Name: עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למד עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מאקרופאגים, מיקרוגליה ותאי דנדריטיים בעין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAL נתמכה על ידי מענק NIH K08EY030923; CMC נתמך על ידי מענק K01 (5K01AR060169) מהמכון הלאומי NIH למחלות דלקת פרקים ושרירים ומענק מחקר חדשני (637405) מברית המחקר זאבת.

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. עכברי C57BL/6 שוכנו במתקן מחסום במרכז לרפואה השוואתית באוניברסיטת נורת'ווסטרן (שיקגו, אילינוי). כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור / כהה של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.
1. אוסף רקמת עיניים
<ol><li>להקריב עכברי C57BL/6J בני 10-12 שבועות משני המינים באמצעות ניהול מוסדר של פחמן דו חמצני עד שהעכבר לא מגיב וכבר לא שואף. בצע נקע בצוואר הרחם או שיטה משנית מאושרת אחרת כדי להבטיח המתת חסד. הערה: ניתן לבצע זלוף טרנסקרדיאלי כדי להסיר לויקוציטים במחזור שאינם ברקמות העין. בניסוי זה, זלוף מערכתי אינו מפחית את מספר המיקרוגליה, המונוציטים, המקרופאגים או התאים הדנדריטיים שזוהו בעיניים שלמות שאינן מטופלות או שטופלו בלייזר. לכן, רוב סוגי התאים האלה ממוקמים ברקמות העיניים וצעד זה הוא אופציונלי.</li>
	<li>כדי להסב את העיניים, לדחוף למטה ליד ארובת העין תוך הצבת זוג מלקחיים מעוגלים בעדינות מתחת לעין כפי שהוא בולט מתוך השקע. מלקחיים קמצוץ סגור מתחת לעין מבלי ללחוץ את העין בפועל. לעקור את העין מן הלחמית שמסביב (ראה פרסום מוקדם)23.</li>
	<li>משוך את העין לרוחב עד עצב הראייה הוא הקשר היחיד שנותר כדי לנתק את העין. עצב הראייה לעתים קרובות מנתק עם מתח, אבל מספריים קטנים לפעמים יש צורך לחתוך את עצב הראייה. מניחים את העין בתמיסת מלח אגירה (HBSS) קרה של האנק עם סידן ומגנזיום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.</li>
</ol>2. עיכול רקמת העין
<ol><li>הכינו את מאגר העיכול המכיל אנזים עיכול של 0.1 מ"ג/מ"ל ו-0.2 מ"ג/מ"ל DNase ב-HBSS קר. לשקם 5 אנזים עיכול מ"ג ב 2 מ"ל של מים סטריליים בתחילה. הכן דילול ראשוני של 10 מ"ג / מ"ל DNase ב- HBSS. עבור כל 10 מ"ל של מאגר העיכול (מספיק עבור 3 בעלי חיים) לערבב 9.4 מ"ל של HBSS קר עם 0.4 מ"ל של אנזים עיכול מחדש ו 0.2 מ"ל של DNase אני מדולל. הערה: ריכוזים אלה נקבעו באופן אמפירי על פני ניסויים מרובים כדי לספק רמות אופטימליות של כתמי נוגדנים של תאים בודדים, תוך הפחתת מוות של תאים. Collagenase D נוסה כחלופה אנזים עיכול עם יכולת הכדאיות התא מופחתת וירידה CD45+ תאים. נא עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים אודות התהליך האיטרטיבי למיטוב העיכול.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה כוללת של פי 10, הסר את הלחמית הנותרת ואת עצב הראייה באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים אביביים ב- HBSS קר.</li>
	<li>מעבירים עיניים נקיות לצלחת ניתוח יבשה או לסירת שקילה קטנה. להזריק 0.15-0.20 מ"ל / עין של מאגר העיכול באמצעות מזרק מצויד 30 G מחט לתוך החלל הזגוגי לאחר שני פצעים מחוררים נעשים בעין דרך הציר החזותי ו 90 ° מן הפצע הראשון הזה עבור יציאת חיץ העיכול.</li>
	<li>יש למרוח עיניים שלמות באמצעות מספריים אביביות ומלקחיים עדינים עם כל החלקים הקטנים מ-0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ. לנתק את רקמת העדשה עם הפרעה מכנית בוטה באמצעות מלקחיים כדי למנוע סתימת טיפים פיפטה בשלבים הבאים. עבור כל דגימה, לשטוף מלקחיים ומספריים כל אחד עם 0.75 מ"ל של חיץ העיכול לתוך צלחת קטנה. השתמשו בצלחת חדשה לכל דגימה.</li>
	<li>להעביר את התוכן של המנה לצינור דיסוציאציה על קרח באמצעות P1000 פיפטה מקפיד לא לאבד כל חומר בהעברת פיפטה. יש לשטוף את המנה עם 1.5 מ"ל נוספים של חיץ עיכול ולהביא את הנפח הכולל בצינור הדיסוציאציה ל-3.25-3.50 מ"ל.</li>
