Name: אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו כיצד לפתוח את מחסום הדם-מוח בעכברים באמצעות אולטרסאונד ממוקד ללא ניתוח, ולהעריך נוירומודולציה כימוגנטית באמצעות שיטות היסטולוגיות. פרוטוקול זה מאפשר מיקוד מדויק של תרופות גניות במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן המוח וההתנהגות, פרס החוקר הצעיר של NARSAD. מספר רכיבים מודפסים בתלת-ממד תוכננו במקור על ידי פביאן רבוסו (Image Guided Therapy, צרפת). המחבר מודה לג'ון הית' (קלטק) ולמרגרט סוויפט (קלטק) על העזרה הטכנית בהכנת כתב היד.

אין ניגוד עניינים.

ATAC דורש יישום מוצלח של מספר טכניקות לנוירומודולציה מוצלחת של מעגלים עצביים ספציפיים, כולל מיקוד מונחה MRI מדויק, FUS-BBBO, והערכה היסטולוגית של ביטוי גנים. רכיבים הניתנים להדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לפשט את המיקוד של מבני מוח קטנים באמצעות FUS-BBBO מונחה הדמיה.
מתן אולטרסאונד ממוקד מונחה MRI (MRIgFUS) מציב מספר אתגרים. ראשית, לסליל MRI טיפוסי יש שטח מוגבל שנועד להכיל רק דגימה ולא את חומרת האולטרסאונד. המשעממים הגדולים יותר של MRI מגדילים את עלות הציוד ומפחיתים את איכות התמונה, שכן האות קשור לגורם המילוי של סליל32. כתוצאה מכך, כל חומרת FUS המונחת על גבי תמונה של בעל חיים ב-MRI תפגע באיכות ההדמיה. שנית, תכנון מכשירים תואמי MRI הוא קשה ויקר. חומרים תואמי MRI צריכים להיות דיאמגנטיים, בעלי נטייה נמוכה ליצירת זרמי ערבולת במהלך הקרנת גלי רדיו, ובעלי רגישות מגנטית נמוכה בשדות מגנטיים גבוהים. בכל חומר מוליך, יצירת זרמי מערבולת או רגישותו המגנטית ישפיעו לרעה גם על איכות ההדמיה. לבסוף, החומרים הזמינים תואמי MRI הם בעלי מודולי ועמידות נמוכים יותר של יאנג מאשר המתכות המשמשות בדרך כלל לייצור מכונות מיקוד מדויקות, כגון מסגרות סטריאוטקסיות. המנועים המשמשים לכוונון מיקום צריכים להיות תואמי MRI וממוקמים מחוץ למשעמם ה- MRI בשל גודלם. מנועים אלה צריכים להיות מחוברים במרחק למתמר בתוך משעמם MRI באמצעות חומרים תואמי MRI. בעיות של עיוות פלסטיק, היעדר מספיק מקום בתוך הבור כדי ליישם רכיבים בגודל חזק, וחוסר מקום מספיק לשינוי מיקומי מיקוד ברחבי המוח כולו השפיעו על דיוק המיקוד בעבודות קודמות.
כדי לפתור בעיות אלה, הוחלט לבצע הדמיה ב- MRI וניהול FUS-BBBO מחוץ לסורק. כדי לאפשר הנחיית MRI, עכברים הוכנסו לתוך ריסון מודפס בתלת-ממד עם מדריך מיקוד גלוי MRI שניתן להשתמש בו כדי למקם את מבני המוח של העכבר הן ב-MRI והן במרחב הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. מאחר שגם גולגולת העכבר וגם מדריך המיקוד מחוברים היטב למחזיקי מוטות האוזן (איור 1a,b), ניתן להשתמש במדריך מיקוד כדי לתאם קואורדינטות מרחביות בתוך תמונת MRI ולאפס את המכשירים הסטריאוטקסיים. לרסן אין חלקים נעים והוא אינו מכיל מתמר, מה שאפשר לנו להפוך אותו גם חזק וגם קטן מספיק כדי להיכנס לתוך MRI והסיר הפרעות אות מהאלקטרוניקה של המתמר. החלל בתוך מדריך המיקוד היה חלול כאשר התמיכה המודפסת בתלת-ממד עבור חומרים מסוימים נראית ב-MRI (איור 1c). חורים במכלול הוכנסו כדי לאפשר כיול סטריאוטקסי (איור 3). מתמר האולטרסאונד הוצמד לאלקטרודה בעלת סטריאוטקס, והמיקוד בוצע כמתואר בסעיף 4 (איור 1d). המתמר צריך להיות נתמך לאורכו על ידי בית של מוטות אוזניים, מניעת כל סטייה ממישור הרמה. ניתן להשיג את המיקוד בכיוון הגב-גחוני באמצעות שינויי פאזה במערך טבעתי.
דיוק המיקוד המעשי נקבע על ידי מיקוד אולטרסאונד והנחתת גולגולת. נוהל FUS-BBBO תואר בפירוט עבור חולדות 11 ויושם במספר יצורי מודל אחרים23,33,34 ובבני אדם 16,17. הקשר בין גודל מיקוד האולטרסאונד ביחס הפוך לתדר, כאשר תדרים גבוהים יותר יכולים לגרום למסירה מדויקת יותר. עם זאת, הנחתת הגולגולת עולה עם תדירויות35 מה שעלול להוביל לחימום הגולגולת ולפגיעה באזורים בקליפת המוח. אסטרטגיית המיקוד המדויקת תהיה תלויה באתר המוח. האתרים שבהם לחץ מקסימלי ברוחב מלא של חצי רוחב נכנס לתוך רקמת המוח מאפשרים פתיחה צפויה ובטוחה של BBB במבני מוח רבים כגון