Name: אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: חקור שינויים בתאי חיסון וציטוקינים בריאות לאחר שבץ איסכמי באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 13 סוגי תאים ו-13 מולקולות פרו-דלקתיות בעכבר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH P20 GM109098 ותוכנית פרס החדשנות מפראספרו לאדווין וואן. ניסויי ציטומטריה של זרימה בוצעו במתקן ציטומטריה של זרימה WVU ומתקן ליבה של תא יחיד, הנתמך על ידי מענקי NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ו- P20 GM103434.

<ol><li>Lloyd, C. M., Marsland, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Homeostasis%3A+Influence+of+Age%2C+Microbes%2C+and+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System.</a> Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).</li>
<li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation%2C+Tissue+Repair%2C+and+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777(2018).</li>
<li>Hartl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immunity+of+the+Lung%3A+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li>
<li>Prass, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke-induced+immunodeficiency+promotes+spontaneous+bacterial+infections+and+is+mediated+by+sympathetic+activation+reversal+by+poststroke+T+helper+cell+type+1-like+immunostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).</li>
<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+reverses+stroke-associated+peripheral+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression.</a> Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).</li>
<li>McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic-mediated+loss+of+splenic+marginal+zone+B+cells+contributes+to+infection+susceptibility+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke.</a> Nature Communications. 8 (1), 15051(2017).</li>
<li>Dames, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+treatment+with+systemic+GM-CSF+augments+pulmonary+immune+responses+and+improves+neurological+outcome+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke.</a> Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).</li>
<li>Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CD147+Attenuates+Stroke-Associated+Pneumonia+Through+Modulating+Lung+Immune+Response+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice.</a> Frontiers in Neurology. 10, 853(2019).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+intraluminal+MCAO%3A+cerebral+infarct+evaluation+by+cresyl+violet+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4038(2012).</li>
<li>Farris, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+alters+immune+cell+niche+and+chemokine+profile+in+mice+independent+of+spontaneous+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection.</a> Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Cytokine+Profiling+of+Stimulated+Mouse+Splenocytes+Using+a+Cytometric+Bead-based+Immunoassay+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).</li>
<li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).</li>
<li>Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+Monocyte-Derived+Antigen-Presenting+Cells+Have+Distinct+Gene+Signatures+in+Experimental+Model+of+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2779(2019).</li>
<li>Zhai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+to+prepare+a+single+cell+suspension+of+isolated+quiescent+human+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells.</a> Science Reports. 9 (1), 12757(2019).</li>
<li>Platzer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-bound+IgE+functions+to+restrain+allergic+inflammation+at+mucosal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).</li>
<li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy1%2BIL-7%2B+lymphatic+endothelial+cells+in+iBALT+provide+a+survival+niche+for+memory+T-helper+cells+in+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).</li>
<li>Nakahashi-Oda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+epithelial+cells+control+the+abundance+of+Treg+cells+at+barrier+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces.</a> Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).</li>
<li>Barrott, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synovial+sarcoma+metastasis+in+the+mouse%3A+PI3%27-lipid+signaling+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Bouté, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C3HeB%2FFeJ+mouse+model+recapitulates+the+hallmark+of+bovine+tuberculosis+lung+lesions+following+Mycobacterium+bovis+aerogenous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection.</a> Veterinary Research. 48 (1), 73(2017).</li>
<li>Bal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1%CE%B2%2C+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li>
<li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+gamma%2Fdelta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים זיהוי של סוגי תאי חיסון הריאה וביטוי של כימוקינים או ציטוקינים באותו עכבר. אם רוצים מחקר היסטופתולוגיה, ניתן להסיר אונה בודדת ולתקן אותה למטרה זו לפני שממשיכים לשלבי הבידוד של התא הבודד. מגבלה אחת של שיטה זו היא שגישה זו עשויה שלא להתאים במסגרות מחלה מסוימות אם השינוי בהרכב תאי החיסון והביטוי של כימוקינים ו/או ציטוקינים צפויים להתחלק באופן לא שווה בין אונות שונות של הריאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים, כגון שחפת Mycobacterium, מראים נטייה להדבקת אונות מסוימות של הריאה<sup class="xref...