	<li>מניחים את צינור הדיסוציאציה הפוך על דיסוציאטור אלקטרוני ולהפעיל מחזור "m_brain_03_01", המורכב סיבוב חד כיווני 1 דקות ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר, שהיא תוכנית טעונה מראש. ודא שכל הרקמות נמצאות בתחתית צינור הדיסוציאציה במגע עם מאגר העיכול והרוטור לכך ולכל השלבים הנותרים.</li>
	<li>מניחים את צינור הדיסוציאציה באינקובטור רועד במשך 30 דקות ב 200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעם נוספת. לאחר דגירה שנייה של 30 דקות לבצע עיכול מכני אחד אחרון באמצעות דיסוציאטור אלקטרוני כמו בשלב 2.6.</li>
	<li>לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ זרימה קרה ומניחים צינורות על קרח.</li>
</ol>3. הכנת השעיית תאים
<ol><li>כדי ליצור השעיה חד-תאית, יוצקים את תגובת עיכול העיניים המופסקת באמצעות מסנן 40 מיקרומטר המונח על החלק העליון של צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. באמצעות הכוען ממזרק 2.5 מ"ל, לדחוף את כל החלקים הנותרים של רקמת העין מעוכל דרך המסנן.</li>
	<li>לשטוף את צינור הדיסוציאציה עם 10 מ"ל של מאגר זרימה ולשטוף מסנן לפני השימוש בוכנה אותו שוב להעביר חתיכות רקמת העין מעוכל דרך המסנן.</li>
	<li>חזור על שלב 3.2 באמצעות מאגר זרימה של 5 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את צינור הדיסוציאציה ולסנן עם 10 מ"ל הסופי של מאגר זרימה. הערה: נפח כולל של עיכול ומאגר זרימה הוא כ 38-40 מ"ל עבור כל מדגם.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.</li>
	<li>הכן פתרון lysing 1x על ידי הוספת פתרון lysing 10x למים סטריליים. לשבור את גלולה על ידי הבהוב צינור נגד צינור אחר. כדי ליזות כדוריות דם אדומות, להוסיף 1 מ"ל של 1x lysing פתרון עבור 30 s עם מערבולת בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>עצור את התגובה עם 20 מ"ל של מאגר זרימה.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תכריז על העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא.</li>
	<li>נתק את גלולה על ידי החלקת צינור נגד צינור אחר. הוסף 5 מ"ל של קר 1x HBSS לכל צינור.</li>
	<li>צינורות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף על טבעי.</li>
</ol>4. הכתמת השעיית תאים עבור פיגוציטים מונונוקולריים
<ol><li>הכן 0.5 מ"ל של כתם חי / מת לכל מדגם על ידי דילול צבע חי / מת 1:5,000 ב HBSS קר.</li>
	<li>הוסף כתם חי / מת לכל דגימה באמצעות פיפטה P1000 הקפד לנתק את גלולה לחלוטין. העבר דגימות לצינורות 1.2 מ"ל מיקרו טיטר.</li>
	<li>קח aliquot קטן (10 μL) כדי לספור תאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי (ראה 4.4). דגימות דגירה עם כתם חי / מת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות Trypan כחול כדי לקבוע את מספר התאים החיים לכל מדגם. הערה: בדרך כלל, 2 עיניים מעכבר C57BL/6J בן 10-12 שבועות מכילות פחות מ- 2 x 106 תאים חיים.</li>
	<li>לשטוף דגימות על ידי הוספת 400 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.</li>
	<li>Resuspend תאים לחלוטין ב 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.</li>
	<li>חסום עד 5 x 106 תאים חיים ב- 50 μL של בלוק Fc (דילול של 1:50 במאגר זרימה קר של CD16/CD32 נגד עכבר מטוהר). אם יותר מ 5 x 106 תאים חיים, להגדיל את הנפחים כראוי.</li>
	<li>הוסף בלוקF c לכדור הקפד לנתק לחלוטין את המדגם. דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הוסף 50 μL של פתרון כתמי נוגדנים (ראה טבלה 1 לבחירה וכמות של כל נוגדן הכלול בתמיסה) לכל 5 x 106 תאים חיים ישירות לתאים בבלוק Fc ומערבבים לחלוטין. דגירה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: כמויות הנוגדנים תלויות בתצורת ציטומטר הזרימה ויש לצייןן באופן עצמאי עבור כל מעבדה ומכשיר. ראה טבלה 2 לקבלת תצורת כלי נגינה של מסננים ושיקוף. כדי לצייץ נוגדנים, התחל בהמלצת היצרן וחשב את מדד הכתמים. בצעו בדיקה של ריכוזי נוגדנים שונים (מעל ומתחת להמלצת היצרן) ובחרו את הריכוז הנמוך ביותר של נוגדנים שבהם נשמר מדד הכתמים. כמו כן, ודאו שצביעה חיובית פחות בהירה מהפקד בצבע אחד. השתמש בתאים לא מוכתמים כדי להבטיח כי תאים מוכתמים שלילית הם בקנה מידה ויש להם שיא או פחות מ 1 x 102. השתמש בפלואורסצנטיות פחות פקד אחד כדי להגדיר את התאים המוכתמים באופן חיובי.</li>
