Name: ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למדו פרוטוקול לביופונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות ננו-חוטי ברזל ואנטיגנים לטירגוט ספציפי של תאי סרטן. השיטה מאפשרת מסירה ממוקדת של תרופות בטיפולים אונקולוגיים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה (KAUST).

אזהרה: יש להיוועץ תמיד בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים ובציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות). בצע את כל התגובות הביולוגיות במכסה האדים הביולוגי.
הערה: פרוטוקול זה מיועד לייצר 2 x 10 10 NWs/mL ביו-פונקציונליים שווה ערך ל-0.36 מ"ג ברזל/מ"ל המצופים בנוגדנים נגד CD44 עם צפיפות של 3 x10 4 נוגדנים/NW. תחמוצת ברזל-ברזל (מעטפת הליבה) NW הם באורך 2.5 מיקרומטר ויש להם קוטר של 41.5 ננומטר.
1. שחרור ננו-חוטי ברזל
הערה: תהליך הייצור של תחמוצת ברזל / תחמוצת ברזל NW הוסבר בפירוט בפרסום קודם59.
<ol><li>על משטח חיתוך, חתכו את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) באמצעות להב קצה יחיד ופטיש קטן כדי להתאים לצינור של 2 מ"ל. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את חתיכות האל הקטנות לצינור.</li>
	<li>מלאו את צינור 2 מ"ל, המכיל את חתיכות Al הקטנות, עם 1 מ"ל של 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH). ודא שכל חתיכות Al מכוסות ב- NaOH.</li>
	<li>השאירו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>הסירו רק את חתיכות ה-Al באמצעות הפינצטה ושמרו את ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) ששוחררו בתמיסת NaOH למשך 30 דקות נוספות. אל תשנה את פתרון NaOH.</li>
	<li>אספו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף מגנטי והמתינו 2 דקות לפני הסרת תמיסת ה-NaOH הישנה בנפח 1 מ"ל. החלף אותו בתמיסת NaOH טרייה.</li>
	<li>סוניק את צינור 2 מ"ל המכיל את NWs במשך 30 שניות ולהשאיר אותו 1 שעה בתוך מכסה אדים כימי.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.5-1.6 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת NaOH והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט.</li>
	<li>סוניק את הצינור למשך 30 שניות.</li>
	<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.</li>
	<li>השליכו את תמיסת האתנול האבסולוטית הישנה והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 30 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.11 ו- 1.12 לפחות ארבע פעמים.</li>
	<li>שמור את NWs ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט בטמפרטורת החדר עד שהם נחוצים.</li>
	<li>למדוד את ריכוז הברזל ומכאן את NWs באמצעות ספקטרומטריית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, עבור אחסון לאורך זמן, אל תשחרר את NWs מתבנית Al עד שיהיה צורך. שמירה על NW משוחרר מזרז אתנול במשך זמן רב ללא סוניקציה תכופה תיצור צברים כי יהיה צורך פעמים ארוכות יותר של סוניקציה כדי להיות מופרד.</li>
</ol>2. ציפוי הננו-חוטים ב-APTES
הערה: בפרוטוקול זה, 100 μL של תמיסת APTES (צפיפות של 0.946 גרם/מ"ל61) מספיקים כדי לצפות 1.6 x 107 מ'2/g של NWs. אם יש שינוי ביחס או במסה של הננו-חומר, יש להתאים את נפח APTES בהתאם.
<ol><li>העבר את NWs משלב 1.14 לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>כדי לאסוף את כל NWs שנותרו בצינור 2 מ"ל, לשטוף את הצינור הריק 2 מ"ל פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל של אתנול מוחלט ולהעביר אותו לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>באמצעות פיפטה, לקחת 100 μL של APTES ולהוסיף אותו לפתרון NW ישירות.</li>
	<li>מערבול את צינור הזכוכית 5 מ"ל במשך 10 שניות.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל על המהדק של מעמד תגובה במעבדה.</li>
	<li>מניחים מחצית מצינור הזכוכית 5 מ"ל בתוך המים של האמבטיה העל-קולית וסוניקטים למשך שעה אחת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה העל-קולית והוסיפו 400 מיקרוליטר מים דה-יוניים (DI) ואחריו 20 מיקרוליטר של 1 M NaOH (קטליזה בסיסית). זהירות: חשוב להוסיף תחילה את מי DI.</li>
	<li>כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל, כפי שמוסבר בשלבים 2.5-2.6, וסוניקט למשך שעה נוספת.</li>
	<li>הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה הקולית.</li>
	<li>הניחו מגנט ליד צינור הזכוכית למשך 5 דקות כדי לאסוף את ה- NWs.</li>
	<li>החליפו את הסופרנאטנט ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.10-2.11 ארבע פעמים.</li>
	<li>העבר את כל האתנול המרחף NW לצינור זכוכית חדש של 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את NW מצופה APTES בשפופרת זכוכית עם אתנול עד שהם נחוצים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>3. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים
<ol><li>הפעלת הנוגדנים הערה: כדי להשיג כ-3 x 104 חלקים של נוגדן/NW, יש להשתמש ב-30 מיקרוליטר של נוגדן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 0.1 מ"ג ברזל.<ol><li>בצינור של 2 מ"ל, יש להמיס 0.4 מ"ג של 3-3-דימתיל-אמינופרופיל קרבודימיד (EDC) ו-1.1 מ"ג של סולפו-N-הידרוקסי-סולפוסוקסינימיד (Sulfo-NHS) ב-1 מ"ל של הידרט חומצה אתנסולפונית 2-N-מורפולינו (MES) (pH 4.7). הערה: תערובת EDC/sulfo-NHS צריכה להיות טרייה ומוכנה לפני השימוש.</li>
