אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.

הפרוטוקול שלנו מאפשר מיקוד דיוק תת-מילימטרי של אולטרסאונד ממוקד בעכברים. זה מאפשר לנו למקד אולטרסאונד באמצעות חלקים מודפסים תלת מימדיים זולים ללא צורך בשימוש בניתוח או בציוד אולטרסאונד תואם MRI. פתיחת מחסום דם-מוח ממוקדת באולטרסאונד יכולה להיות די מסובכת בהתחלה.

זה קריטי שהמתמר יהיה מחובר כראוי לבעל החיים באמצעות ג'ל או מים נטולי גז ושהמיקרו-בועות לא יקרסו במהלך ההזרקה. מדגים את ההליך ריצ'רד לי, סטודנט לתואר שני ב-Caltech. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בעכבר מורדם, השתמש ב-10 יחידות למיליליטר של תמיסת מלח הפרינית כדי לשטוף קטטר נקי בגודל 25 עד 35 והשתמש בכרית אתנול כדי לחטא את זנב החיה.

הכנס את הצנתר לווריד זנב לרוחב והשתמש בדבק רקמות כדי להדק את הצנתר במקומו. אם המחט הונחה כהלכה, תיצפה זרימה חוזרת של דם בקטטר. כאשר הדבק התייבש, הסירו את השיער על ראש החיה עם קרם אפילציה והניחו את העכבר בגררת MRI מודפסת בתלת מימד, והרכיבו את השיניים הקדמיות על מוט נשיכה כשהראש בתוך חרוט אף.

הצמידו את הסורגים הקהים לגולגולת עם כמות בטוחה של לחץ והתבוננו בנשימה למשך 30 שניות כדי לוודא שהחיה נושמת בחופשיות בקצב של נשימה אחת בשנייה. חבר את מדריך המיקוד למוטות האוזניים ובדוק שוב את הנשימה. הנח את גררת ה-MRI לתוך מחזיק MRI והנח את המחזיק בתוך קדח המגנט.

לאחר מכן רכשו רצף MRI כדי למקם את העכבר בסורק, תוך שימוש ברצף הצילום התלת-ממדי בזווית נמוכה כדי לדמות את המוח כולו. כדי לבצע מיקוד מונחה MRI, הנח את הכרכרה בתוך מכשיר סטריאוטקסי והשתמש בבלוק מתכת עם סרט דו צדדי כדי לאבטח את הבלוק במקומו כנגד שני עמודי תמיכה של המכשיר הסטריאוטקסי. העבירו את תמונות ה-MRI למחשב עם תוכנת הנחיית אולטרסאונד ממוקדת פועלת, ופתחו את התמונות.

לאחר טעינת כל התמונות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ולחץ על פרמט כדי לאתחל מחדש את התמונה לשלושה צירים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להתאים את המתמר למדריך המיקוד המעגלי. בתצוגה סגיטלית, התאם את המיקום האנכי של המתמר הווירטואלי כדי לקחת בחשבון את עובי אמבט המים ובית המתמר.

ציין את האזורים שיש להתמקד בהם במתכנן המסלול ורשום את הקואורדינטות בגיליון אלקטרוני. חייג לעומק המיקוד הרצוי ורשום את הקואורדינטות כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן לחץ על שלח מסלול ובצע כדי למקד כל אחת מהנקודות.

כדי לתאם את הקואורדינטות של MRI עם המסגרת הסטריאוטקסית, הנח את המתמר המותקן בהתאמה אישית מעל מוביל מיקוד ותרגם עד שכל אחד משלושת ברגי המטרה יכול לעבור גם דרך מחזיק המתמר וגם דרך מדריך המטרה. ודא שהברגים אינם במתח או הטיה ותרגם את המתמר 10.56 מילימטרים קדימה בכיוון הקדמי-אחורי עד שהמתמר ממוקם בנקודה שבה מופיע מרכז מוביל המטרה ב-MRI. לאחר מכן קבע את המרחק ממרכז המתמר הווירטואלי לאזור הממוקד והשתמש במסגרת כדי להזיז את המתמר לקואורדינטות אלו.

להכנת תמיסת ההזרקה, טען 800 מיקרוליטר מי מלח ו -100 מיקרוליטר חומר ניגוד MRI לצינור של 1.5 מיליליטר עם ערבוב. לאחר מכן, הביאו תמיסת מיקרו-בועות לא מופעלת לטמפרטורת החדר, לפני הפעלת המיקרו-בועות למשך 45 שניות במכשיר להפעלת מיקרו-בועות. לאחר ההפעלה, טען לאט 100 מיקרוליטר של מיקרו-בועות מאמצע התמיסה למזרק טוברקולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 21, והוסף 80 מיקרוליטר של בועות המיקרו לתמיסת חומר הניגוד.

מערבבים את התמיסה המוכנה על ידי היפוך עדין של צינור ה-1.5 מיליליטר למשך 15 שניות כדי למנוע ציפה. בתום הערבוב טענו 200 מיקרוליטר מתמיסת המיקרו-בועות למזרק ללא מחט והפכו את המזרק. לחץ ומשוך את הבוכנה כדי לערבב ולחבר מחט בגודל 30 למזרק כשהוא עדיין הפוך.

לאחר מכן דחף לאט החוצה את תמיסת המיקרו-בועות עד שיופיעו טיפות בקצה המחט. ברגע שהמיקרו-בועות מוכנות, הגדר את משך הדופק של הסוונציה ל-10 אלפיות השנייה, עם 120 חזרות בכל שנייה, עם לחץ של 0.3 עד 0.45 מגה-פסקל בגולגולת. הסר את מדריך המיקוד ומרח ג'ל אולטרסאונד נטול גז על ראש העכבר, תוך הקפדה על הימנעות מבועות.

הורד את המתמר עד שהוא מונח ישירות על החלק השטוח של מחזיק מוט האוזן וחייג את הקואורדינטות למכשירים הסטריאוטקסיים. לדלל את הנגיף הקשור לאדנו המעניין ל-0.5 עד 2 כפול 10 לחלקיק הנגיפי העשירי לגרם של ריכוז משקל גוף, ולטעון את חלקיקי הנגיף למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 30. הזרקו את התמיסה לצנתר וריד הזנב והזריקו 80 מיקרוליטר מתמיסת המיקרו-בועות לעכבר.

כדי להעריך את פתיחת מחסום הדם-מוח על ידי MRI, רשום רצף ירי מהיר בזווית נמוכה כפי שהודגם. לגירוי DREADD, יש להמיס תחמוצת N קלוזפין במי מלח סטריליים בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, ולהזריק אותו תוך צפק. 15 עד 45 דקות לאחר הלידה, התחל לתעד את הפעילות ההתנהגותית של בעל החיים.

לניתוח הפעלה עצבית, השתמש ברקמת מוח. בעקבות הפרוטוקול כפי שהודגם, ניתן להשיג שיפור אות T1 באזור ההיפוקמפוס ובחלקים אחרים של המוח. כפי שנצפה, צביעה חיסונית נגד mCherry מובילה לזיהוי אמין יותר של ביטוי DREADD בהליך זה, זכור לטפל במיקרו-בועות בעדינות ולהבטיח שהחיה יציבה במהלך הדמיית ה-MRI והאינסונציה.