח צפיפות התא וניסויי הדמיית פלואורסצנטיות הצביעו על כך שה- NMs הגדילו באופן משמעותי את העיגון של רכיבי HMSCs בהשוואה לבקרה השלילית.

המחקרים שלנו גילו כי היווצרות NM של JBNTs ו FN הוא מהיר, אשר קרה ב 10 שניות. כפי שמוצג באיור 2, פלוקולה לבנה הושגה כאשר פתרון JBNT היה מעורבב עם פתרון FN ו pipetted מספר פעמים. תהליך היווצרות של NM הוא ביומימטי לחלוטין. אין צורך בגירויים חיצוניים. תהליך הייצור הוא הרבה יותר קל מזה של כמה biomaterials המתעוררים, אשר מבוסס על אור אולטרה סגול או יוזם כימי עבור crosslinking13.
צילמנו וניתחנו את תמונות המצלמה של FN, JBNTs וה-NM<strong class="xfi...

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

פיתחנו ננו-מטריצה ביומימטית עם הבטחה גדולה לשמש כפיגום להנדסת רקמות. פרוטוקול זה מדגים כיצד להרכיב את הננו-מטריצה מננו-צינורות בסיס של ג'אנוס שסונתזו במעבדה שלי, כמו גם את חלבון הפיברונקטין. ננו-מטריצה זו יכולה להרכיב את עצמה תוך מספר שניות מבלי להשתמש בסיוע נוסף.כאשר תרבית משותפת עם תאי גזע מזנכימליים אנושיים, הננו-מטריצה הפגינה פעילות ביולוגית מצוינת בעידוד הידבקות התאים. הננו-מטריצה מחקה את המטריצה החוץ-תאית מבחינה מורפולוגית. לכן, יש לו פוטנציאל לשמש פיגום להזרקה לתיקון שברים בעצמות על ידי קידום הידבקות התאים ותפקודם במיקום המטרה.התחל בייצור הננו-מטריצה. הוסף 80 מיקרוליטר של ננו-צינורות בסיס יאנוס של מיליגרם אחד למיליליטר ל-40 מיקרוליטר של פיברונקטין של מיליגרם למיליליטר, ופיפטה את התערובת בעדינות ובאיטיות מספר פעמים. לאחר 10 שניות, בדוק ויזואלית את הצינור לנוכחות מתלה מוצק לבן.לאחר מכן, הכינו תמיסות ננו-מטריצות פיברונקטין, JBNT ופיברונקטין / JBNT לתצפית על חומרים ליופיליים בהתאם להוראות כתב היד. מצפים שלוש בארות של מיקרו-פלטה שקופה עם תחתית עגולה של 96 בארות בתמיסות, ומוסיפים 50 מיקרוליטר לכל באר. מקפיאים את הצלחת במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, הפעל את המכשיר הליופילי ואת משאבת הוואקום, ולחץ על כפתור הקירור כדי להפחית את טמפרטורת המערכת למינוס 50 מעלות צלזיוס. הכניסו את הצלחת הקפואה למכשיר, וסגרו את כל הפתחים. לחץ על כפתור ההתחלה כדי להפחית את לחץ המערכת ל-0.9 מיליבר.לאחר ארבע שעות, לחץ על כפתור האוורור ופתח את השסתום כדי להגביר את לחץ המערכת ללחץ האטמוספרי. לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהמכשיר הליופילי. הכן את תמיסת הננו-מטריצה JBNT/פיברונקטין כמתואר בכתב היד הטקסטואלי, ודלל את תמיסות JBNT והפיברונקטין במים מזוקקים ליצירת פתרונות בקרה.מדוד את ספקטרום הספיגה של התמיסות בעזרת הספקטרופוטומטר כדי לאפיין את הרכבת הננו-מטריצות. לחץ על כפתור UV-vis. לאחר מכן, נקו את משטח הבדיקה של הספקטרופוטומטר, וזרקו עליו שני מיקרוליטרים של מים מזוקקים.מדוד את המים כריק בין 190 ל -850 ננומטר. עבור כל דגימה, יש לנקות את משטח הבדיקה ולהפיל עליו שני מיקרוליטר מהתמיסה. לאחר מכן, מדוד את ספקטרום ספיגת ה-UV-vis בין 190 ל-850 ננומטר.הוסף 200 מיקרוליטר של בקרות שליליות, JBNTs, פיברונקטין ותמיסות ננו-מטריצה לבארות של מגלשה בעלת שמונה בארות. יש להקפיא ולייבש את זכוכית הכיסוי בת שמונה הבארות בעזרת המכשיר הליופילי לציפוי חומרים על קרקעית הבארות. לאחר מכן, הוסיפו 10,000 תאי גזע מזנכימליים אנושיים לכל באר של זכוכית הכיסוי, ודגרו אותה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה יש להוציא את מדיום תרבית התאים מהבארות ולשטוף אותם עם PBS. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הקיבוע לכל באר, והשאיר אותה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו בעדינות את התאים עם PBS פעמיים, והוסיפו 100 מיקרוליטר של 0.1% Triton X-100 לכל באר.לאחר 10 דקות, חזור על השטיפות עם PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של רודמין פלואידין לכל באר, ודגר על זכוכית הכיסוי למשך 30 דקות, והגן עליה מפני אור. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ודמו אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.היווצרות ננו-מטריצה היא מהירה וביומימטית לחלוטין. פלוקול לבן נראה 10 שניות לאחר ערבוב תמיסת JBNT עם תמיסת הפיברונקטין. תמונות מצלמה של פיברונקטין, JBNTs והננו-מטריצה צולמו ונותחו.לא נצפו סיבים ארוכים בקבוצת הפיברונקטין, מה שמצביע על כך שמבנה הפיגום לא יכול להיווצר ללא JBNTs. JBNTs מופיעים כסיבים ארוכים ודקים. כאשר הוא מקושר עם פיברונקטין, סיב הננו-מטריצה יכול לגדול לאורך של כמה סנטימטרים.הרכבת הננו-מטריצה אושרה גם על ידי השגת ספקטרום UV-vis. שני שיאי הספיגה של JBNTs לבדם פוחתים לאחר היווצרות ננו-מטריצות. מיקרוסקופ אלקטרונים שימש לאפיון המורפולוגיה של ה-JBNTs והננו-מטריצות.ה-JBNTs הם צינורות דקים בקוטר אחיד. כאשר הם מעורבבים עם פיברונקטין, הם יוצרים ננו-מטריצת שרירנים ארוכה באמצעות אינטראקציות מטען. כאשר ה-pH נמוך מהנקודה האיזואלקטרית של הפיברונקטין, הננו-מטריצה משחררת את עצמה עקב הפיברונקטין הטעון חיובית.נבדקה גם ההשפעה של ננו-מטריצת JBNT/פיברונקטין על הידבקות התאים. מכיוון שננו-מטריצות נועדו לחקות מורפולוגית את המטריצה החוץ-תאית, הן מספקות פיגום ומגבירות את הידבקות התאים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה כי הדגירה עם הננו-מטריצות הגבירה את הידבקות התאים.בהליך הבא, ניתן להראות נדידת תאים, התמיינות והתפקוד ארוך הטווח כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה של ננו-מטריצה על צמיחה ותפקוד של תאי גזע מזנכימליים אנושיים.

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

מוצג פרוטוקול לייצור שטח גדול של מצע ננו-דפוסי מתבניות ננו-דפוסיות קטנות לחקר אפנון ננוטופוגרפי של התנהגות התא.

הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.

דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה בדיית רקמות עצמית שהורכב טבעות בגדלים משתנים באמצעות תבנית מותאמת אישית פלסטיק מודפס 3D. PDMS התשלילים נרפאים ב כייר מודפס 3D; אז agarose הוא ליהק את התשלילים PDMS נרפא. התאים הם נזרע לתוך בארות agarose וכתוצאה מכך היכן הם מצטברים לטבעות רקמות.

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.

ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי

כאן, אנו מציגים עבור הזיוף של צלחות nanopattern מעבר צבע באמצעות nanoimprinting תרמי ואת שיטת הקרנה התגובות של האדם ובתאים אנדותל nanostructures פרוטוקול. באמצעות הטכנולוגיה המתואר, זה אפשרי לייצר לפיגום שיכול להשפיע על התנהגות התא על ידי הגירויים הפיזיים.

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.

ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס

תוספות תרבית רקמה עם ממברנות פלסטיק הן תקן הזהב במעבדות תרביות תאים כתומכות חדירות לביסוס שכבות תאים ומודלים של רקמות מחסום. במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה להחלפת קרום הפלסטיק בקרום רלוונטי יותר מבחינה ביולוגית העשוי מחלבון משי עכביש רקומביננטי מתפקד.

חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית

הפרוטוקול הבא מציג שיטת שחול מבוססת גזירה לייצור הידרוג'לים של קולגן עם סיבים בדוגמת ננומטר, הניתנת ליישום במגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות.

ייצור קולגן בדוגמת ננו-פיברילר להנדסת רקמות

למדו כיצד להרכיב ננו-מטריקס ביומימטי מצינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין לקידום הידבקות תאי גזע מזנכימליים אנושיים. שיטה זו מחקה את המטריצה החוץ-תאית ומציעה פוטנציאל לשיקום שברי עצם.

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

גלה סרטונים נוספים