הסטריאטום, המוח התיכון וההיפוקמפוס. אזורים הסמוכים לבסיס המוח מהווים אתגר ספציפי בעכברים. מוח העכבר מודד כ-8-10 מ"מ בכיוון הגחון-דורסו, הדומה לחצי הרוחב המלא של הגודל המרבי של מתמרים רבים הזמינים מסחרית. כתוצאה מכך, מיקוד בתחתית הגולגולת יכול להוביל להחזר אולטרסאונד מהעצמות והאוויר הנמצאים בתעלות האוזן, בפה או בקנה הנשימה, אשר יכול להוביל לדפוסים בלתי צפויים של לחצים גבוהים ונמוכים36. חלק מהלחצים הללו יכולים לחצות סף קוויטציה אינרציאלי שהוכח כגורם לדימום ולנזק לרקמות37. כדי להתמקד באזורים הממוקמים בסמוך לבסיס הגולגולת, ייתכן שעדיף להשתמש ב-ATAC7 מצטלב, שבו גנטיקה מצטלבת38 משמשת להגבלת ביטוי גנים לאזור קטן יותר מזה הממוקד בקרן FUS. בדוגמה שפורסמה של ATAC מצטלב, חיה טרנסגנית המבטאת אנזים לעריכת גנים (Cre38) בתאים דופמינרגיים הותקפה באמצעות אולטרסאונד בתת-האזור המכיל תאים דופמינרגיים. לבסוף, אזורי קליפת המוח יכולים להיות ממוקדים עם FUS, אבל עקיפה והשתקפות של אולטרסאונד עלול להתרחש המוביל פרופילי לחץ אחידים. פרוטוקול זה אינו מכסה את המיקוד של אזורים בקליפת המוח מכיוון שהוא יהיה תלוי מאוד במינים המשומשים; אולם נצפתה התמקדות מסוימת בקליפת המוח שמעל היפוקמפוס 7 (למשל, איור 7), מה שמצביע על כך שלפחות בעכברים זה אפשרי.
הבחירה של מפעיל כימוגנטי ומינון יהיה תלוי בצרכים הניסוייים הספציפיים. מספר מחקרים, כולל אחד המחקרים של המחברים7, לא הראו תגובה לא ספציפית משמעותית39,40, בעוד מינונים גבוהים יותר (למשל, 10 מ"ג / ק"ג) יכולים לגרום לתופעות לוואי, לפחות במקרים מסוימים41. עם זאת, כמו בכל הניסויים ההתנהגותיים, בקרות נאותות31 חיוניות בשל פעילות פוטנציאלית מחוץ למיקוד של CNO והמטבוליטים שלו42. בקרות כאלה יכולות לכלול מתן בקרות CNO ומלוחים לבעלי חיים המבטאים DREADDs ומתן CNO לחיות בר או במקרים מסוימים השוואה בין אתרים איפסי וקונטרלטרליים במוח שעושים ואינם מבטאים קולטנים כימוגנטיים בהתאמה. בנוסף, מחקר שנערך לאחרונה גילה מספר אגוניסטים חדשים של DREADD עם ספציפיות משופרת28,29,43. קולטנים כימוגנטיים אחרים 5,25,44 יכולים לשמש גם בשילוב עם הליך ATAC.
הערכה היסטולוגית של ביטוי גנים היא הכרחית לאחר המוות עבור כל בעל חיים. חלק קטן מבעלי החיים מראים ביטוי גנים גרוע בעקבות FUS-BBBO7. בנוסף, יש צורך להראות את הדיוק המרחבי ואת הספציפיות של ביטוי גנים מאז מיקוד שגוי אפשרי. יש לציין כי חלק מה- AAV עשויים להראות יכולת מעקב מדרדר או אנטרוגרדי45 ויכולים לגרום לטרנספקציה הרחק מהאתר הממוקד באולטרסאונד למרות מיקוד אולטרסאונד מדויק. אם הקולטן הכימוגנטי המובע מאוחה או מבטא יחד פלואורופור, הדמיה של הפלואורופור במקטעי רקמה עשויה להספיק כדי להעריך לוקליזציה ועוצמת ביטוי. עם זאת, חלבונים פלואורסצנטיים רבים ניזוקים מתהליך קיבוע הרקמות, וצביעת מערכת החיסון עבור חלבון mCherry המשמש לעתים קרובות עם DREADDs הניבה אות טוב יותר במחקרים קודמים7. לבסוף, בשל צפיפות תאי העצב באזורים מסוימים במוח (למשל, שכבת תאים גרגירית בהיפוקמפוס), שימוש בפלואורופורים מקומיים גרעיניים המבוטאים תחת IRES, בניגוד לאיחוי, לביצוע ספירת תאים עשוי להועיל, שכן ניתן לפלח גרעינים בקלות ולהכתים אותם בכתמים גרעיניים, כגון DAPI או TO-PRO-3. כדי להעריך נוירומודולציה על ידי צביעת c-Fos, ביצוע צביעת נגד גרעינית וספירת גרעינים חיוביים c-Fos, ולא כל אות פלואורסצנטי, הוא הכרחי. במקרים מסוימים, פסולת תאית יכולה להראות פלואורסצנטיות ולבלבל את המדידות של תאים חיוביים.
מגבלות העברת התרופה והגנים עם FUS-BBBO כוללות רזולוציה נמוכה יותר מאשר העברה בזריקות תוך גולגולתיות פולשניות והצורך בכמויות גדולות יותר של תרופות מוזרקות או וקטורים נגיפיים. בנוסף, בעוד שהזרקה ישירה למוח מביאה לאספקה בלעדית לאתר המוזרק, FUS-BBBO משתמש בנתיב תוך ורידי וכתוצאה מכך העברה אפשרית לרקמות היקפיות. מגבלות השימוש בכימוגנטיקה לנוירומודולציה כוללות ציר זמן איטי, אשר עשוי להיות לא מספיק לפרוטוקולים התנהגותיים מסוימים הדורשים שינויים מהירים בעוצמת הנוירומודולציה.

