אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור שינויים בסביבה הריאתית לאחר שבץ איסכמי. שיטה זו מאפשרת זיהוי של 13 סוגי תאי חיסון ריאה ו-13 ציטוקינים וכימוקינים שונים באותו עכבר באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי. שיטה זו שימשה להערכת שינויים בסביבה הריאתית לאחר שבץ איסכמי.

עם זאת, זה יכול לשמש גם לחקירת שינויים במהלך תגובה אלרגית או זיהום. כדי לבצע זלוף דרך הלב בכל הגוף, אשר חוסר תגובה לדוושה משתקפת בעכבר מורדם ואבטח את העכבר לפלטפורמה כירורגית. הרטיבו את הפרווה עם 70% אתנול כדי להפחית את פיזור הפרווה לחלל הגוף ובצעו חתך עור אנכי בקו האמצע כדי לחשוף את הצפק השלם, ועצרו את החתך ברגע שהגיעו לחלל בית החזה.

השתמש במספריים לדיסקציה עדינה כדי לבצע חתך בקו האמצע של הצפק שעוצר בחלל בית החזה לפני והשתמש במלקחיים כדי לתפוס את הקצה הדיסטלי של עצם החזה. השתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת מבלי לפגוע בלב, בריאות או בכלי הדם. כאשר הרקמות הבסיסיות נראות לעין, בצע חתך דרך כלוב הצלעות ואבטח את צידי הצלעות כך שהלב והריאות יהיו חשופים במלואם.

בצע בזהירות חתך קטן באטריום הימני ליד קשת אבי העורקים כדי לשמש כזרימה לזלוף והכנס במהירות אך בעדינות מחט בגודל 25 למשטח העליון הדיסטלי של החדר השמאלי. לאחר שהמחט במקומה, שטפו בעדינות 10 מיליליטר PBS קר לתוך הלב. הרקמה צריכה להתחיל להתנקות מדם.

כאשר כל הנפח נמסר, יש להחדיר 10 מיליליטר שני של PBS קר עד שהכבד מציג מראה חום בהיר והריאות עוברות מצבע ורוד אדמדם לצבע לבן ברובו. בעזרת מלקחיים ומספריים לדיסקציה עדינה, הסר בזהירות את כל הרקמות שמסביב לפני הפרדת אונות הריאה והנחתן בצלחת פטרי המכילה מיליליטר עד שניים של תאי ריאה קרים, בינוניים על קרח. כדי להכין את רקמת הריאה למערכי חרוזים מרובים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה קרה לצינור של שני מיליליטר המכיל שלושה חרוזי זירקוניה/סיליקה סטריליים של 2.3 מיליליטר, ושקול את אונת הריאה המעניינת.

העבירו 50 עד 100 מיליגרם של רקמת ריאה לצינור החרוזים המקורר מראש ולמאגר ההומוגניזציה והומוגניזציה של האונה באמצעות הומוגנייזר מבוסס חרוזים ב-4,000 סיבובים לדקה למשך שתי דקות לפחות. כאשר הרקמה הומוגנית לחלוטין, צנטריפוגה את הצינור כדי לשקוע את הרקמה ולהעביר את הסופר נטנט למיקרו צינור מקורר מראש של 1.5 מיליליטר על קרח. לדיסוציאציה של רקמת ריאה יש לשפוך בזהירות את מדיום תאי הריאה מאונה הריאה שנותרה ולהכניס מחט בגודל 25 לרקמה.

הזרקו 200 עד 250 נפחי מיקרוליטר של מאגר דיסוציאציה לכל אונת ריאה כדי לנפח את הריאות עד שכל אחת מהאונות הוזרקה פעמיים עד שלוש. לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר השתמש במספריים לדיסקציה עדינה כדי לטחון את הריאות לחתיכות קטנות ולהעביר את תמיסת הרקמה לצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. הוסף שישה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה נוסף לדגימה ומערבולת במרץ למשך דקה אחת.

לאחר מכן, דגרו על חתיכות הרקמה למשך 45 דקות במערבולת של 37 מעלות צלזיוס כל שבע עד שמונה דקות. בתום הדגירה, מערבל את הדגימה במרץ למשך דקה אחת והעביר את הדגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרון כדי להסיר שאריות של רקמת חיבור ואינטרסטיציאלית לא רצויה. אוספים את הרקמה על ידי צנטריפוגה ומשרים מחדש לגלולה עם חמישה מיליליטר מדיום ריאה קר.

צנטריפוגה שוב של הדגימה והשעיית הכדור במיליליטר אחד של מדיום ריאה קר עם מערבולת עדינה. לאחר מכן, סנן את התאים דרך מסננת של 100 מיקרון לפני הספירה. כדי להעריך את אוכלוסיות תאי החיסון בתוך רקמת הריאה המבודדת, זרע אחד עד פעמיים 10 עד שישי תאי כוח הוכנס למספר המתאים של בארות עם צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות והשליך את התאים לתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה.

הוסף 25 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המתאים במאגר FACS קר לכל באר וערבב עם ליטוף צינור עדין. לאחר 20 דקות, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS קר לכל באר והעבירו את הדגימות לצינורות תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר פוליסטירן המכילים 150 מיקרוליטר של מאגר FACS נוסף לכל צינור. לאחר מכן, נתח מיד את הדגימות על ציטומטר זרימה על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים.

בניתוח מייצג זה, זוהו 13 אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים בריאות באמצעות שלוש קבוצות של חמישה עד שבעה שילובי נוגדנים. תאים מתים לא נכללו באמצעות כתם מת חי וסוגי התאים החיסוניים השונים הובחנו באמצעות הנוגדנים והסמנים המפורטים בטבלה. מקרופאגים מכתשית ואינטרסטיציאלית, תאים דנדריטיים חיוביים ל-CD103 ו-CD11B ואאוזינופילים זוהו בקבוצה הראשונה.

מונוציטים ונויטרופילים פרו-דלקתיים זוהו בתאי T חיוביים ל-CD4 ו-CD8, תאי B, תאים דנדריטיים פלסמציטואידים, תאי NK ותאי NKT זוהו בקבוצה השלישית. המספר הכולל של תאים ברי קיימא, אחוז התאים החיוביים ל-CD45 והמספר הכולל של תאים חיוביים ל-CD45 שהתקבלו היו דומים בין אוכלוסיות תאים שבודדו כפי שהודגם לבין אוכלוסיות תאים שבודדו באמצעות דיסוציאטור רקמות זמין מסחרית. בנוסף, אחוז מוות התאים בקרב תאים חיוביים ל-CD45 היה פחות מ-10% עבור שני הפרוטוקולים, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המוכח מאפשר התאוששות בעלת תפוקה גבוהה ואיכות תאים גבוהה ללא סיוע של דיסוציאטור רקמות אוטומטי.

יתר על כן, שימוש במבחן מולטיפלקס זמין מסחרית יחד עם ניתוח זרימה ציטומטרי מאפשר לקבוע את ריכוז הכימוקין בכל דגימה למיליגרם רקמה. ריכוז הקולגנאז D, זמן הדגירה והטמפרטורה המשמשים במהלך בידוד התא הבודד משפיעים באופן קריטי על התאוששות תאי החיסון.