אפיון של מאפייני תחבורה תוך סחוס של ספקי פפטיד צ'ציה

אפיון תכונות ההובלה של תרפיה והנשאים שלהם הוא קריטי להבטחת תגובות ביולוגיות יעילות. שיטות אלה מסייעות בתכנון נשאי תרופות טעונים בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא היכולת שלהם לחזות טוב יותר יעילות טיפולית vivo באמצעות סדרה של ניסויים במבחנה המאפיינים תחבורה מסיס דרך רקמות.

מחלות סחוס, כגון דלקת מפרקים ניוונית, נשארות לא מטופלות בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור למטריצת הסחוס הצפופה, הדורשת מנשאי תרופות לפרולוג יעילות טיפולית. התחל באמצעות ניגוב משימה עדין כדי להסיר בעדינות PBS עודף מן המשטחים של קוטר שלושה מילימטר, אחד מילימטר עבה סחוס explants. השתמש באיזון כדי לתעד במהירות את המשקל הרטוב של כל explant ומיד למקם את המתפוצצים לתוך אמבטיה PBS כדי למנוע התייבשות.

לאחר מכן, הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תווי פפטיד קוטיים טריים, 30 מיקרומולרים בעלי תווית קוטית לכל באר ל הבאר הפנימית של צלחת של 96 בארות, ולהשתמש במתית כדי להוסיף תוסף אחד לכל באר של פתרון. מלאו כל אחת מה בארות שמסביב ב-300 מיקרוליטרים של PBS וכסו את הצלחת במכסה. לאטום את הקצוות של הצלחת עם סרט גמיש כדי למזער את האידוי ולהציב את הצלחת על שייקר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ב 50 מהפכות לדקה, עם מסלול 15 מילימטר.

בסוף הדגירה, להעביר את אמבט שיווי המשקל מכל באר לתוך צינורות פוליפרופילן בודדים ולעשות דילול סדרתי מן המניה 30 פתרון פפטיד מיקרומולרי פפטיד כדי ליצור עקומה סטנדרטית. לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל פתרון וסטנדרט לתוך בארות בודדות של צלחת שחורה 96 באר ולקבל קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם וסטנדרט מבוסס על אורך גל העירור והאפלה של התווית פלואורסצנטי. כדי לקבוע את עומק החדירה של נושא פפטיד קטורתי בתוך explant סחוס, להשתמש באזמל לחתוך קוטר שישה מילימטר, אחד מילימטר עבה סחוס explants במחצית לחות חתיכות חצי דיסק וכתוצאה מכך עם מעכב פרוטאוס בתוספת PBS.

החל אפוקסי על מרכז באר של תא תחבורה חד מימדי מעוצב בהתאמה אישית ולאבטח explant חצי דיסק אחד בתוך הבאר עם הצד השטחי של explant מול הצד במעלה הזרם של התא. הסר כל דבק עודף מן באר כדי למנוע מגע עם שטח הפנים דיפוזיה של הסחוס ולהוסיף 80 microliters של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS לשני צידי explant. פיפטה הנוזל למעלה ולמטה בצד אחד של explant כדי לבדוק דליפה לצד השני.

אם אין דליפה, החלף את מעכב פרוטאז בתוספת PBS מהצד במעלה הזרם עם 80 microliters של 30 פלואורסצנטי מיקרומולרי שכותרתו פתרון נושא פפטיד קטורית בזהירות למקם את תא ההובלה לתוך צלחת תרבות התא. מכסים את בסיס המנה עם PBS כדי למנוע אידוי תותב פפטיד קוטי. יש לדאוג לכך שאין מגע ישיר בין הפתרונות מהזרם במעלה הזרם ובמורד הזרם.

מניחים את המנה המוקרה על שייקר כדי להגביל את מסיס החלקיק במשך ארבע או 24 שעות בטמפרטורת החדר ו 50 מהפכות לדקה, עם מסלול 15 מילימטר. בסוף הדגירה, מוציאים את המתפוצצים מהתא וחותכים כ-100 פרוסות בעובי של כ-100 מיקרון ממרכז כל קליפה. מניחים כל פרוסת explant בין שקופית זכוכית להחליק כיסוי לחות את הפרוסות עם מעכב פרוטאז טרי בתוספת PBS.

תקן את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל ולקבל ערימת Z של תמונות פלואורסצנטיות דרך העובי המלא של הפרוסה בהגדלה 10X. פתחו את קובץ התמונה והתמונה J, לחצו על 'תמונה' ובחרו 'ערימות' ו'פרוייקט Z' מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, הזן את מספרי הפרוסה מאחד לפרוסה הסופית ותחת סוג הקרנה, בחר בעוצמה ממוצעת ולחץ על אישור.