השימוש בטכנולוגיות נוירומודולציה ספציפיות למעגלים, כגון אופטוגנטיקה1,2 וכימוגנטיקה 3,4,5, קידם את הבנתנו את המצבים הפסיכיאטריים כהפרעות במעגלים עצביים. מעגלים עצביים קשים למחקר וקשים עוד יותר לשליטה בטיפול בהפרעות מוחיות מכיוון שהם מוגדרים בדרך כלל על ידי סוגי תאים ספציפיים, אזורי מוח, מסלולי איתות מולקולריים ותזמון ההפעלה. באופן אידיאלי הן ליישומים מחקריים והן ליישומים קליניים, שליטה כזו תופעל באופן לא פולשני, אך השגת נוירומודולציה מדויקת ולא פולשנית היא מאתגרת. לדוגמה, בעוד תרופות נוירואקטיביות יכולות להגיע למוח באופן לא פולשני, הן חסרות ספציפיות מרחבית על ידי פעולה ברחבי המוח. מצד שני, גירוי חשמלי עמוק במוח יכול לשלוט באזורים מסוימים במוח, אך מתקשה לשלוט בסוגי תאים ספציפיים ודורש ניתוח ומיקום מכשיר6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) מספק נוירומודולציה עם ספציפיות מרחבית, סוג התא וטמפורלי. הוא משלב שלוש טכניקות: אולטרסאונד ממוקד המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO) למיקוד מרחבי, שימוש בווקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) כדי להעביר גנים באופן לא פולשני תחת שליטה של מקדמים ספציפיים לסוג התא, וקולטנים כימוגנטיים מהונדסים כדי לווסת מעגלים עצביים נגועים באופן סלקטיבי באמצעות מתן תרופות. FUS היא טכנולוגיה שאושרה על ידי ה- FDA המנצלת את יכולתו של האולטרסאונד להתמקד עמוק בתוך רקמות, כולל המוח האנושי, בדיוק מרחבי מילימטרי. בעוצמה גבוהה, FUS משמש לאבלציה ממוקדת לא פולשנית, כולל טיפול שאושר על ידי ה- FDA לרעד חיוני8. FUS-BBBO משלב אולטרסאונד בעוצמה נמוכה עם מיקרו-בועות מערכתיות, המתנדנדות בכלי הדם במוקד האולטרסאונד, וכתוצאה מכך פתיחה מקומית, זמנית (6-24 שעות) והפיכה של BBB9. פתח זה מאפשר העברה של חלבונים9,10, מולקולות קטנות 11 ווקטורים נגיפיים7,12,13,14 למוח ללא נזק משמעותי לרקמות במכרסמים 10 ובפרימטים לא אנושיים 15. ניסויים קליניים נמשכים עבור FUS-BBBO16,17, המצביעים על יישומים טיפוליים אפשריים של טכניקה זו.
העברת גנים נגיפיים באמצעות AAV מתקדמת במהירות גם לשימוש קליני עבור הפרעות במערכת העצבים המרכזית, עם אישורים רגולטוריים אחרונים של ה- FDA והאיחוד האירופי כאבני דרך עיקריות. לבסוף, קולטנים כימוגנטיים18, כגון קולטני מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADDs), נמצאים בשימוש נרחב על ידי מדעני מוח כדי לספק שליטה פרמקולוגית על עירור עצבי בבעלי חיים טרנסגניים או נגועים 19,20. DREADDs הם קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) שהונדסו גנטית להגיב למולקולות כימוגנטיות סינתטיות ולא לליגנדות אנדוגניות, כך שמתן מערכתי של ליגנדות אלה מגביר או מפחית את ההתרגשות של נוירונים המבטאים DREADD. כאשר שלוש טכנולוגיות אלה משולבות לתוך ATAC, הן יכולות לשמש לאפנון לא פולשני של מעגלים עצביים נבחרים עם דיוק מרחבי, סוג תא וטמפורלי.
כאן, אנו מרחיבים ומעדכנים פרוטוקול שפורסם בעבר עבור FUS-BBBO11 על ידי הכללת מתודולוגיה למיקוד מדויק של אזורי מוח עם FUS-BBBO בעכברים באמצעות ציוד מיקוד פשוט המודפס בתלת-ממד. אנו מציגים גם יישום של FUS-BBBO ל- ATAC. אנו מראים את הצעדים הדרושים לאספקת AAVs הנושאים קולטנים כימוגנטיים, והערכה של ביטוי גנים ונוירומודולציה על ידי היסטולוגיה. שיטה זו ישימה במיוחד עבור מיקוד אזורי מוח גדולים או מרובים עבור ביטוי גנים או נוירומודולציה. לדוגמה, אזור רחב של קליפת המוח יכול להיות מומר בקלות עם FUS-BBBO ומווסת באמצעות כימוגנטיקה. עם זאת, העברת גנים בטכניקה חלופית, זריקות תוך גולגולתיות, תדרוש מספר רב של זריקות פולשניות וקרניוטומיות. FUS-BBBO והיישום שלו, ATAC, ניתנים להרחבה לבעלי חיים בגדלים שונים, שבהם אזורי המוח גדולים יותר וקשה יותר לתקוף אותם באופן פולשני.

