כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי של אוכלוסיות עצביות של זחלים המקודדים בחירות תזונתיות הקשורות לשליטה ברמות הצריכה של שני מקרונוטריינטים עיקריים, חלבונים ופחמימות. הפשטות והתפוקה הגבוהה יחסית של השיטה שלנו מאפשרת לכמת את צריכת המזון עבור מספר גנוטיפים שנחשפו לתנאים תזונתיים שונים. כדי לחצות גנטית את קווי ההורים, הקימו כלובי איסוף עוברים בגודל 60 מילימטר עם צלחות דיאטה לגידול L3 בתוספת משחת שמרים פעילה.

העבירו את הבתולות הבוגרות TripA1 וזכרי Janelia GAL4 בגילאי חמישה עד שמונה ימים לכלובי איסוף העוברים ואפשרו להזדווגות להתרחש במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ומחזור חושך אור של 12, 12. לאחר תקופת ההזדווגות, העבירו את הזבובים הבוגרים המזדווגים לצלחות תזונה טריות לגידול L3 ואפשרו להטלת הביצים להתרחש במשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. ודא שכל הצלחות מסומנות עם הגנוטיפ והתאריך של הטלת הביצה.

בסיום תקופת הטלת הביצים, הוציאו את הצלחות מהכלובים והעריכו את מספר הביצים לצלחת על ידי ספירת מספר העוברים ברבע מהצלחת. שמור על צפיפות הזחל למקסימום של 200 עוברים לצלחת וכסה את הצלחות במכסי פלסטיק. דגרו את לוחות הגידול L3 ב-18 מעלות צלזיוס, 60% לחות ומחזור חושך אור של 12, 12 למשך תשעה ימים.

לאחר הדגירה, אספו שלוש קבוצות של 10 L3 מכל אחד מהגנוטיפים שייבדקו, כמו גם קבוצה אחת של 10 L3 לבקרת מזון אפס צבע. השתמש במלקחיים מספר חמש או במשקל נוצה כדי לבצע את איסוף הזחלים בעדינות ככל האפשר. העבירו את הזחלים שנאספו לסירות במשקל צלחת פלסטיק המכילות מיליליטר מים.

הקימו אינקובטור של 30 מעלות צלזיוס ושמרו על רמות לחות גבוהות על ידי הוספת מגש מלא במים כדי למנוע התייבשות זחלים במהלך הבדיקה. אזנו את הטמפרטורה של לוחות הבדיקה על ידי חימום ל-30 מעלות צלזיוס לפני ההתנעה. ודא שכל הצלחות מסומנות עם הגנוטיפ ויחס החלבון לפחמימות של הדיאטה.

הלם חום את זחלי הניסוי למשך שתי דקות על ידי העברה ישירה של סירות הפלסטיק המכילות את החיות לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדר את מספר הטיימרים הנדרש למשך שעה, ולאחר מכן נקז בזהירות את המים מסירות הפלסטיק והעביר את קבוצות L3 מהסירות למרכז לוחות הנכסים. מכסים את הצלחות ומתחילים את הטיימר.

אפשר לזחלים לאכול במשך שעה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך. הפסק את מבחן ההאכלה על ידי העברת הצלחות לאמבטיית קרח. הכן שני מיקרו-צינורות מיליליטר לכל קבוצת L3 שנבדקה המכילה מספיק חרוזי זכוכית של 0.5 מילימטר כדי למלא את החלק התחתון של המיקרו-צינור ו-300 מיקרוליטר מתנול קר כקרח.

השתמש במקרר ספסל כדי לשמור על המיקרו-צינורות קרים. שחזר בזהירות את קבוצות L3 מלוחות בדיקת ההזנה והעביר אותן למכסי הצלחות עם מעט מים. שטפו את הזחלים כדי להסיר שאריות מזון מגופם, תוך הקפדה על מניעת פציעות.

העבירו את הזחלים למיקרו-צינורות המוכנים והעבירו אותם בעזרת לייזר רקמות כדי לחלץ את צבע המאכל מהמעיים. העבירו את התמציות למיקרו-צינורות נקיים של 1.5 מיליליטר על ידי היפוך ישיר של שני המיקרו-צינורות של מיליליטר על הצינורות החדשים. עשו זאת בעדינות כך שרוב חרוזי הזכוכית יישארו בתחתית צינור שני מיליליטר.

נקה את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה של התמציות במהירות מקסימלית ובארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן העביר את הסופרנטנטים לצינורות נקיים של 1.5 מיליליטר. כדי לבצע כימות קלורימטרי של צריכת מזון, הכינו תמיסות סטנדרטיות של צבע כחול על ידי דילול סדרתי אחד עד שניים במתנול. העבירו 100 מיקרוליטר מדגימות הניסוי, התקנים והריק לבארות של מיקרו-פלטה של 96 בארות ומדדו את הספיגה ב-600 ננומטר.

פרוטוקול זה שימש לכימות הכמויות היחסיות של מקרונוטריינטים שנצרכו עבור בעלי חיים תחת הפעלה תרמוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות במערכת העצבים של הזחל. הפעלת אוכלוסיות מובחנות של נוירונים השפיעה באופן משמעותי על איזון המאקרו-נוטריינטים בזחלי כוכב שלישי. דפוס ההזנה שנצפה עבור קו הביקורת, המצוין כאן בצבע אפור, מראה ירידה צפויה בצריכת המזון בדיאטות עם יחס חלבון לפחמימות גבוהות יותר, מה שמדגים את יעילות השיטה.

חמשת המחלקות הפנוטיפיות שנקבעו עבור חיות הניסוי היו לאכול הרבה ולפצות על דילול החלבון על ידי אכילת יתר, לאכול הרבה, אך לא לפצות, לאכול מעט, אך לפצות, לאכול מעט ולא לפצות ולאכול בצורה חריגה. עבור כל אחת מהמחלקות והגנוטיפים הפנוטיפיים הללו, מוצגים דפוסי ה-GFP במערכות העצבים המרכזיות של זחלי כוכב שלישי. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב ליצור זחלים מוקדמים מסונכרנים התפתחותית על מנת למזער את השונות הקשורה להתנהגות בעלי חיים.

בהתאם לפרוטוקול זה, תיוג רדיו של המזונות יאפשר אישור וניתוח נוסף של הפגיעות שנמצאו בשיטות אלה.