ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים

המאפיין העיקרי של פרוטוקול זה, ניתן ליישם אותו על מגוון רחב של ננו-חומר תחמוצת ברזל-ברזל. כמו כן, ניתן ליישם אותו על ננו-חומר מרובה מקטעים, כגון ננו-חוטי ברזל-זהב. פרוטוקול זה יכול להתבצע בבטחה בכל מעבדה ביולוגית סטנדרטית.

היתרונות העיקריים של טכניקת ביו-פונקציונליזציה זו הם היכולת לייצר ננו-חומר ממוקד ספציפי המבוסס על קשר קוולנטי חזק בין הננו-חוט לנוגדנים. התחל בחיתוך דיסקיות האלומיניום לחתיכות קטנות בעזרת להב קצה אחד ופטיש קטן. מניחים את החלקים החתוכים לתוך צינור של שני מיליליטר וממלאים אותו במיליליטר אחד של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד, ומוודאים שכל חלקי האלומיניום מכוסים.

השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר במכסה אדים כימי למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הסר את חתיכות האלומיניום בעזרת פינצטה ושמור את הננו-חוטים המשוחררים בנתרן הידרוקסיד למשך 30 דקות נוספות. הנח את הצינור במתלה יבש מגנטי, המתן שתי דקות והחלף את התמיסה בנתרן הידרוקסיד טרי.

סוניק את הצינור של שני מיליליטר עם הננו-חוטים למשך 30 שניות והשאיר אותו למשך שעה בתוך מכסה אדים כימי. חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים. בסיום, הנח את הצינור של שני מיליליטר במדף המגנטי, השליך את הנתרן הידרוקסיד והחלף אותו במיליליטר אחד של אתנול מוחלט.

סוניקציה של הננו-חוטים למשך 30 שניות, הנח את הצינור במדף המגנטי והחלף את האתנול. חזור על שטיפת האתנול לפחות ארבע פעמים. לאחר שטיפת הננו-חוטים, העבירו אותם לצינור זכוכית של חמישה מיליליטר עם פיפטה של מיליליטר.

הוסף 100 מיקרוליטר של APTES לתמיסת הננו-חוטים וסובב את צינור הזכוכית למשך 20 שניות. הניחו את הצינור באמבט אולטראסוני והפכו אותו לסוניקציה למשך שעה. לאחר מכן הוציאו את הצינור מהאמבטיה והוסיפו 400 מיקרוליטר מים נטולי יונים ו -20 מיקרוליטר נתרן הידרוקסיד מולארי אחד.

חזור על הסוניקציה של שעה. לאחר הוצאת צינור הזכוכית מהאמבטיה האולטרה-סונית, הנח אותו ליד מגנט כדי לאסוף את הננו-חוטים. החלף את הסופרנטנט במיליליטר אחד של אתנול מוחלט טרי וסוניקציה של הצינור למשך 10 שניות.

חזור על שטיפת האתנול והסוניקציה פעמיים. ממיסים 0.4 מיליגרם של EDC ו-1.1 מיליגרם של Sulfo-NHS ומיליליטר אחד של MES בשפופרת של שני מיליליטר. בצינור נוסף של שני מיליליטר, הוסף 960 מיקרוליטר של PBS 0.1 מולארי והוסף לו 30 מיקרוליטר נוגדן נגד CD44.

לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת ה-EDC/Sulfo-NHS שהוכנה בעבר לצינור זה. מניחים את צינור הנוגדן בשייקר ומנערים אותו בחום של 10 פעמים G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הניחו מגנט ליד הצינור עם הננו-חוטים המצופים ב-APTES למשך שתי דקות, השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-PBS.

סוניקציה של הננו-חוטים למשך 10 שניות. לאחר הכביסה האחרונה עם PBS, אספו את הננו-חוטים והעבירו את תמיסת הנוגדנים המופעלת לצינור הננו-חוטים. ואז סוניקציה למשך 10 שניות.

החזר את הצינור למסובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, אספו את הננו-חוטים עם המגנט והשליכו את הסופרנטנט. הוסיפו מיליליטר אחד של 2% BSA ודגרו על הצינור למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום את התגובה.

ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה של אובדן אנרגיה אלקטרונית או במפות EELS כדי להמחיש את אטומי הסיליקון על פני הננו-חוטים ולאשר את נוכחותו של ציפוי APTES. על הננו-חוטים הלא מצופים, אטומי הברזל נראים כחולים כהים והאטומים המעורבים של ברזל וחמצן הם כחולים בהירים. מיפוי ה-EELS המקביל של ננו-חוטים לא מצופים מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז מאשר על פני השטח, מה שמעיד על מבנה תחמוצת ברזל-ברזל.

המיפוי הראה כי שכבת תחמוצת הברזל מורכבת מיותר תחמוצת ברזל (II, III) מאשר תחמוצת ברזל (III). האנטיגניות של הנוגדנים המחוברים אושרה באמצעות מבחני המשקעים החיסוניים והכתם המערבי. בדיקת ה-BCA שימשה לכימות מספר הנוגדנים על הננו-חוטים.

מדידת פוטנציאל זטה שימשה להבהרת פונקציונליזציה של פני השטח. קבוצת האמין הטרמינלי ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי בהשוואה לננו-חוטים לא מצופים. פונקציונליזציה של נוגדנים הפחיתה עוד יותר את המטען.

מיקוד התאים הספציפי של הננו-חוטים המתפקדים על ידי נוגדנים אושר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. איורים A ו-B מייצגים את תמונות מיקרוסקופ השדה הבהיר של דגימה C ו-D בהתאמה. הצבע האדום מתאים לתיאור קרום התא, כחול מייצג את הגרעין, והצבירים הירוקים מתארים נוכחות של ננו-חוטי CD44 מחוברים וממוקדים.

יתר על כן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא כדי לוודא שהננו-חוטים הלא מצופים, מצופים APTES ומצופים נוגדנים תואמים ביולוגית. בציפוי תהליך APTES, חשוב מאוד להוסיף את המים נטולי היונים לפני תמיסת הנתרן הידרוקסיד כדי לשפר את הקשר בין מולקולת APTES לננו-חוטים. כמו כן, במהלך תהליך הפונקציונליזציה הביולוגית, יש צורך לשטוף את הננו-חוט עם מאגר PBS כמה פעמים כדי לשפר את הקשר הקוולנטי בין הנוגדן לננו-חוטים.