עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

פרוטוקול זה נועד לעכל עיני עכבר שלמות לתרחיף תא בודד עבור ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית של פגוציטים חד-גרעיניים הכוללים מקרופאגים, מונוציטים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להשתמש בניתוח כמותי עם עוצמת פלואורופור כדי להבדיל בין סוגי תאים קרובים באמצעות ביטוי סמני פני התא. הפרוטוקול שלנו מותאם לניתוח הטרוגניות של מקרופאגים, כולל אוכלוסיות תושבות ומסתננות במודל הניאו-וסקולריזציה הכורואידלי המושרה על ידי לייזר.

עם זאת, ניתן ליישם מושגים וטכניקות אלה באותה מידה על מודלים אחרים כמו רטינופתיה סוכרתית, אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית, כמו גם ביטויים של זאבת. כאשר מנסים פרוטוקול זה, הבנת תצורת הציטומטר שלך היא נקודת התחלה קריטית מכיוון שכל הציטומטרים אינם מוגדרים בדיוק באותו אופן. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לטטר כמויות של נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ו/או להתאים פלואורופורים כדי לייעל את הפרוטוקול על סמך תצורת הציטומטר שלך.

התחל בהכנת מאגר העיכול לפי הוראות כתב היד. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה והגדלה כוללת פי 10, הסר את הלחמית ועצב הראייה שנותרו מהעיניים. העבירו עיניים נקיות לכלי ניתוח יבש או לסירה קטנה במשקל, ואז צרו שני פצעי ניקוב עם זווית של 90 מעלות ביניהם דרך ציר הראייה.

השתמש במזרק עם מחט בגודל 30 כדי להזריק 0.15 עד 0.2 מיליליטר של חיץ עיכול לחלל הזגוגית של כל עין. טחנו את העיניים עם מספריים קפיציים ומלקחיים עדינים, ואז נתקו את רקמת העדשה עם שיבוש מכני קהה כדי למנוע סתימת קצות פיפטה בשלבים הבאים. שוטפים את המלקחיים והמספריים עם 0.75 מיליליטר של חיץ עיכול ומחליפים את המנה לכל דגימה.

השתמש בפיפטה P1000 כדי להעביר את תכולת המנה לצינור דיסוציאציה על קרח, תוך הקפדה לא לאבד שום חומר. שוטפים את המנה עם 1.5 מיליליטר נוספים של חיץ עיכול ומוסיפים אותו לצינור הדיסוציאציה, מה שמביא את הנפח הכולל בין 3.25 ל -3.5 מיליליטר. נתק את הרקמה על דיסוציאטור אלקטרוני כמתואר בכתב היד של הטקסט, וודא שכל הרקמה נמצאת בתחתית צינור הדיסוציאציה ההפוך ובמגע עם מאגר העיכול.

לאחר מכן דגרו את צינור הדיסוציאציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך 30 דקות. חזור על דיסוציאציה של הרקמה פעמיים נוספות, תוך דגירה של הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך 30 דקות בין הדיסוציאציות. כדי לעצור את התגובה, הוסף 10 מיליליטר של מאגר זרימה קרה והנח את צינורות הדגימה על קרח.

כדי ליצור תרחיף תא בודד, מסננים את תגובת עיכול העין המופסקת דרך מסנן של 40 מיקרומטר המונח על גבי צינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר. השתמש בבוכנה ממזרק של 2.5 מיליליטר כדי לדחוף את כל החלקים שנותרו של רקמת עין לא מעוכלת דרך המסנן. שוטפים את צינור הניתוק עם 10 מיליליטר מאגר זרימה ושוטפים את המסנן.

לאחר מכן השתמש באותה בוכנה כדי להעביר שוב את חלקי רקמת העין הלא מעוכלים דרך המסנן. חזור על תהליך זה עם חמישה מיליליטר של מאגר זרימה. לאחר מכן שטפו את צינור הדיסוציאציה וסננו עם 10 מיליליטר אחרונים של מאגר זרימה.