	<li>לשטוף דגימות על ידי הוספת 700 μL של מאגר זרימה קרה. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.</li>
	<li>באופן אופציונלי, לאחר כתמי נוגדנים, ניתן לתקן את הדגימות עם 500 μL של 2% paraformaldehyde במאגר זרימה. תיקון דגימות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצע שטיפה אחת כמתואר ב- 4.10. אחסן דגימות קבועות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף חרוזי ספירה ביום איסוף נתוני ציטומטריית זרימה. דגימות קבועות צריך להיות מופעל על cytometer זרימה ב 1-2 ימים. התראה: Paraformaldehyde הוא מאכל ומפגע בריאותי.</li>
	<li>לשטוף דגימות שוב באמצעות 500 μL של מאגר זרימה קר. צינורות צנטריפוגה בארון צינור מיקרו טיטר ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף מחצית supernatant מבלי להפריע גלולת התא.</li>
	<li>Resuspend כדורי ולהעביר ל 96 גם, U-bottom assay צלחת. צלחת צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. כדי לגנות את העל-טבעי, הפכו את הצלחת ותוך טלטול חזק אחד סלקו את הנוזל לתוך כיור, מבלי להפריע לכדור.</li>
	<li>בצינור חדש של 1.2 מ"ל מיקרו טיטר, מניחים 50 μL של חרוזי ספירה מערבולת היטב.</li>
	<li>גלולות resuspend ב 96 צלחת היטב ב 200 μL של מאגר זרימה קר. הוסף תערובת תאים על החלק העליון של חרוזים משלב קודם. לרוץ על ציטומטר זרימה בנפח כולל של 250 μL / צינור טיטר מיקרו.</li>
</ol>5. איסוף נתוני ציטומטריית זרימה
<ol><li>הפעל והכן ציטומטר זרימה. ההוראות המפורטות להלן הן עבור סיטופומטר לייזר שונה (טבלה 2).</li>
	<li>הפעל דגימת בדיקה, הכוללת aliquot קטן מכל מדגם, כדי להבטיח כי כל התאים נמצאים בקנה מידה עבור כל גלאי. כוונן מתחים כך שכל התאים יהיה בקנה מידה.</li>
	<li>הפעל פקדי צבע בודדים (SCC) עבור כל פלואורופור המשמש לקוקטייל מכתים(שולחן 3). מניחים צינור מיקרו טיטר לתוך צינור פוליסטירן גדול יותר 5 מ"ל למיקום על שלב סייטומטר זרימה. הערה: פלואורים שורש כמו BV421 (כחול האוקיינוס השקט), FITC, PE, Alexa647 (APC), ו Alexa700 אינם דורשים נוגדן זהה לקוקטייל (כלומר, CD19 PE עבור CD64 PE). עם זאת, פלואורופורים טנדם כמו PE-CF594, PE-Cy7, או APC-Cy7 דורשים את אותו נוגדן עבור SCC כמו קוקטייל עקב ניתוק פוטנציאלי של פלואורופורים מצומדים.<ol>
<li>צור את SCC עבור BV421 על ידי הוספת 2 טיפות של חרוזי פיצוי צינור טיטר 1.2 מ"ל יחד עם 1 μL של אוגר נגד עכבר CD11c BV421. חרוזי פיצוי משמשים מכיוון ש- CD11c BV421 הוא סוג משנה של למבדה של IgG במקום קאפה כמתואר ב- 5.3.3. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.</li>
		<li>צור את SCC עבור צבע חי / מת על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן החרוזים תגובתי אמין, ואחריו 1 μL של צבע חי / מת. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן החרוזים תגובתי אמין. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.</li>
		<li>צור את SCCs הנותרים על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזי כתמים חיוביים (כובע ירוק) מן נגד עכברוש ואנטי אוגר Ig kappa חרוזים להגדיר, ואחריו כמות הנוגדנים המפורטים (טבלה 3) בצינור טיטר 1.2 מ"ל. דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף טיפה אחת של חרוזים שליליים (כובע לבן) מן אנטי עכברוש אנטי אוגר Ig קאפה חרוזים להגדיר. הוסף מאגר זרימה של 0.2 מ"ל.</li>
		<li>וורטקס כל תערובות חרוזים לחלוטין. אחסן SCCs ב 4 °C (69 °F) עד 3 ימים. הערה: SCC עבור עכברי כתב פלואורסצנטי הוא תאים מוכתמים.</li>
