מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

פרוטוקול cPILOT האוטומטי שלנו מקל על החוקרים לנתח דגימות באופן בעל תפוקה גבוהה. זה משמעותי כי זה מאפשר לנו להגיע למידע ביולוגי על מחלות או תנאים שונים הרבה יותר מהר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה עוזר לעבד דגימות מרובות במקביל, ובכך להפחית שגיאות לפעולה תוך שימוש בדגימות תפוקה גבוהה.

המעבדה שלנו מעוניינת ביישומים הקשורים להזדקנות ומחלת אלצהיימר. עם זאת, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד כל מחלה או אתגר שבו יש רקמות ביולוגיות מעורבים. התחל בהדלקת מנגנון הלחץ החיובי, מכשיר החימום והקירור ומשאבות הוואקום.

חבר את כל האביזרים עם המטפל בנוזלים, אשר יראה אור כחול פעם אחת המחובר למחשב ומוכן לפעולה. Aliquot 300 microliters של הכבד הומוגנית לתוך צינור 500 microliter ולה מניחים אותו על צלחת באר עמוקה שני מיליליטר. אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד לתחילת הפרוטוקול.

פתח את השיטה בתוכנה והצב את הטיפים וכלי המעבדה הנדרשים בעמדותיהם. לאחר מכן בצע הצלבה עם פריסת החפיסה הסופית ולחץ על הבא כדי להמשיך בפרוטוקול. לטעון 230 טיפים microliter ושוגם 90 microliters של שמונה אוריאה טוחן מהמאגר.

ואז לחלק אותו לחתור אחד שחור שני מיליליטר עמוק צלחת היטב. לפרוק את העצות של TL1 ולחזור על שלב זה עד אוריאה נוספה לכל הבארים. לאחר הוספת חיץ denaturation, להשתמש 90 טיפים microliter להעביר 10 microliters של כבד העכבר הומוגנית לצלחת באר עמוקה.

לפרוק את הטיפים, ולאחר מכן לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוגם שלושה microliters של DTT מצלחת reagent אחד. לוותר על DTT לשורות 1 ו -2 של צלחת באר עמוקה. לאטום את צלחת המדגם עם רדיד אלומיניום דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 600 שניות תוך סיבוב ב 300 סל"ד.

לאחר הדגירה, לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter, שאף שישה microliters של IAM מצלחת reagent אחד בשורה שלוש, ולחלק אותו בשורה אחת של צלחת המדגם. אטמו את צלחת הדגימה והדגירה אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב במהירות של 300 סל"ד במכשיר הקירור. לאחר מכן בטל את חתימה של לוח הדגימה וטען שורה אחת של 90 טיפים מיקרוליטר.

שאפו חמישה מיקרוליטרים של ציסטין מצלחת הריג'נט אחת בשורה השנייה וחלקו אותה לשורות 1 ו-2 של צלחת הדגימה. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, בצע טלטול מתוזמן של 1800 סל"ד במשך 30 דקות.

לאחר מכן להוסיף 800 microliters של 20 מילימולר טריס חיץ עם 10 מילימולר סידן כלורי לכל באר על צלחת המדגם כדי לדלל את ריכוז אוריאה לשתי טוחנות. הוסף 20 microliters של טריפסין לשורה הראשונה של צלחת 96 היטב למקם את הצלחת במיקום מסוים על הסיפון. לאחר הוספת טריפסין לצלחת המדגם, לאטום אותו למדוד אותו במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 600 סל"ד על מכשיר חימום וקירור.

לעצור את העיכול על ידי שאפת 150 microliters של 5% חומצה פורמית משורה שלוש של צלחת חומצה פורמית ולחלק אותו לצלחת המדגם בשורות אחת ושתיים. המשך להתפלת הפפטידים. השתמש 1070 טיפים microliter לשאוף 600 microliters של אצטוניטריל.

לאחר מכן לוותר אותו בשורות אחד ושתיים של מיצוי פאזה מוצק, או צלחת SPE, כדי להפעיל C-18. לאחר מכן, לטעון את המדגם מתעכל לצלחת SPE בשני מעברים. לטעון שתי שורות של טיפים, שאפו 534 מיקרוליטרים של הדגימות המתעכלות, וחלקו אותן לשורות 1 ו-2 של צלחת ה-SPE.

יש להפעיל לחץ על הצלחת ולחזור על שלב זה עד שכל הדגימות ייטענו. נקו את הפפטידים על ידי שטיפה במים ודללו את הפפטידים עם 60 עד 40 אצטוניטריל בחומצה פורמית של 0.1%. לאחר מכן מניחים את הצלחת על גבי צלחת אוסף כדי ללטף את הפפטידים באמצעות מנגנון הלחץ החיובי.

משוך מטה את הזרימה והגדר את העצות וכלי המעבדה הדרושים בתוכנה, הצלב עם פריסת החפיסה ולחץ על הבא כדי להמשיך את הפרוטוקול לדימתילציה. יש לייפס מחדש את הפפטידים בחומצה אצטית של 1%. כדי לבצע תיוג דימתילציה, לטעון 90 טיפים microliter ושוכם 16 microliters של פורמלדהיד אור 60 מילימולר משורה השנייה של צלחת reagent שני.

מחלקים אותו לשורה אחת מצלחת הדגימה, ואז פורקים את העצות. לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוכם 16 microliters של 60 מילימולרים פורמלדהיד כבד משורה שלוש של צלחת reagent 2. לוותר עליו שורה שתיים של צלחת המדגם ולפרוק את הטיפים.

לטעון שתי שורות של 90 טיפים microliter ו שאיפה 16 microliters של 24 מילימולר נתרן cyanoborohydride ו 24 מילימולאר נתרן ציאנובורדוטרייד משורות 1 ו -2 של צלחת ריאגנט שלוש, ולאחר מכן לחלק את ריאגנטים לשורות אחד ושניים של צלחת מדגם כדי להתחיל את תגובת דימתילציה. לפרוק את הטיפים ולהשתמש שייקר מסלולית לבצע טלטול מתוזמן במשך 15 דקות ב 1800 סל"ד. לאחר מכן לטעון שתי שורות של 90 טיפים microliter ושוכם 32 microliters של 1% אמוניה משורות שלוש וארבעה של לוח reagent שלוש.

מחלקים אותו לשורות 1 ו-2 של צלחת מדגם 2 כדי לעצור את התגובה. שלבו כמויות שוות של פפטידים קלים וכבדים עם דימתילציה בצלחת באר עמוקה חדשה של שני מיליליטר להתפלה. לאחר התפלת הפפטידים הקלים והכבדים המשולבים, ייבשו את הפפטידים ובצעו תיוג isobaric.

מחדש את הפפטידים עם 100 מיקרוליטר של חיץ טריאתילמוניום ביקרבונט 100 מילימולארי על שייקר מסלולי. לאחר מכן השתמש 90 טיפים microliter כדי לשאוף 25 microliters של פפטידים dimethylated בשילוב ולחלק אותם לשורה הראשונה של צלחת עיבוד TMT. לטעון שורה אחת של 90 טיפים microliter ושוגם 10 microliters של TMT.

לוותר עליו בשורה הראשונה של לוח העיבוד TMT, לפרוק את העצות, ולאחר מכן לבצע טלטול מתוזמן במשך שעה אחת ב 1800 סל"ד. שאפו שמונה מיקרוליטרים של הידרוקסילאמין משורה 2 של צלחת TEAB וחלוקתו לשורה אחת של צלחת העיבוד TMT. לאחר 15 דקות של טלטול ב-1800 סל"ד, העבר 30.5 מיקרוליטר של הפפטידים המסומנים ב-TMT לצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן המשיכו ברכישת נתונים וניתוחם בהתאם לכיווני כתב היד. נתוני MS מייצגים של פפטיד שזוהו בכל 22 ערוצי היונים הכתבים מ- 22 Plex משולבים תיוג isotopic וניסוי תיוג isobaric מוצג כאן. רצף הפפטיד מתאים לבטאין-הומוציסטאין S-מתילטרנספראז.

היונים האינטנסיביים ביותר עבור פסגות דימתילציה קלות וכבדות היו מבודדים עוד יותר עבור פיצול MS3. התעצמות היונים של הכתב פרופורציונלית ישירות לשפע הפפטידים בדגימה. בסך הכל, ניסוי משולב זה של תיוג איסוטופי ותיוג isobaric הפחית את זמני העיבוד של הדגימה ואי אפשר לדמיין את ביטוי החלבון בערוצים או בתנאים מרובים.

עלילת התיבה של שפע יומן 10 לעומת התעצמות יון הכתב הכולל על פני כל 22 הערוצים מראה שונות בין טוב פחות או בין מדגם. הערכת האוטומציה הכוללת נעשתה על ידי בחינת השגיאה בשפע היונים הכתבים בכל חלבון ב-22 הדגימות. עיבוד מדגם עם הפלטפורמה הרובוטית הביא מקדמים נמוכים מאוד של וריאציה.

על פני 3098 פפטידים, המקדם הממוצע של וריאציה בשפע יונים הכתב היה 12.36 ו 15.03% עבור פפטידים דימתילציה קלה וכבדה בהתאמה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי רמות isotopic ו isobaric משמשים בניסוי אחד. לפיכך, תכנון זהיר צריך להתבצע כדי לייעד כל מדגם עם התגים שנועדו לשמש בניסוי.

שיטה זו יכולה להיות משולבת בקלות במערכות רובוטיות אחרות, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רקמות, כגון רקמות או לייסטים תא וביופלואידים אחרים.