<table><tbody><tr><td>מחטים 21 מד (BD)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>14826C</td><td></td></tr><tr><td>25 מד קטטר פרפר</td><td>הרווארד ביוסיינס</td><td>725966</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 30 מד (BD)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>14826F</td><td></td></tr><tr><td>כרית כחולה סופגת</td><td>אופיס דיפו</td><td>902406</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-c-Fos</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-253-G</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד mCherry</td><td>Thermofisher</td><td>PA534974</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Biospec 70/30</td><td>Bruker</td><td>מותאם אישית</td><td>כולל את סלילי ה-RF</td></tr><tr><td>Clozapine-n-oxide</td><td>Tocris</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>רתמות עכבר מודפסות בתלת מימד בעיצוב מותאם אישית ורכיבי מיקוד MRIgFUS</td><td>ImageGuidedTherapy, מעבדת Szablowski</td><td>הורדה מותאמת אישית</td><td>מ-szablowskilab.org/downloads</td></tr><tr><td>מכונת MRIgFUS מותאמת אישית</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-בועות הגדרה</td><td>Lantheus</td><td>DE4</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אקווסוני/אולטרסאונד Degassed</td><td>Fisher Scientific</td><td>5067714</td><td></td></tr><tr><td>Depilation cr&egrave; me</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מתמר מערך טבעתי בן שמונה אלמנטים</td><td>Imasonic Inc.</td>רפידות <td>אתנול מותאמות אישית</td><td></td></tr><tr><td>/ ספוגיות אלכוהול (70%) (BD)</td> <td>אופיס דיפו</td><td>599893</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>פטרסון וטרינרי</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין ניטרלי חוצץ (10%)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>סיבים אופטיים</td><td>הידרופון אקוסטיקה מדויקת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 צינורות</td><td>פישר</td><td>NC1513314</td><td></td></tr><tr><td>מדעי משאבה</td><td></td><td></td><td></td>פריסטלטית</tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>524650-1EA</td><td></td></tr><tr><td>חומר ניגודיות Prohance</td><td>Bracco</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>מלח</td><td>פישר Scientific</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני, חמור-אנטי עז</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני, חמור-אנטי ארנב</td><td>ThermoFisher</td><td>84546</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים (ישר)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17467480</td><td></td></tr><tr><td>ThermoGuide Software</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דבק רקמות (גלוטורה)</td><td></td> מזרק טוברקולין של <td>Fisher Scientific</td> NC9855218 <td></td></tr><tr><td>(1 מ"ל) (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>חומר להדפסה בתלת מימד VeroClear Stratasys</td><td></td><td>RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Vialmix מכשיר להפעלת מיקרו-בועות</td><td>Lantheus</td><td>VMIX</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום רוטט</td><td>קומפרסטום</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

כימוגנטיקה ממוקדת אקוסטית (ATAC) מאפשרת בקרה לא פולשנית של מעגלים עצביים ספציפיים. ATAC משיג שליטה כזו באמצעות שילוב של אולטרסאונד ממוקד (FUS) המושרה על ידי פתיחת מחסום דם-מוח (FUS-BBBO), העברת גנים עם וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV), והפעלה של איתות תאי עם קולטני חלבונים מהונדסים וכימוגנטיים והליגנדים הקוגנטיים שלהם. עם ATAC, ניתן להמיר אזורי מוח גדולים וקטנים בדיוק מילימטרי באמצעות יישום אולטרסאונד יחיד לא פולשני. התמרה זו יכולה מאוחר יותר לאפשר נוירומודולציה ארוכת טווח, לא פולשנית ונטולת מכשירים בבעלי חיים הנעים בחופשיות באמצעות תרופה. מאחר ש-FUS-BBBO, AAVs וכימוגנטיקה שימשו בבעלי חיים רבים, ATAC צריך להיות ניתן להרחבה גם לשימוש במינים אחרים של בעלי חיים. מאמר זה מרחיב פרוטוקול שפורסם בעבר ומתאר כיצד למטב את העברת הגנים עם FUS-BBBO לאזורי מוח קטנים עם הנחיית MRI, אך ללא צורך במכשיר FUS מסובך תואם MRI. הפרוטוקול, גם, מתאר את העיצוב של מיקוד עכבר ורכיבי ריסון שניתן להדפיס בתלת-ממד על ידי כל מעבדה וניתן לשנות אותם בקלות עבור מינים שונים או ציוד מותאם אישית. כדי לסייע ביכולת השחזור, הפרוטוקול מתאר בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרו-בועות, AAV וניפונקטורה בפיתוח ATAC. לבסוף, נתונים לדוגמה מוצגים כדי להנחות את החקירות הראשוניות של מחקרים באמצעות ATAC.