		<li>בעת הפעלת SCCs, הגדר מתחים כך שלדגימה SCC יש שיא גדול יותר מכל פלואורסצנטיות עבור מדגם של תאים באותו ערוץ גלאי. בנוסף, יש להגדיר מתחים כך שלכל SCC יהיה הפרש יומן רישום של לפחות 0.5 בין שיא ההיסטוגרמה בערוץ העניין לעומת כל ערוץ אחר (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל דוגמאות על "נמוך" שמירה על אירועים / שני מתחת 4000. אם לא ניתן להוריד את קצב הזרימה כראוי, לדלל דגימות עם מאגר זרימת קור נוסף. רשום את אמצעי האחסון שנוסף מכיוון שהדבר יהיה נחוץ לחישוב הספירה (ראה תוצאות מייצגות).</li>
	<li>לאסוף לפחות 3 x 106 אירועים לכל מדגם. זה עשוי להיות גבוה יותר ממספר התא עקב גרגירי פיגמנט ופסולת לספור כאירועים על הסייטומטר שלך.</li>
	<li>רשום פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) עבור כל פלואור שאינו חי/מת עבור אסטרטגיית ג'ינג נאותה בסעיף 6.4. FMO הוא מדגם שהוכתם בכל הפלואורופורים למעט אחד.</li>
	<li>נקה וכבה את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן או המתקן.</li>
</ol>6. ביאור של נתוני ציטומטריית זרימה
<ol><li>פתח גליון עבודה חדש באמצעות תוכנת ניתוח. יבא קבצי FCS מסיטומטר עבור כל הדגימות והפקדים בצבע יחיד.</li>
	<li>השתמש ב- SCCs כדי ליצור מטריצת פיצוי.</li>
	<li>החל את מטריצת הפיצוי על הדגימות המוכתמות ו- FMOs שלך.</li>
	<li>השתמש ב- FMOs כדי לקבוע כתמים חיוביים כדי לצייר שערים.</li>
</ol>

<ol><li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+physiology+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li>
<li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li>
<li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li>
<li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099(2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935(2013).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li>
<li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313(2014).</li>
<li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636(2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia%2C+and+not+peripheral+macrophages%2C+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
<li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li>
<li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+CD11b+%2BMonocytes+and+Anti%E2%80%93Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22AJOPHT%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li>
<li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח כמותי של סוגי תאים מרובים ברקמה מורכבת. בדו"ח זה, אנו מתארים את הזיהוי הציטומטרי הזרימה של אוכלוסיות פיגוציטים מונונוקליות, כולל מונוציטים, תאים דנדריטיים ותת-קבוצות מקרופאגים, לאחר פגיעה בלייזר בעין העכבר. Liyanage et al דיווח לאחרונה על אסטרטגיית gating דומה כדי לזהות נויטרופילים, אאוזינופילים, לימפוציטים, DCs, מקרופאגים, חדירה מקרופאגים, מונוציטים27. אסטרטגיית הגטינג שלנו שונה בעיקר על ידי תוספת של CD64. Liyanage et al מזהה DC כ- CD4-CD8<su...

מערכת החיסון המולדת כוללת סוגי תאים מרובים המעוררים הפעלה משלימה ודלקת. תאים חיסוניים מולדים כוללים תאי רוצח טבעי (NK), תאי פיטום, בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים, ופגוציטים מונונוקלריים. פיגוציטים מונונוקלריים, המורכבים ממונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים, היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של תנאים אופטלמולוגיים מרובים כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)1. בפרוטוקול זה, נתמקד בזיהוי של phagocytes מונונוקולרי באמצעות ניתוח ציטומטרי זרימה רב פרמטרים במודל העכבר של AMD neovascular2. פרוטוקול זה ניתן להתאמה למודלים של עכברים של רטינופתיה סוכרתית ו/או uveitis, אך ניתוח עיניים נרחב יותר מומלץ בגלל האופי המערכתי של מחלות אלה.