הריאות הן איבר מחסום, חשוף לסביבה החיצונית, ולכן הם מקבלים כל הזמן אתגרים אימונולוגיים כגון פתוגנים ואלרגנים1. הפעלת תאי חיסון תושבי ריאה וחדירת תאי חיסון מהפריפריה נדרשים כדי לנקות פתוגנים מהסביבה הריאתית. בנוסף, תאי מערכת החיסון המתגוררים בריאות שומרים על סבילות לחיידקים קומנסליים, מה שמרמז על כך שתאים אלה ממלאים תפקיד בסילוק פתוגנים ובשמירה על הומאוסטזיס1. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים הם בין תאי מערכת החיסון הזקיף המתגוררים בריאה החשים פתוגנים באמצעות קולטני זיהוי תבניות ומנקים פתוגנים אלה על ידי פאגוציטוזה2. תאים דנדריטיים תושבי ריאות מגשרים על התגובה החיסונית המולדת והנרכשת באמצעות הצגת אנטיגן3. בנוסף, תאי מערכת החיסון המולדת המקומית המופעלים מייצרים ציטוקינים וכימוקינים המגבירים את התגובה הדלקתית ומעוררים את חדירתם של תאי מערכת החיסון כגון מונוציטים, נויטרופילים ולימפוציטים לריאות1. שבץ איסכמי הוכח כמשנה חסינות מערכתית ומוביל לרגישות מוגברת לזיהום ריאתי; עם זאת, מחקרים מעטים העריכו את התא הריאתי לאחר שבץ איסכמי, אם כי כמה מחקרים בחנו אותו במהלך מצבים דלקתיים 4,5,6,7,8,9. מטרת השיטות המתוארות כאן היא לקבוע בו זמנית את הפתולוגיה של הריאות, את הרכב תאי החיסון ואת רמות הביטוי של ציטוקינים וכימוקינים בריאות כדי להעריך שינויים בתא הריאתי ולהעריך שינויים פוטנציאליים בתגובה החיסונית הריאתית בעקבות התקף איסכמי.
המתואר כאן הוא פרוטוקול לקבלת תרחיפים של תאים בודדים מהריאות של העכברים כדי לזהות 13 סוגים של תאים חיסוניים. פרוטוקול זה מבוסס על עיכול רקמות עם קולגן D ללא צורך בדיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול להכנת הומוגנטים של רקמות שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים או כימוקינים שונים באמצעות מערכי חרוזי מולטיפלקס מבוססי ציטומטריה זורמת. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות של שבץ איסכמי על חסינות ריאתית וניתן להשתמש בו גם במודלים אחרים של מחלות.

<table><tbody><tr><td>B220-APC, שיבוט RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>חרוזים 3 מיקום הומוגנייזר חרוזים</td><td>Benchmark Scientific</td><td>D1030</td><td>הומוגנייזר רקמות</td></tr><tr><td>CCR2-BV421, שיבוט SA203G11</td><td>Biolegend</td><td>150605</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD103-BV421, שיבוט 2E7</td><td>Biolegend</td><td>121422</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7, שיבוט M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>1:400 דילול</td></tr><tr><td>CD11c-PE/Cy7, שיבוט N418</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD11c-Percp/Cy5.5, שיבוט N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD4-BV421, שיבוט GK1.5</td><td>Biolegend</td><td>100443</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD45-FITC, שיבוט 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>CD64-APC, שיבוט X54-5/7.1</td><td>Biolegend</td><td>139306</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>CD8-PE, שיבוט 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100708</td><td>דילול 1:800</td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td>רכיב במאגר הדיסוציאציה</td></tr><tr><td>צינור מכסה בורג חרוטי</td><td>ThermoFisher</td><td>02-681-344</td><td>צינור להומוגניזציה של רקמות</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>10104159001 רכיב במאגר הדיסוציאציה</td></tr><tr><td>בלוק Fc CD16/32 נוגדן Biolegend</td><td></td><td>101320</td><td>1:100 דילול</td></tr><tr><td>genlteMACS דיסוציאטור</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>השוואה של עיכול ריאות עם או בלי דיסוציאטור מכני</td></tr><tr><td>gentleMACS C צינורות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>שפופרת לפירוק רקמות עם דיסוציאטור genlteMACS</td></tr><tr><td>עצירת מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטיל</td><td>ThermoFisher</td><td>78442</td><td>רכיב במאגר ההומוגניזציה</td></tr><tr><td>מוניטור דופלר לייזר</td><td></td><td>Moor MOORVMS-LDF</td><td>ניטור זרימת הדם במהלך tMCAO</td></tr><tr><td>LEGENDplex פאנל כימוקין פרו דלקתי</td><td>Biolegend</td><td>740451</td><td>מערך חרוזי מולטיפלקס</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD ניתן לתיקון כתם קרוב ל-IR</td><td>ThermoFisher</td><td>L34976</td><td>השתמש להרחקת תאים מתים במהלך ניתוח זרימה ציטומטרי</td></tr><tr><td>Ly6C-PE, שיבוט HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128008</td><td>דילול 1:800</td></tr><tr><td>Ly6G-BV510, שיבוט 1A8</td><td>Biolegend</td><td>127633</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>MCAO תפר L56 לשימוש חוזר 6-0 בינוני</td><td>Doccol</td><td>602356PK10Re</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>MHC II-BV510, שיבוט M5/114.15.2</td><td>Biolegend</td><td>107636</td><td>דילול</td></tr> <tr><td>1:800NK1.1-Percp/Cy5.5, שיבוט PK136</td><td>Biolegend</td><td>108728</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>Siglec F-PE, שיבוט E50-2440</td><td>BD Biosciences</td><td>552126</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>חוט תפר משי, גודל 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>SomnoSuite מערכת הרדמה</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>הרדמת עכבר עבור tMCAO</td></tr><tr><td>TCRb-BV510, שיבוט H57-897</td><td>Biolegend</td><td>109234</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניה/סיליקה, 2.3 מ"מ</td><td>Biospec</td><td>11079125z</td><td>חרוזים להומוגניזציה של רקמות</td></tr></tbody></table>

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

התרחבות תאי מערכת החיסון, הפעלתם וסחרם לריאות, הנשלטים על ידי ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים מרובים, עשויים להשתנות על-ידי פגיעה מוחית חמורה. עדות לכך היא העובדה כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים שסבלו משבץ איסכמי. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש באנליזה ציטומטרית של זרימה צבעונית כדי לזהות 13 סוגים של תאי חיסון בריאות של עכברים, כולל מקרופאגים אלוואולריים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, תאים דנדריטיים CD103+ או CD11b+ (DCs), פלסמציטואיד DCs, אאוזינופילים, מונוציטים / תאים שמקורם במונוציטים, נויטרופילים, תאי T ו- B שמקורם בלימפואידים, תאי NK ותאי NKT, בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, אנו מתארים את ההכנה של הומוגנטים ריאה באמצעות שיטת הומוגניזציה של חרוזים, כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים שונים או כימוקינים בו זמנית על ידי מערכי חרוזים מרובים יחד עם ניתוח ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובה החיסונית הריאתית במסגרות מחלה אחרות, כגון מחלת ריאות זיהומית או מחלה אלרגית.

לאחרונה דיווחנו כי אינדוקציה של שבץ איסכמי בעכברים משנה את הרכב תאי החיסון של הריאות11. באופן ספציפי, איסכמיה מוחית חולפת הגדילה את האחוזים של מקרופאגים, נויטרופילים ו- CD11b+ DCs, תוך הפחתת אחוזים של תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B, תאי NK ואאוזינופילים בתא הריאתי. יתר על כן, שינויים תאיים התאימו לרמות מופחתות באופן משמעותי של כימוקינים מרובים בריאות. מתוארת כאן שיטה לבידוד וזיהוי של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בתא הריאה. התוצאות המייצגות המוצגות כאן היו מעכברים שעברו אינדוקציה של tMCAO וניתוח בוש...