השלב הראשון בביצוע פרוטוקול ATAC הוא מיקוד של FUS-BBBO לאזורי המוח הרצויים. לדוגמה, בעקבות הפרוטוקול המתואר, ההיפוקמפוס הותקף באמצעות FUS-BBBO, וחומר ניגוד ו-AAV9 הנושאים DREADD הוזרקו לעכברים, ולאחר מכן רצף MRI תלת-ממדי FLASH הרוכש תמונות של מוח העכבר. שיפור אות T1 הושג באזור ההיפוקמפוס (איור 6) ובחלקים אחרים של המוח (איור 7). לאחר מספר שבועות, DREADDs באו לידי ביטוי בתוך אזור מוח המטרה. בעוד DREADDs רבים מאוחים לכתב פלואורסצנטי (למשל mCherry), תהליך הזילוח והקיבוע עם פורמלדהיד נמצא כמפחית באופן דרסטי את הפלואורסצנטיות של חלבונים אלה. צביעה חיסונית נגד mCherry או DREADD הובילה לזיהוי אמין יותר של הביטוי (איור 8) בהתבסס על ניסיון קודם. בניסויים קודמים, ~85% מהעכברים הראו ביטוי לאחר FUS-BBBO7. בדיקה פשוטה לרמות ביטוי מספיקות של DREADDs היא בדיקת הפונקציונליות שלהם ברמה התאית. זה יכול להיעשות, למשל, על ידי מתן ליגנד כימוגנטי או בקרת מלוחים, כגון CNO19, deschloroclozapine 28, או אחרים29, ומחכה 2 שעות לפני זילוח לב וקיבוע. לאחר מכן חלקי המוח עברו חיסון, עבור חלבון c-Fos30, המצביע על פעילות מוגברת של נוירונים, ועבור DREADD. הניסוי נחשב למוצלח, אם האתר במוח שהותקף ב-DREADDs הראה מספר גבוה משמעותית של גרעינים עצביים שהם חיוביים ל-c-Fos בקבוצה שקיבלה ליגנד כימוגנטי בהשוואה לקבוצה שקיבלה מלוחים7 או בהשוואה לאתר נגדי שלא היה נתון ל-FUS-BBBO. יש לציין כי קיים פוטנציאל עבור חלק מהליגנדות הללו להפעיל תאי עצב באופן לא ספציפי ללא ביטוי של DREADDs. לדוגמה, CNO הוכח כמטבוליזם לרמות נמוכות של קלוזאפין בעכברים, אשר חוצה את מחסום הדם-מוח ומפעיל DREADDs בעוצמה גבוהה27. עם זאת, הוכח גם שהוא נקשר למיקומים לא ספציפיים. כמו בכל ניסוי, חיוני לכלול את כל הבקרות המתאימות במחקרים כימוגנטיים31. בקרה אפשרית אחת היא מתן הליגנד הכימוגנטי לעכברי בר, ללא פרוצדורות, כדי לשלול את השפעות התרופה בלבד על הבדיקה ההתנהגותית או ההיסטולוגית הרצויה. בקרה נוספת יכולה להיות הכללה של ארבע קבוצות: DREADD + ליגנד, DREADD + רכב, EGFP + ליגנד, EGFP + רכב, אשר יסביר את כל ההשפעות האפשריות של העברת גנים עם FUS-BBBO, ואת ליגנד כימוגנטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> איור 1: התהליך של מיקוד מונחה MRI של FUS ב-ATAC. (א) מיקום עכבר עם מוטות אוזניים, חרוט אף ופלטפורמה שניתן להכניס בתוך סורק MRI. (ב) מדריך מודפס בתלת-ממד (כחול) הנראה ב-MRI חובר לקצוות מסגרת מוט האוזן ולאחר מכן אובטח במקומו באמצעות מחזיק סליל MRI משטח המכיל ארבעה ברגי הצמדה (כחול שקוף למחצה). (ג) הופעת המדריך המודפס בתלת-ממד ב-MRI קשת (פאנל שמאלי), כאשר תחתית הייצוג הווירטואלי של מתמר מיושרת (חצי עיגול צהוב) עם תחתית המדריך. הפאנל הימני מציג את המראה של המדריך המודפס בתלת-ממד על MRI ממבט קורונלי. העיגול הבהיר היה עשוי מחומר תמיכה פוליג'ט בעל ניגודיות MRI חזקה. הצלב נוצר מפלסטיק. עיגול צהוב מייצג את מיקום המתמר שהיה מיושר באופן קונצנטרי עם המדריך בתוך מסגרת סטריאוטקסית. (d) כדי להתמקד במבני מוח, מתמר וירטואלי הוזז בכיוון z מעל העכברים כדי להתאים לעובי של חרוט / בית אולטרסאונד. במקרה זה, בגלל עובי אמבט המים, המתמר הועבר 8.2 מ"מ מעל המדריך למיקוד מדויק. מבני המוח נבחרו באמצעות נתוני דימות MRI, וקואורדינטות ה-MRI שלהם