כדי להעריך את קצב פיזור הסחוס של נושא הפפטיד שאינו שיווי משקל, להרכיב כל מחצית של תא ההובלה, לכלול אטם גומי אחד גדול, אחד polymethylmethacrylate הכנס, אטם גומי אחד קטן. למדוד את עובי של explant סחוס, ולאחר מכן למקם את explant בארות של מוסיף פלסטיק עם משטח שטחי מול התא במעלה הזרם כריך שני חצאים יחד כדי להשלים את ההרכבה. השתמש מפתח ברגים כדי לדפוק בחוזקה את החצאים יחד לפני מילוי התא במעלה הזרם עם שני מיליליטר של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS.

בדוק את התא במורד הזרם לדליפה מהתא במעלה הזרם. אם לא זוהתה דליפה, מלאו את התא במורד הזרם בשני מיליליטר של מעכבי פרוטאז בתוספת PBS. מוסיפים מיני בר ערבוב יחיד לתאי ההמשך והמורד ומ מניחים את התא על צלחת ערבוב כשהתא מיושר כך שהלייזר מהספקטרופוטומטר ממוקד לכיוון מרכז התא במורד הזרם.

עם חלק מקלט האות של הספקטרופוטומטר מאחורי התא במורד הזרם, לאסוף יציב, בזמן אמת במורד הזרם קריאות פליטת פלואורסצנטיות לפחות חמש דקות. לאחר קבלת קריאה יציבה, הוסיפו נפח מחושב מראש של תווי פפטיד קוטיים בעלי תווית פלואורסצנטית לתא במעלה הזרם לריכוז אמבטיה סופי של שלושה מיקרומולרים, ונטרו את אות הפלואורסצנט במורד הזרם תוך מתן אפשרות להובלה המסיסה להגיע לעלייה מתמדת במדרון. לאחר שהושג מצב יציב, העבר 20 מיקרוליטרים של פתרון מהתא במעלה הזרם לתא במורד הזרם למבחן ספייק ולאסוף את קריאות הפלואורסצנטיות בזמן אמת במורד הזרם.

מטען חיובי גבוה מדי יגביל חדירה מסיס לאזור השטחי כמו המוביל נקשר חזק מדי לקבוצות aggrecan טעון שלילית של מטריצת הסחוס. לעומת זאת, נשאים שמצליחים לנצל אינטראקציות מטען חלשות והפיכות חודרים דרך האזור העמוק של הרקמה. נושאת סמים טעונה בצורה אופטימלית, עם זאת, לא רק לחדור את האזורים העמוקים של רקמה, אלא גם להפגין ספיגת פנים-רקמה גבוהה, אשר ניתן לקבוע באמצעות מדידות פלואורסצנטיות של אמבט שיווי המשקל ומשקל רטוב רקמות, כפי שמוצג.

ניסויי הובלת דיפוזיה שאינם שיווי משקל גורמים לעקומה שנוצרת על-ידי נתונים עם שיפוע הולך וגדל בהדרגה. החלק הראשוני של העקומה מייצג דיפוזיה מסיס דרך הסחוס כמו אינטראקציות מחייב מטריצה מסיס להתרחש. ברגע שמסיסים מגיעים לתא במורד הזרם, שיפוע העקומה עולה ככל שקריאות הפלואורסצנטיות גדלות עם הזמן.

חלק שני זה של העקומה מגיע לאחר מכן למדרון יציב, המייצג דיפוזיה מצב יציב. ה- X-intercept של קו משיק שצויר בחלק המצב היציב של העקומה מציין את הזמן שלוקח להגיע לפזר מצב יציב או השהיה טאו. בעקבות העברת פתרון מן הזרם אל התא במורד הזרם, עלייה חדה פלואורסצנטיות נצפתה, ובנקודה זו את עוצמת הפלואורסצנטיות מיוצבת ניתן להשתמש כדי לתאם את הפלואורסצנטיות לריכוז.

לאחר מכן ניתן לחשב את ערכי ההתפזרות היעילים הייצוגיים ואת ערכי פיזור המצב היציב, כפי שצוין. שים לב כי דיפוזיביות מצב יציב הוא שני סדרי גודל גבוה יותר מאשר דיפוזיביות יעילה כתוצאה של כל אתרי איגוד מבוססי תשלום להיות כבוש. לכן, בשלב זה, דיפוזיה מבוססת על גודל ולא טעינה, וכתוצאה מכך ערכי דיפוזיה מצב יציב דומה בקרב CPCs באותו גודל.

לשמור על הידרציה של explant ולמזער את אידוי התספורת לאורך כל הניסוי כדי למנוע שינויים במורפולוגיה של הסחוס ובריכוז הפתרון, בהתאמה, ולהבטיח רכישת נתונים מדויקת ותרבה. בעקבות העיצוב של נושאת סמים טעונה בצורה אופטימלית, טכניקות התייחדות שונות ניתן להשתמש כדי לשנות תרופות עבור מיקוד רקמות משופרת כדי להקל על הערכת היעילות הביולוגית שלהם.