פגוציטים מונונוקולריים מבטאים סמני פני תא חופפים. מקרופאגים ומיקרוגליה של תושבי רקמות לאורך זמן מקורם באקרומניאלואיד שק החלמון3, בעוד מיחזור מקרופאגים ותאים דנדריטיים מבדילים מאבן התא הדנדריטית4שמקורה במח העצם . סמני פני השטח של תאי העכבר המשותפים למונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים כוללים את CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17, ואת הסמן התאי Iba18. על מנת להתגבר על אתגר זה, ניתוח תמלולומי של מקרופאגים, מונוציטים ותאים דנדריטיים מרקמות מרובות מגדיר את CD64 כסמן משטח תא ספציפי למאקרופג '6. מקרופאגים תוארו הקשתית, choroid, גוף ciliary, ועצב הראייה בעיניים בריאות3. לחלופין, זיהוי תאים דנדריטי קשה יותר; השיטה הספציפית ביותר לזיהוי תאים דנדריטיים דורשת מיפוי גורל באמצעות עכבר הכתב Zbtb46-GFP9. ללא תלות בשורת כתב זו, ביטוי של CD11c ו- MHCII בשילוב עם היעדר CD64 יכול לזהות תאים דנדריטיים פוטנציאליים6,10. תאים דנדריטיים זוהו בקרנית, הלחמית, הקשתית והכורוידים בעיניים רגילות11. Microglia הם מקרופאגים מיוחדים הממוקמים ברשתית, מוגנים על ידי מחסום רשתית הדם, ומופקים מתאי שק חלמון12. כתוצאה מכך, microglia הרשתית ניתן להבדיל מקרופאגים נגזר מונוציט על ידי רמות עמומות שלהם של ביטוי CD4513 ורמות גבוהות של Tmem119, אשר זמין כמו נוגדן cytometry זרימה14. עם זאת, עם הפעלת microglia, CD45 יכול להיות מוסדר עד15 ו Tmem119 עשוי להיות מוסדר למטה3, המדגים את המורכבות של ביולוגיה microglia וזה רלוונטי ככל הנראה הן AMD והן מודל העכבר שלה. לבסוף, ניתן לחלק מונוציטים לשני תת-סוגים לפחות, כולל קלאסי ולא קלאסי. מונוציטים קלאסיים מציגים CCR2+Ly6CגבוהCX3CR1 ביטוינמוך, מונוציטים שאינם קלאסיים להדגים CCR2-Ly6CנמוךCX3CR1 סמניםגבוהים 5.
בשל הצורך בניתוח כמותי של ביטוי סמן, כלומר, רמות גבוהות לעומת רמות נמוכות/עמומות, ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא השיטה האידיאלית לאפליה בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעין וברקמות אחרות. יתרונות נוספים כוללים זיהוי אוכלוסיות משנה, היכולת להשתמש במיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי למיין אוכלוסיות תאים לצורך ניתוח תמלולומי או פרוטאומי ומיפוי גורל. החיסרון העיקרי של cytometry זרימה רב פרמטרים הוא חוסר ארכיטקטורת רקמות. זה יכול להיות להתגבר על ידי ניתוח עיניים לתוך subcompartments העין השונים: קרנית, הלחמית, איריס, עדשה, רשתית, קומפלקס choroid-sclera. בנוסף, הדמיית כשל חיסוני מאשר יכולה להתבצע, אך מוגבלת על ידי מספר הסמנים וחוסר כמות איתנה.
מחקרי עמותה רחבת גנום קישרו גנים משלימים מרובים עם AMD16. הפעלה משלימה מובילה לייצור אנפילטוקסין, גיוס לויקוציטים ודלקת כתוצאה מכך. בעכברים משלימים קולטן לקוי, פגיעה בלייזר מפחית גיוס phagocyte mononuclear ו neovascularization choroidal הנגרמת על ידי לייזר (CNV) אזור17. באופן דומה, קולטן כימוקין מוטיב C-C 2 (CCR2) עכבר נוקאאוט, אשר חסר בגיוס מונוציט לרקמה, מדגים הן ירידה בגיוס phagocyte מונונוקארי ואזור CNV המושרה בלייזר18. נתונים אלה קישור משלים phagocytes מונונוקולרי עם CNV ניסיוני ואולי AMD neovascular. לתמיכה של עמותה זו, קולטנים משלימים הם dysregulated על מונוציטים בדם היקפי בחולים עם AMD neovascular19,20. נתונים אלה מראים קשר חזק בין AMD לבין פיגוציטים מונונוקאריים.