נכתבו והוזנו למכונה הסטריאוטקסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> איור 2: ממשק התוכנה שבה נעשה שימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> איור 3: תהליך התאמת מרחב קואורדינטות MRI למכשיר סטריאוטקסי. (א) שלושה חורים בתוך מחזיק מתמר יושרו עם שלושה חורים בתוך מדריך ה-MRI, ושלושה ברגי מיקוד חרוטיים הוכנסו מבלי לגרום לכיפוף המכלול כולו. (ב) באופן אידיאלי, כל שלושת הברגים ישבו במרכז החורים. (ג) אם יש אי דיוק כלשהו ביישור, לא כל שלושת הברגים ייכנסו פנימה, למשל, במקרה של פיהוק קטן, ככל הנראה בלתי מורגש, של 1°, רק בורג אחד יתאים בעוד שהברגים הנגדיים יהיו תקועים במדריך MRI. לחלופין, יכולה להיות גמישות נראית לעין של המכלול כולו כאשר ברגים נדחקו פנימה. (ד) תצוגה מוגדלת של התאמת ברגים. יש למקם את הברגים באופן מרוכז לקבלת הדיוק הטוב ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> איור 4: חלוקה מחדש מהירה של מיקרו-בועות בתוך המזרק. (א) מזרק צולם 5 שניות לאחר הערבוב. (ב) דקה לאחר מכן, הייתה שכבה גלויה בבירור שהראתה חלק מהבועות מתרכזות ליד החלק העליון של מזרק שחפת 1 מ"ל. דוגמה זו, בפרט, השתמשה פתרון של microbubbles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> איור 5: תהליך של מיקום מרכז מתמר מעל מרכז של מדריך MRI. (א) במודלים המוצגים במאמר זה, המוביל האדום תוכנן לנוע 10.56 מ"מ קדימה מהמיקום המוצג באיור 3b, למצב המוצג כאן. (ב) מדריך ה-MRI הכחול הוסר לפני הסוניקציה, וג'ל אולטרסאונד הוחל בין העכבר למתמר (כתום) כדי להבטיח מעבר אולטרסאונד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> איור 6: הדמיית MRI של פתח BBB. (א) מבט צירי על פתח BBB. אזור בהיר יותר המסומן עם ראש חץ מראה אקסטרווזיה של חומר ניגוד MRI T1 . (b) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס הגבי וקליפת המוח שמעל ההיפוקמפוס הממוקדת באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). (c) מבט קורונלי על ההיפוקמפוס המרכזי הממוקד באמצעות FUS-BBBO (ראשי חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> איור 7: דוגמה למיקוד של 4 אתרי מוח באמצעות מערכת מיקוד תלת-ברגית המתוארת במאמר זה. אזורים עם ראשי חץ הראו BBB נפתח אתרים עם דיפוזיה של חומר ניגוד MRI. ארבעת האתרים היו ממוקדים ברצף, עם ~ 150 שניות בין כל פתח BBB, מלמטה למעלה. התמונה צולמה תוך 2 דקות לאחר הפתיחה האחרונה של BBB. סרגל קנה המידה הוא 2 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> איור 8: זיהוי ביטוי DREADD.  (א) Immunostaining עבור fluorophore מחובר DREADDs, במקרה זה mCherry היה שיטה אמינה של גילוי בכמה מחקרים. (b) בחלק מייצג אחר עם DREADDs המכוונים להיפוקמפוס תוך שימוש באותם תנאים כמו ב-(a), הפלואורסצנטיות של mCherry לבדה יצרה רקע חזק ואות חלש יחסית. (ג) כבקרה שלילית, נעשה שימוש בעכבר שקיבל הזרקה מערכתית של AAV, אך לא עבר FUS-BBBO. לא ניתן למצוא ביטוי משמעותי על ידי mCherry immunostaining. פסי קנה מידה הם 500 מ"מ. (נתונים ב-a, c הותאמומ-7 עם הרשאות, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים להעברת הגן באמצעות פתיחה ממוקדת של מחסום דם במוח (BBB), הערכה של ביטוי הגנים המתקבל ומדידת פעילות נוירומודולציה של קולטנים כימוגנטיים באמצעות בדיקות היסטולוגיות.