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור שינויים בסביבה הריאתית לאחר שבץ איסכמי. שיטה זו מאפשרת זיהוי של 13 סוגי תאי חיסון ריאה ו-13 ציטוקינים וכימוקינים שונים באותו עכבר באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו שימשה להערכת שינויים בסביבה הריאתית לאחר שבץ איסכמי.עם זאת, זה יכול לשמש גם לחקירת שינויים במהלך תגובה אלרגית או זיהום. כדי לבצע זלוף דרך הלב בכל הגוף, אשר חוסר תגובה לדוושה משתקפת בעכבר מורדם ואבטח את העכבר לפלטפורמה כירורגית. הרטיבו את הפרווה עם 70% אתנול כדי להפחית את פיזור הפרווה לחלל הגוף ובצעו חתך עור אנכי בקו האמצע כדי לחשוף את הצפק השלם, ועצרו את החתך ברגע שהגיעו לחלל בית החזה.השתמש במספריים לדיסקציה עדינה כדי לבצע חתך בקו האמצע של הצפק שעוצר בחלל בית החזה לפני והשתמש במלקחיים כדי לתפוס את הקצה הדיסטלי של עצם החזה. השתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת מבלי לפגוע בלב, בריאות או בכלי הדם. כאשר הרקמות הבסיסיות נראות לעין, בצע חתך דרך כלוב הצלעות ואבטח את צידי הצלעות כך שהלב והריאות יהיו חשופים במלואם.בצע בזהירות חתך קטן באטריום הימני ליד קשת אבי העורקים כדי לשמש כזרימה לזלוף והכנס במהירות אך בעדינות מחט בגודל 25 למשטח העליון הדיסטלי של החדר השמאלי. לאחר שהמחט במקומה, שטפו בעדינות 10 מיליליטר PBS קר לתוך הלב. הרקמה צריכה להתחיל להתנקות מדם.כאשר כל הנפח נמסר, יש להחדיר 10 מיליליטר שני של PBS קר עד שהכבד מציג מראה חום בהיר והריאות עוברות מצבע ורוד אדמדם לצבע לבן ברובו. בעזרת מלקחיים ומספריים לדיסקציה עדינה, הסר בזהירות את כל הרקמות שמסביב לפני הפרדת אונות הריאה והנחתן בצלחת פטרי המכילה מיליליטר עד שניים של תאי ריאה קרים, בינוניים על קרח. כדי להכין את רקמת הריאה למערכי חרוזים מרובים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה קרה לצינור של שני מיליליטר המכיל שלושה חרוזי זירקוניה/סיליקה סטריליים של 2.3 מיליליטר, ושקול את אונת הריאה המעניינת.העבירו 50 עד 100 מיליגרם של רקמת ריאה לצינור החרוזים המקורר מראש ולמאגר ההומוגניזציה והומוגניזציה של האונה באמצעות הומוגנייזר מבוסס חרוזים ב-4,000 סיבובים לדקה למשך שתי דקות לפחות. כאשר הרקמה הומוגנית לחלוטין, צנטריפוגה את הצינור כדי לשקוע את הרקמה ולהעביר את הסופר נטנט למיקרו צינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר על קרח. לדיסוציאציה של רקמת ריאה יש לשפוך בזהירות את מדיום תאי הריאה מאונה הריאה שנותרה ולהכניס מחט בגודל 25 לרקמה.הזרקו 200 עד 250 נפחי מיקרוליטר של מאגר דיסוציאציה לכל אונת ריאה כדי לנפח את הריאות עד שכל אחת מהאונות הוזרקה פעמיים עד שלוש. לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר השתמש במספריים לדיסקציה עדינה כדי לטחון את הריאות לחתיכות קטנות ולהעביר את תמיסת הרקמה לצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. הוסף שישה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה נוסף לדגימה ומערבולת במרץ למשך דקה אחת.לאחר מכן, דגרו על חתיכות הרקמה למשך 45 דקות במערבולת של 37 מעלות צלזיוס כל שבע עד שמונה דקות. בתום הדגירה, מערבל את הדגימה במרץ למשך דקה אחת והעביר את הדגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרון כדי להסיר שאריות של רקמת חיבור ואינטרסטיציאלית לא רצויה. אוספים את הרקמה על ידי צנטריפוגה ומשרים מחדש לגלולה עם חמישה מיליליטר מדיום ריאה קר.צנטריפוגה שוב של הדגימה והשעיית הכדור במיליליטר אחד של מדיום ריאה קר עם מערבולת עדינה. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננת של 100 מיקרון לפני הספירה. כדי להעריך את אוכלוסיות תאי החיסון בתוך רקמת הריאה המבודדת, זרע אחד עד פעמיים 10 עד שישי תאי כוח הוכנס למספר המתאים של בארות עם צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות והשליך את התאים לתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה.הוסף 25 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המתאים במאגר FACS קר לכל באר וערבב עם ליטוף צינור עדין. לאחר 20 דקות, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS קר לכל באר והעבירו את הדגימות לצינורות תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר פוליסטירן המכילים 150 מיקרוליטר של מאגר FACS נוסף לכל צינור. לאחר מכן, נתח מיד את הדגימות על ציטומטר זרימה על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים.בניתוח מייצג זה, זוהו 13 אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים בריאות באמצעות שלוש קבוצות של חמישה עד שבעה שילובי נוגדנים. תאים מתים לא נכללו באמצעות כתם מת חי וסוגי התאים החיסוניים השונים הובחנו באמצעות הנוגדנים והסמנים המפורטים בטבלה. מקרופאגים מכתשית ואינטרסטיציאלית, תאים דנדריטיים חיוביים ל-CD103 ו-CD11B ואאוזינופילים זוהו בקבוצה הראשונה.מונוציטים ונויטרופילים פרו-דלקתיים זוהו בתאי T חיוביים ל-CD4 ו-CD8, תאי B, תאים דנדריטיים פלסמציטואידים, תאי NK ותאי NKT זוהו בקבוצה השלישית. המספר הכולל של תאים ברי קיימא, אחוז התאים החיוביים ל-CD45 והמספר הכולל של תאים חיוביים ל-CD45 שהתקבלו היו דומים בין אוכלוסיות תאים שבודדו כפי שהודגם לבין אוכלוסיות תאים שבודדו באמצעות דיסוציאטור רקמות זמין מסחרית. בנוסף, אחוז מוות התאים בקרב תאים חיוביים ל-CD45 היה פחות מ-10% עבור שני הפרוטוקולים, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המוכח מאפשר התאוששות בעלת תפוקה גבוהה ואיכות תאים גבוהה ללא סיוע של דיסוציאטור רקמות אוטומטי.יתר על כן, שימוש במבחן מולטיפלקס זמין מסחרית יחד עם ניתוח זרימה ציטומטרי מאפשר לקבוע את ריכוז הכימוקין בכל דגימה למיליגרם רקמה. ריכוז הקולגנאז D, זמן הדגירה והטמפרטורה המשמשים במהלך בידוד התא הבודד משפיעים באופן קריטי על התאוששות תאי החיסון.

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הכנה מטוהרים של ריאות תאים דנדריטים עכבר מתואר. דגש ספציפי ניתנת הבידוד של תת קונבנציונאלי תאים דנדריטים.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה של IL- 8 האמרגן תלוי דלקת ההפעלה הריאות של עכברים באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשני (BLI). אותו בעל חיים יכול להיות נתון BLI מספר פעמים במשך עד חודשיים מזמן המסירה של הכתב לוציפראז לבנות.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

אוזון משולב ועכברים חשופים אנדוטוקסין חיידקי מראים מוות תאי נרחב, כולל זה של נויטרופילים. ראינו התאמות תאיות כגון שיבוש של lamellipodia ציטוסלטל, ביטוי תאי מוגבר של subunit סינתאז V ATP מורכב β ואנגיוסטין בשטיפת ברונכו-מכתשית, דיכוי התגובה החיסונית ריאות וגיוס נויטרופילים מעוכבים.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

חקור שינויים בתאי חיסון וציטוקינים בריאות לאחר שבץ איסכמי באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 13 סוגי תאים ו-13 מולקולות פרו-דלקתיות בעכבר.

אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

גלה סרטונים נוספים