		<li>בצינור חדש של 2 מ"ל, הוסף 30 μL של נוגדן נגד CD44 (1 מ"ג / מ"ל), 960 μL של 0.1 M של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7), ו 10 μL של תערובת EDC / sulfo-NHS (מוכן בשלב 3.1.1), בהתאמה.</li>
		<li>הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל בשייקר צינור בגודל 10 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת ננו-חוטים מצופים APTES<ol><li>במהלך הדגירה בת 15 הדקות בשלב 3.1.3, שטפו את ה-NWs על ידי הצבת מגנט ליד צינור ה-NWs המצופה APTES (משלב 2.13) למשך 2 דקות כדי לאסוף את ה-NWs.</li>
		<li>השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-1 מ"ל של 0.1 מ"ל PBS (pH 7), ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך 10 שניות.</li>
		<li>חזור על שלב 3.2.1-3.2.2 ארבע פעמים.</li>
		<li>אסוף את ה- NWs, כפי שמוסבר בשלב 3.2.1, והשלך את PBS 0.1 M. שמור את NWs בצינור ללא כל פתרון.</li>
	</ol></li>
	<li>התקשרות הנוגדנים<ol><li>העבר את כל תמיסת הנוגדנים המופעלת (שהוכנה בשלב 3.1.3) לצינור NWs (מוכן ב- 3.2.4) וסוניקט למשך 10 שניות.</li>
		<li>הניחו את צינור הזכוכית במסובב למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>אספו את ה-NWs באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והשליכו את הסופר-נטנט.</li>
		<li>הוספת 1 מ"ל של תמיסת אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) למשך שעה אחת ב-4°C כדי לחסום את התגובה.</li>
		<li>בדוק את האנטיגניות של NW פונקציונלי נוגדנים, למשל, באמצעות immunoprecipitation (IP) ו כתם מערבי (WB) assays. הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, השתמש ב- NW הפונקציונלי ביולוגית בבדיקת IP, WB או תאימות ביולוגית מיד לאחר שלב החסימה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. בדיקת תאימות ביולוגית
הערה: כדי לחקור את התאימות הביולוגית של NWs, ניתן להשתמש במבחני כדאיות תאים שונים ובקווי תאים שונים. ריכוז ה-NWs המשמשים כאן מבוסס על פרסום קודם16. זריעת התאים צריכה להיעשות יום אחד לפני התפקוד הביולוגי של NW.
זהירות: כל השלבים הבאים צריכים להיעשות תחת ארון הבטיחות הביולוגית.
<ol><li>בצלחת של 96 בארות, זרעו תשע בארות עם 4 x 104 של תאי סרטן המעי הגס (קו תאי HCT116) מרחפים במדיה של תרבית תאים של McCoy (100 μL / באר) ומניחים אותו בתוך האינקובטור למשך הלילה ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 3.3.4) עם PBS על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחלף את התמיסה הישנה ב-1 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7). חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>שטפו את ה-NWs (משלב 4.2) עם המדיה המחוממת של McCoy על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחליפו את PBS הישן ב-1 מ"ל של מדיה מחוממת של McCoy. חזור על שלב זה שלוש פעמים.</li>
	<li>איסוף NWs (משלב 4.3) באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 ולהחליף את 1 מ"ל של מדיה מחוממת McCoy עם 900 μL של מדיה מחוממת McCoy. ריכוז NWs צריך להיות 0.02 מ"ג של NWs לכל מ"ל.</li>
	<li>קח את צלחת 96 בארות (משלב 4.1) מן האינקובטור אל ארון הבטיחות הביולוגית.</li>
	<li>מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, השליכו את המדיה הישנה מהתאים והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של NW מרחף (שהוכן בשלב 4.4).</li>
	<li>נערו את הצלחת (שהוכנה בשלב 4.6) ביד ולאחר מכן דגרו עליה במשך 24 שעות בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
	<li>למחרת, הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.7) מהאינקובטור. תחת ארון הבטיחות הביולוגית, הוסף 11 μL של מגיב כדאיות התא (טבלה של חומרים) לכל באר באמצעות פיפטה מרובת דפנות.</li>
	<li>נערו את הצלחת עם שייקר הצלחת במהירות של 10 x גרם במשך 10 שניות.</li>
	<li>דוגרים על הצלחת במשך שעה באינקובטור.</li>
	<li>הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.10) מהאינקובטור. קרא את הלוח בקורא המיקרו-צלחות (רשימת חומרים) על-ידי מדידת הספיגה של מגיב הכדאיות של התא (עירור 540 ננומטר, פליטה 590 ננומטר).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כמו בכל שיטת ייצור וציפוי ננו-חומרים, נדרשת איכות גבוהה של הפתרונות המשמשים. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרונות השחרור (1 M NaOH) והפונקציונליות (MES) מספר פעמים. עם זאת, בדיקת ערך ה- pH שלהם לפני תחילת תהליך חדש חשובה מאוד. בשלב השחרור, שטיפת NWs עם NaOH צריך להתבצע לפחות ארבע פעמים. ככל שהכביסה טובה יותר, כך יציבות ה-NW טובה יותר ופחות הם מצטברים. שכבת התחמוצת משפרת את יציבות ה-NWs בעת טבילה באתנול או במים63.
הקוטר והאורך של ה-NW הושפעו לאחר שציפויים אותם ב-APTES ובנוגדנים. כאן, הקוטר גדל מ 41.5 ננומטר ל 70 ננומטר, ואת האורך ירד מ 2.5 מיקרומטר ל 1.6 מיקרומטר, בשל שלבי סוניקציה לשבור NWs. לכן, חיוני לאפיין את המורפולוגיה של NWs לאחר שלב biofunctionalization.
החיבור של הנוגדנים ל- NWs מסתמך על האינטראקציה הקוולנטית בין קבוצת האמין (על APTES) לבין קבוצת הקרבוקסיל (על הנוגדן). לכן, אישור נוכחותו של ציפוי APTES הוא צעד חשוב, שעבורו השתמשנו במיפוי EELS. שיטת הציפוי בטוחה ופשוטה. זה לא צריך טמפרטורות גבוהות או זמני דגירה ארוכים. כמו כן, ציפוי APTES פועל כמקשר כדי לאפשר התקשרות קוולנטית של נוגדנים או חלבונים אחרים שיש להם קבוצת קרבוקסיל.