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר מיקוד דיוק תת-מילימטרי של אולטרסאונד ממוקד בעכברים. זה מאפשר לנו למקד אולטרסאונד באמצעות חלקים מודפסים תלת מימדיים זולים ללא צורך בשימוש בניתוח או בציוד אולטרסאונד תואם MRI. פתיחת מחסום דם-מוח ממוקדת באולטרסאונד יכולה להיות די מסובכת בהתחלה.זה קריטי שהמתמר יהיה מחובר כראוי לבעל החיים באמצעות ג'ל או מים נטולי גז ושהמיקרו-בועות לא יקרסו במהלך ההזרקה. מדגים את ההליך ריצ'רד לי, סטודנט לתואר שני ב-Caltech. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בעכבר מורדם, השתמש ב-10 יחידות למיליליטר של תמיסת מלח הפרינית כדי לשטוף קטטר נקי בגודל 25 עד 35 והשתמש בכרית אתנול כדי לחטא את זנב החיה.הכנס את הצנתר לווריד זנב לרוחב והשתמש בדבק רקמות כדי להדק את הצנתר במקומו. אם המחט הונחה כהלכה, תיצפה זרימה חוזרת של דם בקטטר. כאשר הדבק התייבש, הסירו את השיער על ראש החיה עם קרם אפילציה והניחו את העכבר בגררת MRI מודפסת בתלת מימד, והרכיבו את השיניים הקדמיות על מוט נשיכה כשהראש בתוך חרוט אף.הצמידו את הסורגים הקהים לגולגולת עם כמות בטוחה של לחץ והתבוננו בנשימה למשך 30 שניות כדי לוודא שהחיה נושמת בחופשיות בקצב של נשימה אחת בשנייה. חבר את מדריך המיקוד למוטות האוזניים ובדוק שוב את הנשימה. הנח את גררת ה-MRI לתוך מחזיק MRI והנח את המחזיק בתוך קדח המגנט.לאחר מכן רכשו רצף MRI כדי למקם את העכבר בסורק, תוך שימוש ברצף הצילום התלת-ממדי בזווית נמוכה כדי לדמות את המוח כולו. כדי לבצע מיקוד מונחה MRI, הנח את הכרכרה בתוך מכשיר סטריאוטקסי והשתמש בבלוק מתכת עם סרט דו צדדי כדי לאבטח את הבלוק במקומו כנגד שני עמודי תמיכה של המכשיר הסטריאוטקסי. העבירו את תמונות ה-MRI למחשב עם תוכנת הנחיית אולטרסאונד ממוקדת פועלת, ופתחו את התמונות.לאחר טעינת כל התמונות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ולחץ על פרמט כדי לאתחל מחדש את התמונה לשלושה צירים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להתאים את המתמר למדריך המיקוד המעגלי. בתצוגה סגיטלית, התאם את המיקום האנכי של המתמר הווירטואלי כדי לקחת בחשבון את עובי אמבט המים ובית המתמר.ציין את האזורים שיש להתמקד בהם במתכנן המסלול ורשום את הקואורדינטות בגיליון אלקטרוני. חייג לעומק המיקוד הרצוי ורשום את הקואורדינטות כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן לחץ על שלח מסלול ובצע כדי למקד כל אחת מהנקודות.כדי לתאם את הקואורדינטות של MRI עם המסגרת הסטריאוטקסית, הנח את המתמר המותקן בהתאמה אישית מעל מוביל מיקוד ותרגם עד שכל אחד משלושת ברגי המטרה יכול לעבור גם דרך מחזיק המתמר וגם דרך מדריך המטרה. ודא שהברגים אינם במתח או הטיה ותרגם את המתמר 10.56 מילימטרים קדימה בכיוון הקדמי-אחורי עד שהמתמר ממוקם בנקודה שבה מופיע מרכז מוביל המטרה ב-MRI. לאחר מכן קבע את המרחק ממרכז המתמר הווירטואלי לאזור הממוקד והשתמש במסגרת כדי להזיז את המתמר לקואורדינטות אלו.להכנת תמיסת ההזרקה, טען 800 מיקרוליטר מי מלח ו -100 מיקרוליטר חומר ניגוד MRI לצינור של 1.5 מיליליטר עם ערבוב. לאחר מכן, הביאו תמיסת מיקרו-בועות לא מופעלת לטמפרטורת החדר, לפני הפעלת המיקרו-בועות למשך 45 שניות במכשיר להפעלת מיקרו-בועות. לאחר ההפעלה, טען לאט 100 מיקרוליטר של מיקרו-בועות מאמצע התמיסה למזרק טוברקולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 21, והוסף 80 מיקרוליטר של בועות המיקרו לתמיסת חומר הניגוד.מערבבים את התמיסה המוכנה על ידי היפוך עדין של צינור ה-1.5 מיליליטר למשך 15 שניות כדי למנוע ציפה. בתום הערבוב טענו 200 מיקרוליטר מתמיסת המיקרו-בועות למזרק ללא מחט והפכו את המזרק. לחץ ומשוך את הבוכנה כדי לערבב ולחבר מחט בגודל 30 למזרק כשהוא עדיין הפוך.לאחר מכן דחף לאט החוצה את תמיסת המיקרו-בועות עד שיופיעו טיפות בקצה המחט. ברגע שהמיקרו-בועות מוכנות, הגדר את משך הדופק של הסוונציה ל-10 אלפיות השנייה, עם 120 חזרות בכל שנייה, עם לחץ של 0.3 עד 0.45 מגה-פסקל בגולגולת. הסר את מדריך המיקוד ומרח ג'ל אולטרסאונד נטול גז על ראש העכבר, תוך הקפדה על הימנעות מבועות.הורד את המתמר עד שהוא מונח ישירות על החלק השטוח של מחזיק מוט האוזן וחייג את הקואורדינטות למכשירים הסטריאוטקסיים. לדלל את הנגיף הקשור לאדנו המעניין ל-0.5 עד 2 כפול 10 לחלקיק הנגיפי העשירי לגרם של ריכוז משקל גוף, ולטעון את חלקיקי הנגיף למזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 30. הזרקו את התמיסה לצנתר וריד הזנב והזריקו 80 מיקרוליטר מתמיסת המיקרו-בועות לעכבר.כדי להעריך את פתיחת מחסום הדם-מוח על ידי MRI, רשום רצף ירי מהיר בזווית נמוכה כפי שהודגם. לגירוי DREADD, יש להמיס תחמוצת N קלוזפין במי מלח סטריליים בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, ולהזריק אותו תוך צפק. 15 עד 45 דקות לאחר הלידה, התחל לתעד את הפעילות ההתנהגותית של בעל החיים.לניתוח הפעלה עצבית, השתמש ברקמת מוח. בעקבות הפרוטוקול כפי שהודגם, ניתן להשיג שיפור אות T1 באזור ההיפוקמפוס ובחלקים אחרים של המוח. כפי שנצפה, צביעה חיסונית נגד mCherry מובילה לזיהוי אמין יותר של ביטוי DREADD בהליך זה, זכור לטפל במיקרו-בועות בעדינות ולהבטיח שהחיה יציבה במהלך הדמיית ה-MRI והאינסונציה.