בכתב יד זה, נשתמש במודל CNV המושרה בלייזר ניסיוני כדי לאפיין את אוכלוסיות הפגוציטים המונו-גרעיניות בעין העכבר באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים. לייזר המושרה CNV הוא מודל העכבר הסטנדרטי של AMD neovascular, אשר הוכיח את היעילות של טיפול AMD ניאו-וסקולרי השורה הראשונה הנוכחי21. פרוטוקול זה יתאר התכווצות של עיני עכבר, ניתוח עיני, עיכול לתוך מתלה תא יחיד, כתמי נוגדנים, קביעת מתחי לייזר באמצעות פקדי צבע יחיד, ואסטרטגיית gating באמצעות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO) פקדים. לקבלת תיאור מפורט של דגם CNV המושרה בלייזר, עיין בפרסום הקודם22. באמצעות פרוטוקול זה, אנו נגדיר אוכלוסיות מיקרוגליה, מונוציטים, תאים דנדריטיים ומאקרופאג'. יתר על כן, נשתמש ב- MHCII וב- CD11c כדי להגדיר עוד יותר ערכות משנה של מקרופאגים במודל CNV המושרה בלייזר.

<table><tbody><tr><td>0.6 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל חרוטים</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 מ"ל</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 מ"ל מזרק</td><td>Henke סאס וולף</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 20% פרפורמלדהיד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם מחט</td><td>אקסל</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק נעילת לואר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 מ"מ צלחת פוליסטירן לשקול פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל חרוטים</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות, צלחת בדיקה תחתונה U ללא מכסה</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>אמין חרוזים תגובתיים</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>נגד חולדות ואנטי אוגרים סט חרוזים Ig kappa BD</td><td>Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פיצוי</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי ספירה</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>אנזים העיכול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td> מכשירים <td>אופטיים ומדעיים לאומיים, בע"מ</td><td>צינורות דיסוציאציה DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>דיסוציאטור אלקטרוני</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva תוכנה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc בלוק, חולדה נגד עכבר CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>אינטגרה Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>מאגר זרימה</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות זרימה</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>אוגר נגד עכבר CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>צבע חי/מת</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ליזינג, פתרון 10x</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרו טיטר ומתלה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד עכבר CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד עכבר NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט P1000</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 פיפטור</td><td>גילסון</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 טיפים פיפטור</td><td>אפנדורף</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 פיפטור</td><td>גילסון</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 פיפטור</td><td>גילסון</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 טיפים לפיפט</td><td>דנוויל סיינטיפיק</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 פיפטור</td><td>גילסון</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>פיפט מן</td><td>פישר FB14955202</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי חולדה נגד עכבר B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>561085</tr><tr><td>חולדה נגד עכבר Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש נגד עכבר Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים סטרילית, רשת ניילון 40 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים, 500 מ"ל</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת דלי מתנדנדת</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול, תמיסה 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

מערכת החיסון המולדת ממלאת תפקידים חשובים בפתופיזיולוגיה עינית כולל uveitis, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל. תאים חיסוניים מולדים, במיוחד פיגוציטים מונונוקולריים, מבטאים סמני פני תא חופפים, מה שהופך את זיהוי אוכלוסיות אלה לאתגר. ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים מאפשרת ניתוח בו-זמני כמותי של סמני משטח תאים מרובים על מנת להבדיל בין מונוציטים, מקרופאגים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים בעיני העכבר. פרוטוקול זה מתאר את ההסתעפות של עיני עכבר שלמות, ניתוח עיני, עיכול להשעיית תא יחיד וכתמים של השעיית התא הבודד עבור סמני תאים מיאלואידיים. בנוסף, אנו מסבירים את השיטות המתאימות לקביעת מתחים באמצעות פקדי צבע יחיד ולתיאור שערים חיוביים באמצעות פלואורסצנטיות מינוס פקד אחד. המגבלה העיקרית של ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים היא היעדר ארכיטקטורת רקמות. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי cytometry זרימה מרובת פרמטרים של תאי עיניים בודדים או כתמי כשל חיסוני חינם. עם זאת, כשל חיסוני מוגבל על ידי חוסר ניתוח כמותי שלה מספר מופחת של פלואורופורים על רוב המיקרוסקופים. אנו מתארים את השימוש בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לספק ניתוח כמותי מאוד של פיגוציטים מונונוקולריים בניאווסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר. בנוסף, ניתן להשתמש בציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים לזיהוי ערכות משנה של מקרופאגים, מיפוי גורל ומיון תאים עבור מחקרים תעתיקומיים או פרוטאומיים.

