כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה
June 11th, 2020
להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.
הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי של אוכלוסיות עצביות של זחלים המקודדים בחירות תזונתיות הקשורות לשליטה ברמות הצריכה של שני מקרונוטריינטים עיקריים, חלבונים ופחמימות. הפשטות והתפוקה הגבוהה יחסית של השיטה שלנו מאפשרת לכמת את צריכת המזון עבור מספר גנוטיפים שנחשפו לתנאים תזונתיים שונים. כדי לחצות גנטית את קווי ההורים, הקימו כלובי איסוף עוברים בגודל 60 מילימטר עם צלחות דיאטה לגידול L3 בתוספת משחת שמרים פעילה.
העבירו את הבתולות הבוגרות TripA1 וזכרי Janelia GAL4 בגילאי חמישה עד שמונה ימים לכלובי איסוף העוברים ואפשרו להזדווגות להתרחש במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ומחזור חושך אור של 12, 12. לאחר תקופת ההזדווגות, העבירו את הזבובים הבוגרים המזדווגים לצלחות תזונה טריות לגידול L3 ואפשרו להטלת הביצים להתרחש במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. ודא שכל הצלחות מסומנות עם הגנוטיפ והתאריך של הטלת הביצה.
בסיום תקופת הטלת הביצים, הוציאו את הצלחות מהכלובים והעריכו את מספר הביצים לצלחת על ידי ספירת מספר העוברים ברבע מהצלחת. שמור על צפיפות הזחל למקסימום של 200 עוברים לצלחת וכסה את הצלחות במכסי פלסטיק. דגרו את לוחות הגידול L3 ב-18 מעלות צלזיוס, 60% לחות ומחזור חושך אור של 12, 12 למשך תשעה ימים.
לאחר הדגירה, אספו שלוש קבוצות של 10 L3 מכל אחד מהגנוטיפים שייבדקו, כמו גם קבוצה אחת של 10 L3 לבקרת מזון אפס צבע. השתמש במלקחיים מספר חמש או במשקל נוצה כדי לבצע את איסוף הזחלים בעדינות ככל האפשר. העבירו את הזחלים שנאספו לסירות במשקל צלחת פלסטיק המכילות מיליליטר מים.
הקימו אינקובטור של 30 מעלות צלזיוס ושמרו על רמות לחות גבוהות על ידי הוספת מגש מלא במים כדי למנוע התייבשות זחלים במהלך הבדיקה. אזנו את הטמפרטורה של לוחות הבדיקה על ידי חימום ל-30 מעלות צלזיוס לפני ההתנעה. ודא שכל הצלחות מסומנות עם הגנוטיפ ויחס החלבון לפחמימות של הדיאטה.
הלם חום את זחלי הניסוי למשך שתי דקות על ידי העברה ישירה של סירות הפלסטיק המכילות את החיות לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את מספר הטיימרים הנדרש למשך שעה, ולאחר מכן נקז בזהירות את המים מסירות הפלסטיק והעביר את קבוצות L3 מהסירות למרכז לוחות הנכסים. מכסים את הצלחות ומתחילים את הטיימר.
אפשר לזחלים לאכול במשך שעה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך. הפסק את מבחן ההאכלה על ידי העברת הצלחות לאמבטיית קרח. הכן שני מיקרו-צינורות מיליליטר לכל קבוצת L3 שנבדקה המכילה מספיק חרוזי זכוכית של 0.5 מילימטר כדי למלא את החלק התחתון של המיקרו-צינור ו-300 מיקרוליטר מתנול קר כקרח.
השתמש במקרר ספסל כדי לשמור על המיקרו-צינורות קרים. שחזר בזהירות את קבוצות L3 מלוחות בדיקת ההזנה והעביר אותן למכסי הצלחות עם מעט מים. שטפו את הזחלים כדי להסיר שאריות מזון מגופם, תוך הקפדה על מניעת פציעות.
העבירו את הזחלים למיקרו-צינורות המוכנים והעבירו אותם בעזרת לייזר רקמות כדי לחלץ את צבע המאכל מהמעיים. העבירו את התמציות למיקרו-צינורות נקיים של 1.5 מיליליטר על ידי היפוך ישיר של שני המיקרו-צינורות של מיליליטר על הצינורות החדשים. עשו זאת בעדינות כך שרוב חרוזי הזכוכית יישארו בתחתית צינור שני מיליליטר.
נקה את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה של התמציות במהירות מקסימלית ובארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן העביר את הסופרנטנטים לצינורות נקיים של 1.5 מיליליטר. כדי לבצע כימות קלורימטרי של צריכת מזון, הכינו תמיסות סטנדרטיות של צבע כחול על ידי דילול סדרתי אחד עד שניים במתנול. העבירו 100 מיקרוליטר מדגימות הניסוי, התקנים והריק לבארות של מיקרו-פלטה של 96 בארות ומדדו את הספיגה ב-600 ננומטר.
פרוטוקול זה שימש לכימות הכמויות היחסיות של מקרונוטריינטים שנצרכו עבור בעלי חיים תחת הפעלה תרמוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות במערכת העצבים של הזחל. הפעלת אוכלוסיות מובחנות של נוירונים השפיעה באופן משמעותי על איזון המאקרו-נוטריינטים בזחלי כוכב שלישי. דפוס ההזנה שנצפה עבור קו הביקורת, המצוין כאן בצבע אפור, מראה ירידה צפויה בצריכת המזון בדיאטות עם יחס חלבון לפחמימות גבוהות יותר, מה שמדגים את יעילות השיטה.
חמשת המחלקות הפנוטיפיות שנקבעו עבור חיות הניסוי היו לאכול הרבה ולפצות על דילול החלבון על ידי אכילת יתר, לאכול הרבה, אך לא לפצות, לאכול מעט, אך לפצות, לאכול מעט ולא לפצות ולאכול בצורה חריגה. עבור כל אחת מהמחלקות והגנוטיפים הפנוטיפיים הללו, מוצגים דפוסי ה-GFP במערכות העצבים המרכזיות של זחלי כוכב שלישי. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב ליצור זחלים מוקדמים מסונכרנים התפתחותית על מנת למזער את השונות הקשורה להתנהגות בעלי חיים.
בהתאם לפרוטוקול זה, תיוג רדיו של המזונות יאפשר אישור וניתוח נוסף של הפגיעות שנמצאו בשיטות אלה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מתאר פרוטוקול לכימות קולורמטרי של צריכת מזון בזחלי Drosophila melanogaster שנחשפו לתזונות מקרונוטרינטים שונות. המחקר מתמקד בזיהוי אוכלוסיות נוירונים לרוחב הזחלים המעורבות בבחירת תזונה ובקרת צריכת מזון תוך חשיפה ליחסי חלבון ופחמימה שונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- גנטיקה
רקע
- זחלי Drosophila melanogaster משמשים כמודל לחקר התנהגויות תזונתיות.
- השפעת איכות המקרונוטרינטים התזונתיים על דפוסי האכילה חיונית להבנת הבחירות המטבוליות.
- הפרוטוקול מאפשר סינון תזונתי בתפוקה גבוהה בין גנוטיפים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לכימות צריכת מזון בשלבים הזחליים של Drosophila.
- להבין את המנגנונים הנוירוניים העומדים בבסיס קבלת ההחלטות התזונתיות.
- לבחון את ההשפעות של יחסי חלבון ופחמימה שונים על התנהגות האכילה.
שיטות ששימשו
- הפרוטוקול משתמש בבדיקות התנהגותיות לכימות פעילות האכילה בזחלי שלב שלישי.
- זחלי Drosophila נחשפים לתזונות שונות תוך שהאוכלוסיות הנוירוניות מופעלות תרמוגנטית.
- ההערכה כוללת זעזוע חום של הזחלים, ואחריו מדידה קולורמטרית של צבע המזון שנספג מהתזונה שלהם.
- סינכרון זמן קפדני של התפתחות הזחלים חיוני לתוצאות התנהגותיות עקביות.
- עקומות סטנדרטיות לכימות נקבעות באמצעות פתרונות צבע מדוללים באופן סדרתי.
תוצאות עיקריות
- הפעלה נוירונית מובחנת משפיעה משמעותית על איזון המקרונוטרינטים בדפוסי האכילה.
- חמישה סוגים פנוטיפיים של התנהגות אכילה זוהו על סמך תגובות הצריכה לשינויים תזונתיים.
- השיטה הראתה כימות יעיל של הקשר בין הרכב התזונה לצריכת המזון.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור את התפקיד של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בבחירות התזונתיות של הזחלים.
- מדידה ברורה של צריכת מזון ופנוטיפים התנהגותיים משפרת את ההבנה של קבלת ההחלטות המטבוליות.
- הממצאים תורמים לידע על הפיזיולוגיה התזונתית והבסיסים הנוירוניים שלה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