focused-ultrasound-induced-blood-brain-barrier-opening-for-targeting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Insonation של microbubbles היא אסטרטגיה מבטיח אבלציה הגידול במועד, בממוצע סמכויות מופחת אקוסטי, כמו גם עבור משלוח ממוקד של הרפוי. מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח נמוך מחזור אולטרסאונד אסטרטגיות פועם nanocarriers על מנת למקסם את אי - אבלציה תרמית כלי הדם ואספקת מטען אל תת עורית C6 gliomas.

אולטראסאונד ניגודיות ממוקד טיפול gliomas של עכברים באמצעות אספקת סמים נושאות Nanoparticle ו אבלציה כלי הדם

Microbubble בתיווך הפרעה אולטרסאונד ממוקד של מחסום דם מוח (BBB) ​​היא טכניקה מבטיחה למסירה פולשני התרופה ממוקדת...

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

סרטון זה מתאר שיטה לשיבוש זמני של מחסום הדם-מוח (BBB) על ידי יצירת פתחים חולפים באמצעות אולטרסאונד ממוקד בתיווך מיקרו-בועות (FUS). פתחי BBB מקומיים ארעיים אלה יכולים בסופו של דבר לשמש להעברת מולקולות תרופה גדולות יותר ישירות לתוך פרנכימה במוח.

מיקוד מבוסס אולטרסאונד מיקרו-בועות בתיווך מחסום דם-מוח: טכניקה ליצירת פתחים ארעיים מקומיים במחסום דם-מוח של עכבר על ידי סונופורציה

אולטרסאונד ממוקד עם סוכני microbubble יכול לפתוח את מחסום הדם מוח מוקדי חולף. טכניקה זו שימשה כדי לספק מגוון רחב של סוכנים על פני מחסום הדם מוח. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור מסירה מקומית למוח מכרסמים עם או בלי הדרכה MRI.

גישה ספסל למיקום ספציפי מחסום הדם מוח פתיחת באמצעות אולטרסאונד ממוקד במודל עכברוש

מחסום הדם - מוח (BBB) יכול להיות משובש באופן זמני עם אולטרסאונד ממוקד microbubble בתיווך (FUS). כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לפתיחת BBB בתפוקה גבוהה ב vivo באמצעות מערכת FUS מודולרית נגישה למומחים שאינם אולטרסאונד.

נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

מוצג כאן פרוטוקול כדי לפתוח באופן חולף את מחסום הדם - מוח (BBB) או במוקד או בכל מוח העכבר כדי לספק נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית ולהפעיל מיקרוגליה. כמו כן מוצגת שיטה לזהות את המסירה של נוגדנים והפעלת מיקרוגליה על ידי היסטולוגיה.

העברת נוגדנים למוח באמצעות אולטרסאונד סריקה ממוקדת

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניתוחיים והטכניים המאפשרים הדמיית פלואורסצנטיות מולטי-פוטונית בזמן אמת של מוח המכרסמים במהלך טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חמיצוץ מחסום הדם - מוח.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

מחקר זה מתאר הדמיית תהודה מגנטית משולבת (MRI) ופרוטוקול אולטרסאונד ממוקד פועם בעוצמה נמוכה (FUS), תוך שימוש בחולדות חיות עם צנתור וריד צוואר כדי לנטר את פתיחת מחסום הדם-מוח (BBB).

ניטור פתיחת מחסום דם-מוח בחולדות באמצעות מערכת אולטרסאונד ממוקדת פרה-קלינית

הטכניקה מתוארת בהרחבה על פתיחת מחסום דם מוח של עכבר באמצעות microbubbles ו אולטרסאונד. באמצעות טכניקה זו, מנגן יכול להינתן למוח עכבר. כי הוא מנגן חומר ניגוד MRI שמצטבר בנוירונים depolarized, גישה זו מאפשרת הדמיה של הפעילות העצבית.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

במחקר זה, אנו מציגים הליך קל ויעיל להערכת שיבוש מחסום הדם - מוח ניווניות בתנאים. כדי להשיג את המטרה שלנו, אנחנו חדורים משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין לתוך וריד הצוואר העכבר הווריד וההערכה שלה דליפה לתוך parenchyma המוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

הערכה של חדירות מחסום הדם - מוח על ידי עירוי תוך ורידי של התווית על-ידי FITC אלבומין במודל של עכברים של מחלות ניווניות

למדו כיצד לפתוח את מחסום הדם-מוח בעכברים באמצעות אולטרסאונד ממוקד ללא ניתוח, ולהעריך נוירומודולציה כימוגנטית באמצעות שיטות היסטולוגיות. פרוטוקול זה מאפשר מיקוד מדויק של תרופות גניות במוח.

אולטרסאונד ממוקד המושרה פתיחת מחסום דם-מוח למיקוד מבנים במוח והערכת נוירומודולציה כימוגנטית

גלה סרטונים נוספים