איור 1 הראה היסטוגרמות תדר לא מפוצות עבור ה- SCCs והתאים עבור הלייזר האדום: Alexa647, Alexa700 ו- APC-Cy7. באיור 1A, קו המג'נטה תיאר את פסגת ה- SCC עבור Alexa647, בעוד שקו הציאן הראה את הפרש יומן הרישום המיועד של 0.5. שים לב כי השיא Alexa700 ו- APC-Cy7 היה משמאל (פחות בהיר) של קו ציאן. כמו כן, שים לב שהתאים היו כולם משמאל לקו המגנטה. כל התאים מימין לשיא ה-SCC לא קיבלו פיצוי. ערוצים ספציפיים היו ידועים לשפוך לתוך אחרים המבוססים על הכימיה של צבעי פלואורוכרום (כלומ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

פרוטוקול זה נועד לעכל עיני עכבר שלמות לתרחיף תא בודד עבור ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית של פגוציטים חד-גרעיניים הכוללים מקרופאגים, מונוציטים, מיקרוגליה ותאים דנדריטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להשתמש בניתוח כמותי עם עוצמת פלואורופור כדי להבדיל בין סוגי תאים קרובים באמצעות ביטוי סמני פני התא. הפרוטוקול שלנו מותאם לניתוח הטרוגניות של מקרופאגים, כולל אוכלוסיות תושבות ומסתננות במודל הניאו-וסקולריזציה הכורואידלי המושרה על ידי לייזר.עם זאת, ניתן ליישם מושגים וטכניקות אלה באותה מידה על מודלים אחרים כמו רטינופתיה סוכרתית, אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית, כמו גם ביטויים של זאבת. כאשר מנסים פרוטוקול זה, הבנת תצורת הציטומטר שלך היא נקודת התחלה קריטית מכיוון שכל הציטומטרים אינם מוגדרים בדיוק באותו אופן. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לטטר כמויות של נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ו/או להתאים פלואורופורים כדי לייעל את הפרוטוקול על סמך תצורת הציטומטר שלך.התחל בהכנת מאגר העיכול לפי הוראות כתב היד. בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה והגדלה כוללת פי 10, הסר את הלחמית ועצב הראייה שנותרו מהעיניים. העבירו עיניים נקיות לכלי ניתוח יבש או לסירה קטנה במשקל, ואז צרו שני פצעי ניקוב עם זווית של 90 מעלות ביניהם דרך ציר הראייה.השתמש במזרק עם מחט בגודל 30 כדי להזריק 0.15 עד 0.2 מיליליטר של חיץ עיכול לחלל הזגוגית של כל עין. טחנו את העיניים עם מספריים קפיציים ומלקחיים עדינים, ואז נתקו את רקמת העדשה עם שיבוש מכני קהה כדי למנוע סתימת קצות פיפטה בשלבים הבאים. שוטפים את המלקחיים והמספריים עם 0.75 מיליליטר של חיץ עיכול ומחליפים את המנה לכל דגימה.השתמש בפיפטה P1000 כדי להעביר את תכולת המנה לצינור דיסוציאציה על קרח, תוך הקפדה לא לאבד שום חומר. שוטפים את המנה עם 1.5 מיליליטר נוספים של חיץ עיכול ומוסיפים אותו לצינור הדיסוציאציה, מה שמביא את הנפח הכולל בין 3.25 ל -3.5 מיליליטר. נתק את הרקמה על דיסוציאטור אלקטרוני כמתואר בכתב היד של הטקסט, וודא שכל הרקמה נמצאת בתחתית צינור הדיסוציאציה ההפוך ובמגע עם מאגר העיכול.לאחר מכן דגרו את צינור הדיסוציאציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך 30 דקות. חזור על דיסוציאציה של הרקמה פעמיים נוספות, תוך דגירה של הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך 30 דקות בין הדיסוציאציות. כדי לעצור את התגובה, הוסף 10 מיליליטר של מאגר זרימה קרה והנח את צינורות הדגימה על קרח.כדי ליצור תרחיף תא בודד, מסננים את תגובת עיכול העין המופסקת דרך מסנן של 40 מיקרומטר המונח על גבי צינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר. השתמש בבוכנה ממזרק של 2.5 מיליליטר כדי לדחוף את כל החלקים שנותרו של רקמת עין לא מעוכלת דרך המסנן. שוטפים את צינור הניתוק עם 10 מיליליטר מאגר זרימה ושוטפים את המסנן.לאחר מכן השתמש באותה בוכנה כדי להעביר שוב את חלקי רקמת העין הלא מעוכלים דרך המסנן. חזור על תהליך זה עם חמישה מיליליטר של מאגר זרימה. לאחר מכן שטפו את צינור הדיסוציאציה וסננו עם 10 מיליליטר אחרונים של מאגר זרימה.