צנטריפוגה של הצינור החרוטי ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. פרק את הגלולה על ידי החלקת הצינור על צינור אחר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ליזינג וסובבו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות כדי לליז את כדוריות הדם האדומות.

עצור את התגובה עם 20 מיליליטר של מאגר זרימה וצנטריפוגה של הצינור החרוטי ב -400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. החלק את הצינור על צינור אחר.

לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר HBSS קר. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. הוסף 0.5 מיליליטר של כתם מת חי לכל דגימה באמצעות פיפטה P1000, הקפד לנתק את הגלולה לחלוטין.

העבירו את הדגימות לצינורות מיקרוטיטר של 1.2 מיליליטר ודגרו אותן למשך 15 דקות בחושך. בינתיים, ספרו 10 מיקרוליטר של הדגימה עם טריפאן כחול והמוציטומטר. לאחר הדגירה יש לשטוף כל דגימה על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מאגר זרימה קרה.

צנטריפוגה של הצינורות במדף צינור מיקרוטיטר ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושואבת את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. השעו מחדש את התאים לחלוטין ב -500 מיקרוליטר של מאגר זרימה קרה. לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

חסום עד חמישה מיליון תאים חיים ב-50 מיקרוליטר של בלוק FC. נתק לחלוטין את כדור התא ודגר אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים לכל דגימה.

מערבבים אותו לגמרי ומדגרים עליו עוד 30 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. מאפייני אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי עבור כל האירועים שנותחו משתי עיניים של עכבר יחיד מוצגים כאן. ספירת החרוזים נוקתה ואושרה על ידי התוויית PE על APC-Cy7, מה שיצר מקבץ הדוק של אירועים חיוביים PE ו-APC-Cy7 שליליים.

לאחר מכן, זוהו סינגלטים בתאים חיים מכל האירועים. סינגלטים היו בקורלציה חיובית בגובה הפיזור הקדמי לעומת שטח הפיזור קדימה בעוד שלתאים כפולים ושלישיות היה שטח פיזור גדול יותר מגובה הפיזור הקדמי. תאים חיים הם חיוביים לאזור הפיזור קדימה וכתם מת חי שלילי.

אסטרטגיית השער הראשונית לתיחום פגוציטים חד-גרעיניים מתאי סינגל חיים מוצגת כאן. סינגלטים חיים הודגמו באמצעות תרשים CD45 לעומת CD11b. היעדר תאים חיוביים CD45 ב-CD45 FMO אישר את בחירת השער.

לאחר מכן, נויטרופילים, אאוזינופילים, תאי B ותאי K ותאי T לא נכללו על ידי התוויית סינגלטים חיים חיוביים ל-CD45 עם שער שושלת לעומת CD11b. תאים CD45-DIM הובחנו מתאים בעלי CD45 גבוה. זוהו גם תת-קבוצות של מקרופאגים.

מיקרוגליה הוגדרה בתאי CD45-dim עם צביעה נמוכה של MHC2 חיובי CD64. מקרופאגים שליליים MHC2 זוהו כ-CD64 חיובי MHC2 שלילי. מקרופאגים CD11c שליליים וחיוביים ל-CD11c הודגמו כ-CD64 חיובי CD11c שלילי.

ו-CD64 חיובי CD11c חיובי בתאים החיוביים ל-MHC2. נמצא כי טיפול בלייזר הגדיל את כמות המקרופאגים החיוביים MHC2, CD11c שליליים ו-CD11c חיוביים. ספירת התאים הדנדריטיים הווסתה גם היא על ידי טיפול בלייזר בעוד שספירת מיקרוגליה ומונוציטים לא הושפעו.

לזלוף מערכתי לא הייתה השפעה על מספרי המקרופאגים. בעקבות הליך זה, מיון תאים המופעל על ידי פלורסנט ולא ניתוח בלבד מאפשר אפיון של הטרוגניות מקרופאגים והשפעתה על התפקוד באמצעות מחקרים טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים.