דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שאנו לומדים שגליה היא הטרוגנית אזורית, מורפולוגית, תפקודית וגנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לחקור שלוש תת-קבוצות גליה נפרדות מארבעה אזורים נפרדים של מערכת העצבים המרכזית. מי שמדגים את ההליך הזה אני ורייצ'ל טינקי, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.

השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את השכבה העורית לאורך קו האמצע של ראש הגור, התחל בזנב והזיז את הרוסטרל עד שהגיע לחוטם. הימנע מחיתוך עמוק לתוך הגולגולת כדי למנוע נזק לרקמות. זווית הראש כלפי מטה, משוך את השכבה העורית לכל צד של הגולגולת והשתמש במספריים קפיציים כדי לבצע חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת, החל מהנקב מגנום.

משוך את חצאי הגולגולת זה מזה בעזרת מלקחיים עדינים החושפים את קליפת המוח, המוח הקטן וגזע המוח. לאחר החשיפה, הרימו בעדינות את המוח מהגולגולת והניחו אותו בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר PBS ותמיסת אנטיביוטיקה. ודא שהמוח נשאר ללא נזק כשהמוח האחורי מחובר.

צבטו את המוח הקטן בעזרת מלקחיים מעוקלים עדינים מניחים בצינור חרוטי ייעודי של 15 מיליליטר על קרח. הפרד את המוח האמצעי מקליפת המוח.

הסר את קרומי המוח בקליפת המוח והנח אותו בצינור חרוטי ייעודי. יש לבחון היטב את הרקמה כדי להבטיח הסרה מלאה של קרומי המוח. אם תאי קרום המוח נשארים בתרבית, הם עלולים להזיק לצמיחת תאי גליה.

כדי לנתח את חוט השדרה, הניחו אותו עם הצד הגחוני כלפי מעלה והשתמשו במספריים קפיציים עדינים כדי לחתוך את החוליות, לסירוגין בין הצד השמאלי והימני עד לחשיפת רקמת חוט השדרה. הסר בעדינות את חוט השדרה ואת קרומי המוח והנח אותם בצינור החרוטי המיועד על קרח. הוסף מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין עם 0.53 מילי-מולרי EDTA לכל צינור עם רקמה.

יש לשלוש את התערובת עם פיפטה של 10 מיליליטר כ -20 פעמים. לאחר מכן העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי ריק של 50 מיליליטר. דגרו את התמיסה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 15 דקות.

מערבבים בעדינות את הליזטים לאחר שמונה דקות. לאחר הדגירה, הוסף חמישה מיליליטר MGM ו -200 מיקרוליטר DNase I אחד לכל צינור לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. משולש כל ליזט 10 פעמים עם פיפטה של 10 מיליליטר.

לאחר מכן הניחו לתרחיף התא לשבת במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לרקמה לא מנותקת להתיישב בתחתית הצינור. העבירו את תרחיפי התאים לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר והשאירו מאחור את הרקמה הלא מנותקת. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של MGM וטריטוציה אותו 20 פעמים צלחו את תרחיפי התאים על צלוחיות T25 מצופות ודגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

החלף את המדיה לאחר 24 שעות כדי להסיר פסולת תאים. כדי לבצע בידוד תאי קודמן של אוליגודנדרוציטים, נערו את התאים למשך 15 שעות, ואז הוציאו את הסופרנטנט מהבקבוק וצלחו אותו על צלחת פטרי סטרילית. דגרו על הסופרנטנט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות.

מסתובב לאחר 15 דקות כדי להסיר את שאריות המיקרוגליה. הסר תאים שאינו נדבק, ספור את התאים וצלח אותם על משטח מצופה פולי-D-ליזין בריכוז הרצוי. החזירו את התאים לחממה למשך שעה לפחות.

לאחר מכן שאפו בעדינות 95% מהמדיה והוסיפו לאט לאט מדיית OPC חמה, תוך הצמדה לדופן הבאר כדי למזער את ההפרעה ל-OPCs. שיטה זו שימשה כדי להדגים כי איתות גמא אינטרפרון משפיע על התמיינות והתבגרות OPC. ללא קולטן גמא אינטרפרון, OPCs בקליפת המוח אינם מתמיינים לאוליגודנדרוציטים מיאליניים בוגרים אומר בקלות, מה שמעיד על היעדר צביעת MBP.

הביטוי של GFAP נותח גם הוא. תאים חסרי אינטרפרון גמא מבטאים חזק GFAP, מה שמרמז על כך שהם עשויים לאמץ פנוטיפ אסטרוציטי. הטרוגניות אזורית בתאי מערכת העצבים המרכזית מעידה על ידי מורפולוגיה משתנה של אסטרוציטים בקליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וחוט השדרה.

אסטרוציטים מאותו אזור עשויים גם להפגין הטרוגניות מורפולוגית, מה שתומך ברעיון שתת-סוג גליאלי זה הוא דינמי מאוד. נבדקו גם תגובות אזוריות של OPCs לגירוי ציטוקינים דיפרנציאלי. איתות ציטוקינים משפיע באופן משמעותי על התנהגות תאי הגזע והחיסון ועשוי להשפיע על האופן שבו ה-OPCs מתמיינים לאוליגודנדרוציטים מיאלינים בוגרים.

לאחר בידוד תאי גליה אזוריים ניתן להשתמש בתאי בידוד במגוון תנאי ניסוי וחומצה באמצעות מספר טכניקות כולל אימונוהיסטוכימיה, PCR כמותי בזמן אמת וכתמים מערביים.