צנטריפוגה של הצינור החרוטי ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. פרק את הגלולה על ידי החלקת הצינור על צינור אחר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת ליזינג וסובבו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות כדי לליז את כדוריות הדם האדומות.עצור את התגובה עם 20 מיליליטר של מאגר זרימה וצנטריפוגה של הצינור החרוטי ב -400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. החלק את הצינור על צינור אחר.לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר HBSS קר. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. הוסף 0.5 מיליליטר של כתם מת חי לכל דגימה באמצעות פיפטה P1000, הקפד לנתק את הגלולה לחלוטין.העבירו את הדגימות לצינורות מיקרוטיטר של 1.2 מיליליטר ודגרו אותן למשך 15 דקות בחושך. בינתיים, ספרו 10 מיקרוליטר של הדגימה עם טריפאן כחול והמוציטומטר. לאחר הדגירה יש לשטוף כל דגימה על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מאגר זרימה קרה.צנטריפוגה של הצינורות במדף צינור מיקרוטיטר ב-400 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושואבת את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא. השעו מחדש את התאים לחלוטין ב -500 מיקרוליטר של מאגר זרימה קרה. לאחר מכן חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.חסום עד חמישה מיליון תאים חיים ב-50 מיקרוליטר של בלוק FC. נתק לחלוטין את כדור התא ודגר אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים לכל דגימה.מערבבים אותו לגמרי ומדגרים עליו עוד 30 דקות בחום של ארבע מעלות צלזיוס. מאפייני אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי עבור כל האירועים שנותחו משתי עיניים של עכבר יחיד מוצגים כאן. ספירת החרוזים נוקתה ואושרה על ידי התוויית PE על APC-Cy7, מה שיצר מקבץ הדוק של אירועים חיוביים PE ו-APC-Cy7 שליליים.לאחר מכן, זוהו סינגלטים בתאים חיים מכל האירועים. סינגלטים היו בקורלציה חיובית בגובה הפיזור הקדמי לעומת שטח הפיזור קדימה בעוד שלתאים כפולים ושלישיות היה שטח פיזור גדול יותר מגובה הפיזור הקדמי. תאים חיים הם חיוביים לאזור הפיזור קדימה וכתם מת חי שלילי.אסטרטגיית השער הראשונית לתיחום פגוציטים חד-גרעיניים מתאי סינגל חיים מוצגת כאן. סינגלטים חיים הודגמו באמצעות תרשים CD45 לעומת CD11b. היעדר תאים חיוביים CD45 ב-CD45 FMO אישר את בחירת השער.לאחר מכן, נויטרופילים, אאוזינופילים, תאי B ותאי K ותאי T לא נכללו על ידי התוויית סינגלטים חיים חיוביים ל-CD45 עם שער שושלת לעומת CD11b. תאים CD45-DIM הובחנו מתאים בעלי CD45 גבוה. זוהו גם תת-קבוצות של מקרופאגים.מיקרוגליה הוגדרה בתאי CD45-dim עם צביעה נמוכה של MHC2 חיובי CD64. מקרופאגים שליליים MHC2 זוהו כ-CD64 חיובי MHC2 שלילי. מקרופאגים CD11c שליליים וחיוביים ל-CD11c הודגמו כ-CD64 חיובי CD11c שלילי.ו-CD64 חיובי CD11c חיובי בתאים החיוביים ל-MHC2. נמצא כי טיפול בלייזר הגדיל את כמות המקרופאגים החיוביים MHC2, CD11c שליליים ו-CD11c חיוביים. ספירת התאים הדנדריטיים הווסתה גם היא על ידי טיפול בלייזר בעוד שספירת מיקרוגליה ומונוציטים לא הושפעו.לזלוף מערכתי לא הייתה השפעה על מספרי המקרופאגים. בעקבות הליך זה, מיון תאים המופעל על ידי פלורסנט ולא ניתוח בלבד מאפשר אפיון של הטרוגניות מקרופאגים והשפעתה על התפקוד באמצעות מחקרים טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים.

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

הדמיה חיה של תאי הדם המסומנים במחזור העין יכולה לספק מידע על דלקת ואיסכמיה ברטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי הקשור לגיל. פרוטוקול לתווית תאי דם ותמונה תאים שכותרתו במחזור הרשתית מתואר.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית 

למד עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מאקרופאגים, מיקרוגליה ותאי דנדריטיים בעין.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

גלה סרטונים נוספים