הרכבה עצמית של חומצות פפטידיות פפטיד שעברו שינוי גמא לתוך ננו-מבנים מורכבים בתערובות ממס אורגניות

פרוטוקול חדשני זה מתאר את השימוש ברצפים נפרדים מרובים של חומצת הגרעין הסינתטית מחקה את גמא PNA כדי ליצור ננו-מבנים בתערובות ממס אורגניות ספציפיות. הראיה המתוארת כאן מראה את הצורך להתאים פרוטוקולי ננוטכנולוגיה של חומצות גרעין קיימות כלפי ממיסים אורגניים שבהם פורסמו פרוטוקולים מועטים עד ללא פרוטוקולים. מתרגלים חדשים בטכניקה זו עשויים למצוא את זה קשה להתאים פרוטוקולים קיימים שפותחו עבור סביבות עשירות במים לסביבות עשירות בממס אורגני בגלל הנטייה של PNA ננו לצבור.

התחל בהכנת מניות גמא PNA. לאחר קבלת גדילי גמא PNA מטוהרים בדירוג HPLC מיצרן מסחרי, יש להשתמש מחדש בכל גדיל במים שעברו דה-יונו ל-300 ריכוזי מיקרומולרים. לאחסן את PNAs גמא במינוס 20 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים.

כאשר אתה מוכן לבצע הרכבה עצמית, הכן דגימות אצווה Anneal ב- 75%DMSO, 75%DMF ו- 40%1, 4-דיוקסן. ראשית, להכין 20 substocks micromolar של כל אוליגומר על ידי aliquoting 0.67 microliters מן המניה העיקרית והוספת מים deionized עבור נפח סופי של 10 microliters. הוסף מיקרוליטר אחד של כל אוליגומר מ 20 substocks micromolar לצינור PCR 200 מיקרוליטר, אשר יגיע לנפח כולל של תשעה microliters עבור תשעה אוליגומרים.

הוסף 30 מיקרוליטרים של DMSO או DMF נטולי מים עם מיקרוליטר אחד נוסף של מים deionized עבור נפח סופי של 40 microliters. כדי להכין את 40%1, אצווה 4-דיוקסן, להוסיף 16 microliters של 1, 4-דיוקסן ולהביא את הנפח ל 40 microliters עם מים deionized. Anneal הדגימות במשך 22.5 שעות בקירור רוכב אופניים תרמי מ 90 עד 20 מעלות צלזיוס.

בדרך כלל, טמפרטורות נמסות המתקבלות עבור שני אוליגומר ושלוש תת-קבוצות גמא PNA אוליגומריות נמצאות בטווח של 40 עד 70 מעלות צלזיוס עבור תנאי ממס שונים. תכנת את העגל התרמי לפי הוראות כתב היד. לאחר חישול הושלם, דגימות ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך 12 עד 24 שעות לפני האפיון.

הפוך תא לחות מתיבת טיפים פיפטה ריקה על ידי מילוי התיבה עם כחמישה מיליליטר של מים. הכינו דילול פי 20 של קנודיה מסחרית זמינה של 2% באטיל אצטט עם ממס אצטט איסואמיל כדי ליצור את פתרון הניטרוסלוז. השתמש פינצטה לטבול כיסוי לתוך פתרון nitrocellulose ולאפשר לו להתייבש באוויר, ולאחר מכן להפוך תא זרימה מתוך מגלשת מיקרוסקופ, שתי רצועות סרט דו צדדי, ואת כיסוי מצופה nitrocellulose.

הכן את פתרון BSA ביוטין על ידי שקילה מיליגרם אחד של ביוטין BSA והמסתו במיליליטר אחד של PBS. פיפטה 15 מיקרוליטרים של הביוטין BSA לתוך ערוץ הזרימה בזווית ולהדגיר אותו במשך שתיים עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר בתא לח. מכה 15 microliters של חיץ לשטוף, אשר מורכב מיליגרם אחד של BSA במיליליטר אחד של PBS, לתוך התעלה לשטוף את עודף ביוטין BSA, ולאחר מכן להעביר את פני השטח על ידי דגירה ערוץ הזרימה במשך שתיים עד ארבע דקות בתא לח.

למדוד 0.5 מיליגרם של סטרפטבידין ומיליגרם אחד של BSA, ואז להמיס את שניהם במיליליטר אחד של PBS. פיפטה 15 microliters של פתרון סטרפטבידין לתוך ערוץ הזרימה ולשים אותו בתא לח במשך שתיים עד ארבע דקות ולשטוף את התעלה על ידי זורם 15 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, זרימה 15 microliters של אצווה annealed של אוליגומרים גמא PNA בתא לח, ולאחר מכן לשטוף את nanostructures מאוגד על ידי זורם 15 microliters של טרולוקס מילימולר אחד באותו הרכב ממס כמו nanostructures.

העבר את ערוץ הזרימה למחזיק השקופית ודמיין אותו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בהדמיית TIRF, יעד טבילת שמן פי 60 וזכוכית מגדלת פי 1.5. סרוק את ערוץ הזרימה בהגדלה של פי 60 או 90 בעת ניטור ערוץ Cy3. הכן 20 ו 6% מניות SDS על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן anneal אוליגומרים גמא PNA על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של כל 20 אוליגומר מיקרומולרי לצינור PCR 200 מיקרוליטר.

הוסף 30 מיקרוליטרים של DMSO נטול מים ומיקרוליטר אחד של 6%או 20% SDS לצינורות PCR לנפח סופי של 40 מיקרוליטרים, מה שיגרם לריכוז SDS סופי של 5.25 או 17.5 מילימולר בהתאמה. אנאל PNAs גמא בתרמוציקלר כפי שתואר קודם לכן. לאפיין ננו גמא PNA בנוכחות SDS באמצעות פרוטוקול TIRF או TEM.

הדמיית TIRF של אוליגומרים גמא PNA annealmers annealed ב 75% DMSO הראו ארכיטקטורות מאורגנות היטב תוך חישול ב 75% DMF הביא ננו-מבנים בצורת spicule או מחט. מצב 40%1, 4-דיוקסאן הפיק קישוט דליל של ננו-מבנים סיסמנטיים. יתר על כן, הדגימות של צינורות גמא PNA שנוצרו ב 75% DMSO הפגינו מאגד של nanofibers ברזולוציות הגדלה גבוהה או ננוסקופיות במהלך הדמיית TEM.

ניתוח כמותי של רוחב הננו-מבנים הראה רוחב חציוני של 16.3 ננומטר עם ערכים מרביים מעבר ל-80 ננומטר. אוליגומרים דנ"א Isosequential שהחליפו PNAs גמא רציפים יצרו מבנים ישרים filamentous ואילו החלפת PNAs גמא מוצלב לגרום מבנים stellate. הננו-מבנים שהוחלפו באוליגומרים של דנ"א רציפים היו ברוחב חציוני של כ-19 ננומטר.

בריכוזי SDS גבוהים, ננופייברים PNA גמא גם לאמץ morphologies מרושתים מאוד בהשוואה ריכוזי micelle הקריטי שלה כאשר צפו עם הדמיה TIRF. הדמיית TEM מצביעה על כך שהרכבת גמא PNA ב-SDS 5.25 מילימולרית כוללת את ההפחתות המשמעותיות ביותר במאגמים מבניים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור לשמור על קומפוזיציות ממס כאמור בגלל הנטייה של nanostructures לצבור.

שיטות אלה מעודדות מתרגלים להמשיך בדרכים אחרות שלא נחקרו של קומפוזיציות ממס שונות, פעילי שטח, וננו-מבנים אחרים של דנ"א PNA.