במקרה של תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדן, האנטיגניות של אתרי הקישור של הנוגדנים לאחר תהליך biofunctionalization יכול להיות מושפע. ניתן להשתמש בשיטת IP ו- WB כדי לחקור בעיה זו. שימוש בשיטת הביו-פונקציונליזציה המוזכרת בפרוטוקול זה יאפשר לנוגדנים להיקשר ל-NWs עם אנטיגניות גבוהה לקולטן תא מסוים. יתר על כן, תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדנים הוסיף את היכולת לכוון את התאים עם קולטן של עניין, CD44 כאן. זה אושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. למרות שהתאימות הביולוגית של NWs לא מצופים הייתה גבוהה (>95%), הוספת ציפוי APTES או נוגדנים ל- NWs שיפרה את התאימות הביולוגית שלהם ב- 100%.
יתר על כן, פרוטוקול הציפוי והביו-פונקציונליזציה יעיל, חסכוני וניתן לשחזור. זה צריך להיות ישים לכל ננו-חומר תחמוצת ברזל אחר, שבו ריכוז הציפוי והנוגדנים המחוברים צריך להיות אופטימלי בהתבסס על שטח הפנים והמסה של הננו-חומר. פרוטוקול זה יכול להיעשות בבטחה בתנאי הסביבה במעבדה הכללית. הביו-פונקציונליזציה שיפרה באופן משמעותי את התאימות הביולוגית של הננו-חומר ואת יכולת המיקוד שלו. באופן כללי, NWs הם חומרים מבטיחים ביותר עבור יישומים ננו-רפואיים (כולל טיפולים רב-מודאליים או קומבינטוריים, זיהוי או הנחיה של תאים, וחישה ביולוגית). בשילוב עם ביו-פונקציונליזציה, כפי שמתואר כאן, ניתן להשיג מיקוד תאים ספציפי לשיפור הדיוק והיעילות.

תכונה ייחודית של ננו-חומרים מגנטיים היא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים1, אשר ניתן לנצל לתועלת כדי להפעיל אותם בדרכים רבות , בעוד שהם יכולים גם להיות מנוטר, למשל, על ידי דימות תהודה מגנטית (MRI). בעת החלת שדה מגנטי לסירוגין בתדר גבוה, הם יכולים ליצור חום, אשר יכול לגרום היפרתרמיה, מתן אפשרות טיפולית1. גישה נוספת היא טיפול פוטותרמי, אותו ניתן לממש באמצעות לייזר אינפרא אדום קרוב (NIR) 2,3.
בין המספר הגדול של ננו-חומרים מגנטיים, תחמוצת ברזל קיבלה את תשומת הלב הגדולה ביותר ביישומים ביולוגיים כגון הפרדה מגנטית, היפרתרמיה2,4, הנחיית תאים5, אספקת תרופות 6,7,8, וכחומר ניגוד ב- MRI 9,10. זאת בשל תאימות ביולוגית גבוהה שלהם 11,12, מגנטיזציה גדולה 11,12, יכולת להיות מצופה 9,13,14,15, יכולת לשאת תרופות 2,16, יכולת לתפקד עם תרופות2,16 או/ו סוכני מיקוד12,13,17,18, ויכולת להמיר אנרגיה אופטית לחום2. לאחרונה, MagForce החלה בניסויים קליניים בחולי סרטן המשתמשים בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל לטיפול בהיפרתרמיה19.
לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) מנוצלים יותר ויותר ליישומים ביו-רפואיים 3,11,16,20,21,22. יש להם תכונות דומות לננו-חרוזים מגנטיים, אך הם מציעים צורה אנאיזוטרופית ומומנט מגנטי גדול מאוד, המאפשר שליטה מרחוק יעילה מאוד על ידי שדה מגנטי23,24, כולל הפעלה בתדר נמוך כדי לגרום לאפקטים מגנטו-מכניים 25,26,27,28,29. כתוצאה מכך, NWs יושמו עבור יישומים ביולוגיים שונים כגון בידוד אקסוזומים30 מעקב אחר תאים 21, טיפול בסרטן 3,11,16, אספקת תרופות 16,31,32, וכחומר ניגוד MRI 33.
ננו-חומרים מגנטיים ביו-פונקציונליים בעלי יכולת מיקוד תאים ספציפית הם בעלי פוטנציאל גדול ליישומים ביו-רפואיים וברפואה מדויקת34,35. כדי לחבר את סוכני המיקוד הללו, נדרש שינוי פני השטח של הננו-חומרים. בדרך כלל, הם זקוקים לציפוי המספק קבוצה פונקציונלית, המאפשרת את החיבור של הסוכנים המטפלים. בספרות, יש מספר רב של ציפויים אורגניים ואי-אורגניים עבור ננו-חומרים מגנטיים. בהתבסס על הקבוצה הפונקציונלית שניתן לשתק לננו-חומר, ניתן לסווג ציפויים אלה לארבע קבוצות עיקריות: מולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית, פולימרים, היסטידין ומולקולות המבוססות על קבוצות סילאן.
המולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית היא אחת משיטות שינוי פני השטח. הוא מנצל את האהדה הגבוהה בין קבוצת החומצה הקרבוקסילית השלילית על הציפוי לבין המטען החיובי על הננו-חומרים המגנטיים36,37,38. תהליך הקשירה של חומצה קרבוקסילית למשטח מתכת עשוי לכלול יצירה של מלחי מתכת-קרבוקסילט או היצמדות של קבוצת הקרבוקסיל למתכת. עם זאת, עבור NW רב-מקטעים, כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs, שיש להם תכונות מעולות עבור יישומים ביולוגיים39,40, סוג זה של ציפוי לא יכול להיות מיושם בקלות. הוא דורש שני ציפויים שונים בו זמנית: קבוצות תיול לשינוי מקטעי הזהב וקבוצות קרבוקסיל למקטעים מגנטיים (ברזל או ניקל)38. כמה דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות קרבוקסיל הן המטופורפירין, חומצה פימלית, חומצה פלמיטית, וחומצה פרופיונית 3-[(2-אמינואתיל) דיתיו] (AEDP)38. שינויים בפני השטח של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות פולימרים מציעים כמה יתרונות ברורים. בשל המשקל המולקולרי הגדול של הפולימרים, הוא משפר את יציבות הננו-חומר המגנטי בתמיסה38. עם זאת, זה יגדיל באופן משמעותי את גודל ננו-חומר38. פוליוויניל פירולידון (PVP), פוליאתילנימין (PEI), חומצה אספרטית ארגינין-גליצין-D (RGD) ופוליאתילן גליקול (PEG) הם כמה דוגמאות לפולימרים הנפוצים ביותר לשינויים בפני שטח. לכל אחד מהם תכונות משלו ומשתמשב-38. שיטת שינוי פני השטח השלישית היא באמצעות ציפוי היסטידין. היסטידין הוא חלבון בעל שרשרת צדדית של חומצות אמינו היסטידין בעל זיקה גבוהה למספר מוגבל של ננו-חומרים מגנטיים כגון ניקל38. ניתן להשתמש בו לתהליכי טיהור חלבונים 38,41,42. ציפוי היסטידין יכול להיות מיושם גם על NW רב-מקטעים, כגון ניקל/זהב NWs38. סילניזציה של משטח ננו-חומר היא תהליך מבוסס היטב 38,43,44. הוא מבוסס על אטום סיליקון המקושר לכל משטח תחמוצת מתכת באמצעות שלושה קשרים בודדים, ובמקביל אטום סיליקון זה נקשר לקבוצה הפונקציונלית בסוף דרך שרשרת אלקיל 38,43,44. היתרון של ציפוי זה הוא מתן קבוצות אמין חופשיות, ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים38,45, כגון ניקל וזהב, בהתאמה. לכן, שימוש במולקולות המבוססות על קבוצת המלח הוא מסלול מעשי לביו-פונקציונליזציה של NW רב-מקטעים. דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות סילאן הן (3-aminopropyl), triethoxysilane (APTES) ו-(3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS)38,45.
הוספת חומר מיקוד לציפוי יכולה למלא תפקיד משמעותי הן באבחון והן בטיפול בתאים חולים, ובמקביל למזער את תופעות הלוואי על רקמות בריאות46,47. הוספת חומר מיקוד על פני השטח של ננו-חומרים משפרת הן את הקישור הסלקטיבי התאי והן את ההפנמה באמצעות קולטני אנדוציטוזה7. ללא ליגנדות מטרה אלה, ננו-חומרים מתקשרים באופן לא ספציפי עם קרום התא, אשר נקשר בקצב נמוך יותר בהשוואה לננו-חומרים עם ליגנדות48. אחד האתגרים במיקוד רקמות סרטניות הוא הדמיון האופייני שלהן לרקמות בריאות. לכן, הצלחת המיקוד תלויה בעיקר בקביעת הליגנד המתאים לשימוש כמטרה ביולוגית49,50. סוכני מיקוד שונים שימשו כדי לכוון ננו-חומרים לתאי סרטן48,51 (למשל, CD44, בשל הביטוי הגבוה שלו בתאי סרטן בהשוואה לתאים בריאים52,53,54,55).
ניתן לסווג את סוכני המיקוד לשלוש קבוצות עיקריות, בהתבסס על המרכיבים מהם הם עשויים ומורכבותם: מיקוד מבוסס אפטמר, מיקוד מבוסס ליגנד ומיקוד מבוסס נוגדנים. Aptamers הם גדילים קצרים מסונתזים כימית של DNA או RNA-oligonucleotides המקופלים למבנים דו ותלת ממדיים, מה שהופך אותם מסוגלים להתמקד אנטיגן מסוים, לרוב חלבונים56. מיקוד מבוסס ליגנד כולל פפטידים ושרשראות חומצות אמינו קצרות57. מיקוד מבוסס נוגדנים כרוך בשימוש בנוגדן שלם, או במקטעי נוגדנים, כגון מקטעים משתנים בעלי שרשרת אחת או מקטעים קושרי אנטיגן51. לשימוש בשיטה זו יש יתרון בכך שיש לו שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה לאנטיגן המטרה הספציפי שלו, מה שמקנה לו סלקטיביות גבוהה ביותר58. אתרי הקשירה מקבילים למנעול והאנטיגן למפתח58.
בעבודה זו, NWs בשימוש יוצרו על ידי אלקטרודפוזיציה על ממברנות תחמוצת אלומיניום, שיטה שתוארה בפירוט בפרסום קודם59. ההתמקדות כאן היא בשחרור NW אלה של תחמוצת ברזל-ברזל (קליפת הליבה) מהממברנות ותפקודם הביולוגי עם נוגדנים ספציפיים כדי לספק יכולת מיקוד. הנוגדנים אינם יכולים להיקשר ישירות לתחמוצת הברזל-ברזל NWs ודורשים מקשר. ציפוי ה-NWs ב-APTES מספק קבוצות אמין חופשיות, מה שמאפשר את ההתקשרות הקוולנטית דרך קבוצת הקרבוקסיל על הנוגדנים (איור 1). היתרון של ציפוי APTES הוא היכולת שלו לעבוד הן עבור חומרים מגנטיים21 והן עבור חומרים לא מגנטיים60 , כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs45. ניתן להשתמש בכל שלבי הציפוי והביו-פונקציונליזציה המוסברים בפרוטוקול זה עם כל ננו-חומר של תחמוצת ברזל/ברזל, באופן כללי. NW של תחמוצת ברזל / ברזל שימשו כאן כדוגמה. התוצאות מראות כי NWs פונקציונלי נוגדנים יש אנטיגניות גבוהה קולטנים פני התא ספציפיים, אשר יכול לשמש עבור יישומים שונים. דוגמאות כוללות הפרדת תאים, אספקת תרופות, טיפול ספציפי בתאים סרטניים באמצעות טיפולים פוטותרמיים ו / או מגנטו-מכניים.

<table><tbody><tr><td>צינור 2 מ"ל (מיקרוצנטריפוגה עם מכסה הצמד)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morpholino Ethaneהידרט חומצה סולפונית 99% (MES)</td><td>ריכוז AC172590250 Thermscientific</td><td></td><td>0.1 M ו-pH 4.7</td></tr><tr><td>3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC)</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>919302 צינור זכוכית 5 מ"ל</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות (תחתית שטוחה)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>שיבוט 515, ריכוז 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>APTES ((3-אמינופרופיל)טריאתוקסילן), 99%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>919-30-2</td><td>ריכוז 99%</td></tr> <tr><td>BCA (פירס ערכת בדיקת חלבון BCA)</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>9048-46-8</td><td>ריכוז 35%</td></tr> <tr><td>חממת תאים</td><td></td><td>מגיב</td> כדאיות תאים 50116047 <td></td>תרמופישר</tr><tr><td></td><td>AlamarBlue,Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>תאי סרטן המעי הגס - קו תאים HCT116</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>פטיש</td><td></td><td></td> עץ קשה <td>ניתן להשתמש בכל כלי פטיש, אין מותג ספציפי.</td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה פלזמה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-MS)</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>התוכנה המשמשת היא "מפגש בקרת מכשיר אלן"</td></tr><tr><td>מעמד רטרט מעבדה עם מהדק</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>זה משמש לטיפול בצינור הזכוכית של 5 מ"ל באמבט הסוניקטור.</td></tr><tr><td>מתלה מגנטי (מגנט DynaMag-2)</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy' s 5A בינוני 1x</td><td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלטות (ספקטרופוטומטר ספיגה Bio-Rad xMark)</td><td>תוכנת Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 (#168-9520)</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 10x</td><td>ריכוז 14200067 ג'יבקו</td><td></td><td>0.1 מ' (ללא סידן, ללא מגנזיום)</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 1x</td><td>ריכוז 14190136 ג'יבקו</td><td></td><td>0.01 מ' (ללא סידן, ללא מגנזיום)</td></tr><tr><td>שייקר צלחות (Microplate Genie)</td><td>Scientific Industries (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח חד-קצה</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodum hydrixide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>ריכוז 1 M, pH 13</td></tr><tr><td>Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS)</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>מסובב צינור</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>שייקר צינור (מיקסר Eppendorf Thermomixer R, 2.0 מ"ל)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד (2510)</td><td>ברנסון</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

ננו-חומרים מגנטיים זכו לתשומת לב רבה ביישומים ביו-רפואיים שונים. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים אלה עם סוכני מיקוד ספציפיים היא היבט חיוני לשיפור יעילותם באבחון ובטיפולים תוך מזעור תופעות הלוואי. היתרון של ננו-חומרים מגנטיים בהשוואה לננו-חומרים שאינם מגנטיים הוא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים ללא מגע ולמרחקים גדולים. זה מאפשר להנחות או לצבור אותם, בעוד שהם יכולים גם להיות פיקוח. לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) עם תכונות ייחודיות פותחו עבור יישומים ביו-רפואיים. המומנט המגנטי הגדול של NW אלה מאפשר שליטה יעילה יותר מרחוק על תנועתם על ידי שדה מגנטי. זה נוצל בהצלחה רבה בטיפול בסרטן, אספקת תרופות, מעקב אחר תאים, התמיינות תאי גזע או הדמיית תהודה מגנטית. בנוסף, ייצור NW על ידי תצהיר אלקטרוכימי בסיוע תבנית מספק שיטה רב-תכליתית עם שליטה הדוקה על תכונות NW. במיוחד NW ברזל תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה) NW מתאימים ליישומים ביו-רפואיים, בשל המגנטיזציה הגבוהה שלהם רעילות נמוכה.
בעבודה זו, אנו מספקים שיטה לתפקוד ביולוגי של NW של תחמוצת ברזל/ברזל עם נוגדנים ספציפיים המכוונים כנגד סמן פני תא ספציפי המתבטא יתר על המידה במספר רב של תאים סרטניים. מכיוון שהשיטה מנצלת את התכונות של משטח תחמוצת הברזל, היא ישימה גם לננו-חלקיקי תחמוצת ברזל על-פאראמגנטיים. ה- NWs מצופים תחילה ב- 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) הפועל כמקשר, אליו הנוגדנים מחוברים באופן קוולנטי. ציפוי APTES והביו-פונקציונליזציה של הנוגדנים מוכחים על ידי ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) ומדידות פוטנציאליות zeta. בנוסף, האנטיגניות של הנוגדנים על NWs נבדקת באמצעות immunoprecipitation ו כתם מערבי. המיקוד הספציפי של NWs ביו-פונקציונליים והתאימות הביולוגית שלהם נחקרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי ובדיקת כדאיות התא.

חשוב לחתוך את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) כדי שיתאימו לצינור שבו משתמשים. לאחר הוספת 1 M NaOH לחתיכות אל, תגובה צריכה להתחיל מיד, אשר נצפתה על ידי יצירת בועות. אם לא מתרחשת תגובה תוך דקה אחת או אם התגובה מהירה מאוד והתמיסה הופכת עכורה לחלוטין עם ענן לבן, הסר מיד את תמיסת NaOH הישנה והחלף אותה בתמיסה חדשה. בדוק את ערך ה- pH של תמיסת NaOH. זה צריך להיות pH&gt;12. כאשר ה-NWs משתחררים מחתיכות ה-Al ב-30 הדקות הראשונות עם NaOH, ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) יצופו בתוך תמיסת NaOH. בשלב האחרון של שחרור NWs, הפתרון צריך להיות הומוגני. שום אשכול של NWs לא צריך להיות שם (איור 3B). אם NW נאספו עם מגנט במשך 3 דקות, התמיסה צריכה להיות ברורה, וגלולת NW צריכה להיות שחורה (איור 3C). אם הגלולה הייתה אפורה, השליכו את הצינורית והתחילו שוב עם דגימת Al חדשה.
במהלך תהליך השחרור, NWs מקבלים שכבת תחמוצת ברזל טבעית עם עובי סביב 5 ננומטר, אשר דומה לדיווחים קודמים11,16,20. לשכבת תחמוצת זו תרומה חשובה לתאימות ביולוגית 16, פונקציונליות16,18 ותכונות מגנטיות20 של NWs. עם זאת, שמירה על NWs בתבנית שלהם (כלומר, לא לשחרר אותם) עד הצורך תמנע מהם השפעות סביבתיות עליהם. הקוטר והאורך הממוצעים של ה-NW לאחר תהליך השחרור היו 2.5 מיקרומטר ו-41.5 ננומטר, בהתאמה. ניתן לחשב את המסה של NW יחיד כפי שמוסבר בטבלה 1 והיא אושרה על ידי ספקטרוסקופיית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). כאן, כל דיסק אלומינה הכיל סביב 0.3 מ"ג ברזל.
כדי להפחית את הצבירה של NWs לאחר שחרורם ולאפשר פונקציונליות נוספת, NWs צופו ב-APTES. ציפוי זה מספק קבוצות אמין חופשיות ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים39,45, מה שהופך אותו מתאים לציפוי NW רב מקטעים כגון NW ברזל / זהב. במהלך ציפוי ננו-חוטים, חשוב להתמקד בשני דברים. ראשית, חשב את הנפח הדרוש ממולקולות APTES62 בהתבסס על שטח הפנים והמסה של NWs. חישובים אלה הוצגו בלוח 2. שנית, שמור על ננו-חוטים בתנועה רציפה כדי למנוע הצטברות שלהם וחסימה של חלקים מסוימים של משטחי NW מציפוי APTES. לדוגמה, בפרוטוקול זה, הננו-חוטים הודגרו תחת האמבטיה העל-קולית והמסובב במהלך ציפוי APTES ותפקוד הנוגדנים, בהתאמה. כל מולקולת APTES מכילה אטום סיליקון וקבוצת אמין פונקציונלית טרמינלית21. לכן, ניתן להשתמש במפות ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) כדי לאשר את נוכחותו של ציפוי APTES על-ידי הצגת אטומי סיליקון (צבע ורוד) על פני השטח של NW (איור 4A). לעומת זאת, אטומי NW שאינם מצופים מראים אטומי ברזל בכחול קליפה (איור 4B) ואטומי תערובת ברזל/חמצן בכחול בהיר (איור 4B). מיפוי EELS המתאים של NW לא מצופה (איור 4C,4D) מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז (איור 4C) מאשר על פני השטח (איור 4D), מה שמצביע על מבנה תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה). מיפוי EELS (איור 4 C,4D) זוהה כי שכבת תחמוצת הברזל על NWs היא Fe 3 O4 יותר מאשר Fe2O3, בדומה לפרסום קודם20.
ניתן לאשר את האנטיגניות של הנוגדנים המצורפים באמצעות מבחני IP ו-WB, שבהם ניתן לצפות בפס על הדגימה החיובית אך לא על קבוצת הבקרה השלילית (איור 5). שימו לב שכדי לשמור על פס ברור, אין להשתמש בפחות מ-0.1 מ"ג NWs/10 x 106 תאים. בדיקת BCA (טבלה של חומרים) בשילוב עם כמה חישובים המוצגים בטבלה 3 שימשה לכימות מספר הנוגדנים על NW.
יתר על כן, מדידת פוטנציאל הזטה שימשה להבהרת פונקציונליות פני השטח. קבוצת האמינים הסופיים ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי של NW ללא ציפוי, כפי שניתן לראות באיור 6. NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים גם שינו את המטען בהשוואה ל-NW מצופה APTES (איור 6). כל מדידות פוטנציאל הזטה נעשו ב-pH 7.
ניתן לאשר את מיקוד התאים הספציפיים של NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 7). יש לבדוק את התאימות הביולוגית של כל ננו-חומר חדש לפני תחילת כל יישום. לכן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא, והיא אישרה שה-NW הלא-מצופה, המצופה APTES והנוגדנים היו תואמים ביולוגית אפילו עם ריכוז גבוה (איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> איור 1: סכמטי מייצג את שיטת הציפוי והביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים. (A) ציפוי ברזל NW עם APTES. (B) הפעלת הנוגדנים באמצעות EDC + Sulfo-NHS, כדי שיהיה בסוף (C) ננו-חוט פונקציונלי של נוגדן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> איור 2: דיסק אלומיניום שהושקע בברזל. (א) דיסק האלומיניום לפני החיתוך. (B) הקווים האדומים הראו היכן לחתוך את הדיסק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> איור 3: שלבי שחרור ננו-חוטים. (A) אשכולות של ננו-חוטים צפים בתמיסת NaOH. התמונה צולמה 10 דקות לאחר הוספת NaOH ולאחר הסרת קרום Al . (B) ננו-חוטים המרחפים באתנול. התמונה צולמה בשלב השחרור האחרון, מיד לאחר שלב הסוניקציה. (C) גלולת ננו-חוט שחורה שנאספה על ידי מגנט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> איור 4: מפת ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה של אלקטרונים (EELS). (A) ננו-חוט מצופה APTES (APTES-NW). הצבעים הכחול והוורוד מייצגים אטומי ברזל וסיליקון, בהתאמה. (B) ננו-חוט לא מצופה (NW). צבעי הכחול והתכלת מייצגים את מיפוי תערובת הברזל והברזל/חמצן, בהתאמה. מיפוי EELS המתאים של (C) הליבה ו-(D) המעטפת של NW שאינם מצופים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> איור 5: אישור תפקוד ופעילות של ננו-חוטים מצומדים של נוגדנים. האנטיגניות של CD44-NWs אושרה באמצעות משקעים חיסוניים (IP) וכתם מערבי (WB). +Ve: מייצג את הבקרה החיובית (ליזט תא מלא). -Ve: מייצג את הבקרה השלילית (רק NW לא מצופה). - תאי CD44: מייצג תאים שאינם מבטאים אנטיגן CD44; + תאי CD44: מייצג תאי סרטן המעי הגס המבטאים אנטיגן CD44. זהו כתם מייצג של n = 3 ניסויים עצמאיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> איור 6: ערכים פוטנציאליים של Zeta עבור NWs, APTES-NW ונוגדנים. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> איור 7: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מראות את המיקוד הספציפי. CD44-NWs מוצגים מתחברים (A ו- C), בעוד שה- Isotype-NWs (בקרה שלילית) לא התחברו (B ו - D). הצבעים אדום, כחול וירוק מייצגים את קרום התא, הגרעין וצביר CD44-NWs, בהתאמה. A ו- B הן תמונות השדה הבהירות של C ו- D, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> איור 8: מחקר כדאיות התא של תאי סרטן המעי הגס (HCT116) מודגרים עם פורמולציות שונות של ננו-חוטים. התאים טופלו ב-NWs לאחר 24 שעות של דגירה ולאחר מכן הודגרו במשך 24 שעות עם NWs. כל הניסויים בוצעו בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>אורך Fe NW (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>רדיוס (קוטר/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td>צפיפות Fe (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>גר'/ס"מ3</td>
		</tr><tr><td>1 נפח Fe NW (V) = π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>ס"מ 3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW מסה = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>מיקרוגרם</td>
		</tr><tr><td>1 שטח פנים Fe NW = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>מיקרומטר2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: חישוב מסת הברזל NW.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פרמטר</td>
			<td>ערך</td>
			<td>יחידה</td>
		</tr><tr><td>צפיפות APTES/100 μL*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>מולקולר ווייט (MW) של APTES</td>
			<td>2.21E+02</td>
			<td>גר'/מול</td>
		</tr><tr><td>מספר שומה APTES = מסה / MW</td>
			<td>4.29ה-03</td>
			<td>מול</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>מולקולות</td>
		</tr><tr><td>גודל APTES ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>ננומטר</td>
		</tr><tr><td>שטח הפנים של APTES</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים NW ****</td>
			<td>2.76E+05</td>
			<td>נ.מ.מ 2</td>
		</tr><tr><td>מספר NWs ב 0.3mg של NW ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>NWs</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות ליצירת שכבה אחת סביב NW</td>
			<td>1.38E+06</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולות APTES הדרושות עבור 0.3 מ"ג של NWs</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>מולקולת APTES</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*שבירה מספר 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** מספר מולקולות = מספר מול*אבוגדרו (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">שבירה מספר 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מטבלה 1</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: חישוב מספר מולקולות APTES הדרושות לציפוי NWs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>נוגדן IgG בצורת Y</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>מסה לנוגדן אחד</td>
			<td>2.3E-13 מיקרוגרם</td>
			<td>1.8E-08 מיקרוגרם*</td>
		</tr><tr><td>שטח פנים לנוגדן אחד</td>
			<td>23 נאנומטר2</td>
			<td>2.6E+05 נאנומטר2</td>
		</tr><tr><td>מבוסס על בדיקת BCA</td>
			<td colspan="2">0.3 מ"ג ל-1 מ"ג</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת הנוגדן ו- NW ב- 0.3 מ"ג נוגדנים למ"ג NW</td>
			<td colspan="2">~1E + 15 נוגדנים ** לכל ~ 5.6E + 10 NW</td>
		</tr><tr><td>מספר מולקולת נוגדנים לכל NW</td>
			<td colspan="2">~2E+04 נוגדנים לכל 1 NW***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*מחושב מטבלה 1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**מספר הנוגדנים ב-0.3 מ"ג חושב על ידי חלוקת מספר הנוגדנים שקיבלנו מבדיקת BSA (0.3 מ"ג) במשקל המולקולרי הממוצע של נוגדני IgG בצורת Y (180 kDa = 3E-16 מ"ג).</td>
		</tr><tr><td colspan="3">בהתבסס על שטח הפנים של מולקולה אחת של נוגדני IgG בצורת Y (~23 nm2) ושטח הפנים של NW אחד (~2.6E+05 nm2), סביב 1E+04 נוגדנים יספיקו כדי ליצור שכבה אחת על NW. במקרה שלנו, צפיפות הנוגדנים הייתה גבוהה פי שניים מהכמות הצפויה. זה יכול להיות קשור לציפוי APTES המספק יותר זרועות המאפשר חיבור גבוה של הנוגדנים. מקרה זה מבטיח כי NW מכוסה במלואו עם נוגדנים ואת ההזדמנות עבור הנוגדן להיקשר אנטיגן פני התא, ללא קשר לכיוון של NWs יהיה גבוה. עם זאת, אם צפיפות הנוגדנים נמוכה מהמספר הצפוי (מולקולת נוגדנים 1E+04), סיכויי הקישור בין התא לבין NWs יהיו נמוכים יותר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: חישוב מספר הנוגדנים על ננו-חוט.

בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

המאפיין העיקרי של פרוטוקול זה, ניתן ליישם אותו על מגוון רחב של ננו-חומר תחמוצת ברזל-ברזל. כמו כן, ניתן ליישם אותו על ננו-חומר מרובה מקטעים, כגון ננו-חוטי ברזל-זהב. פרוטוקול זה יכול להתבצע בבטחה בכל מעבדה ביולוגית סטנדרטית.היתרונות העיקריים של טכניקת ביו-פונקציונליזציה זו הם היכולת לייצר ננו-חומר ממוקד ספציפי המבוסס על קשר קוולנטי חזק בין הננו-חוט לנוגדנים. התחל בחיתוך דיסקיות האלומיניום לחתיכות קטנות בעזרת להב קצה אחד ופטיש קטן. מניחים את החלקים החתוכים לתוך צינור של שני מיליליטר וממלאים אותו במיליליטר אחד של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד, ומוודאים שכל חלקי האלומיניום מכוסים.השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר במכסה אדים כימי למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הסר את חתיכות האלומיניום בעזרת פינצטה ושמור את הננו-חוטים המשוחררים בנתרן הידרוקסיד למשך 30 דקות נוספות. הנח את הצינור במתלה יבש מגנטי, המתן שתי דקות והחלף את התמיסה בנתרן הידרוקסיד טרי.סוניק את הצינור של שני מיליליטר עם הננו-חוטים למשך 30 שניות והשאיר אותו למשך שעה בתוך מכסה אדים כימי. חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים. בסיום, הנח את הצינור של שני מיליליטר במדף המגנטי, השליך את הנתרן הידרוקסיד והחלף אותו במיליליטר אחד של אתנול מוחלט.סוניקציה של הננו-חוטים למשך 30 שניות, הנח את הצינור במדף המגנטי והחלף את האתנול. חזור על שטיפת האתנול לפחות ארבע פעמים. לאחר שטיפת הננו-חוטים, העבירו אותם לצינור זכוכית של חמישה מיליליטר עם פיפטה של מיליליטר.הוסף 100 מיקרוליטר של APTES לתמיסת הננו-חוטים וסובב את צינור הזכוכית למשך 20 שניות. הניחו את הצינור באמבט אולטראסוני והפכו אותו לסוניקציה למשך שעה. לאחר מכן הוציאו את הצינור מהאמבטיה והוסיפו 400 מיקרוליטר מים נטולי יונים ו -20 מיקרוליטר נתרן הידרוקסיד מולארי אחד.חזור על הסוניקציה של שעה. לאחר הוצאת צינור הזכוכית מהאמבטיה האולטרה-סונית, הנח אותו ליד מגנט כדי לאסוף את הננו-חוטים. החלף את הסופרנטנט במיליליטר אחד של אתנול מוחלט טרי וסוניקציה של הצינור למשך 10 שניות.חזור על שטיפת האתנול והסוניקציה פעמיים. ממיסים 0.4 מיליגרם של EDC ו-1.1 מיליגרם של Sulfo-NHS ומיליליטר אחד של MES בשפופרת של שני מיליליטר. בצינור נוסף של שני מיליליטר, הוסף 960 מיקרוליטר של PBS 0.1 מולארי והוסף לו 30 מיקרוליטר נוגדן נגד CD44.לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת ה-EDC/Sulfo-NHS שהוכנה בעבר לצינור זה. מניחים את צינור הנוגדן בשייקר ומנערים אותו בחום של 10 פעמים G למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הניחו מגנט ליד הצינור עם הננו-חוטים המצופים ב-APTES למשך שתי דקות, השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-PBS.סוניקציה של הננו-חוטים למשך 10 שניות. לאחר הכביסה האחרונה עם PBS, אספו את הננו-חוטים והעבירו את תמיסת הנוגדנים המופעלת לצינור הננו-חוטים. ואז סוניקציה למשך 10 שניות.החזר את הצינור למסובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, אספו את הננו-חוטים עם המגנט והשליכו את הסופרנטנט. הוסיפו מיליליטר אחד של 2% BSA ודגרו על הצינור למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום את התגובה.ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה של אובדן אנרגיה אלקטרונית או במפות EELS כדי להמחיש את אטומי הסיליקון על פני הננו-חוטים ולאשר את נוכחותו של ציפוי APTES. על הננו-חוטים הלא מצופים, אטומי הברזל נראים כחולים כהים והאטומים המעורבים של ברזל וחמצן הם כחולים בהירים. מיפוי ה-EELS המקביל של ננו-חוטים לא מצופים מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז מאשר על פני השטח, מה שמעיד על מבנה תחמוצת ברזל-ברזל.המיפוי הראה כי שכבת תחמוצת הברזל מורכבת מיותר תחמוצת ברזל (II, III) מאשר תחמוצת ברזל (III). האנטיגניות של הנוגדנים המחוברים אושרה באמצעות מבחני המשקעים החיסוניים והכתם המערבי. בדיקת ה-BCA שימשה לכימות מספר הנוגדנים על הננו-חוטים.מדידת פוטנציאל זטה שימשה להבהרת פונקציונליזציה של פני השטח. קבוצת האמין הטרמינלי ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי בהשוואה לננו-חוטים לא מצופים. פונקציונליזציה של נוגדנים הפחיתה עוד יותר את המטען.מיקוד התאים הספציפי של הננו-חוטים המתפקדים על ידי נוגדנים אושר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. איורים A ו-B מייצגים את תמונות מיקרוסקופ השדה הבהיר של דגימה C ו-D בהתאמה. הצבע האדום מתאים לתיאור קרום התא, כחול מייצג את הגרעין, והצבירים הירוקים מתארים נוכחות של ננו-חוטי CD44 מחוברים וממוקדים.יתר על כן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא כדי לוודא שהננו-חוטים הלא מצופים, מצופים APTES ומצופים נוגדנים תואמים ביולוגית. בציפוי תהליך APTES, חשוב מאוד להוסיף את המים נטולי היונים לפני תמיסת הנתרן הידרוקסיד כדי לשפר את הקשר בין מולקולת APTES לננו-חוטים. כמו כן, במהלך תהליך הפונקציונליזציה הביולוגית, יש צורך לשטוף את הננו-חוט עם מאגר PBS כמה פעמים כדי לשפר את הקשר הקוולנטי בין הנוגדן לננו-חוטים.

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של חלקיקי מגנטים plasmonic עם מומנט מגנטי חזק וספיג חזק קרוב אינפרא אדום (NIR). הפרוטוקול כולל גם נטיית נוגדן לחלקיקים דרך מחצית Fc עבור יישומים ביו שונים הדורשים מיקוד ספציפי מולקולרי.

Nanoclusters סינתזה של Immunotargeted מגנטתי plasmonic

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים ביו-פונקציונליים ואת השימוש בהם כסוכני הדמיה מולקולרית רב-מודאליים. לננו-חלקיקים יש עיצוב מעטפת ליבה שבו יוני גדוליניום או מנגן בתוך ליבת הננו-חלקיקים יוצרים ניגודיות MRI. המעטפת הביו-פונקציונלית מכילה פלואורופורים להדמיה פלואורסצנטית וליגנדים ממוקדים למיקוד מולקולרי.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת ננו-צלולוז חיידקי (BNC) מגנטי ליישומים בשחזור כלי דם פגומים. ה-BNC סונתז על ידי זן G. xylinus. מצד שני, מגנטיזציה של ה-BNC התממשה באמצעות משקעים באתרם של יוני ברזל Fe2+ ו-Fe3+ בתוך רשת BNC.

המצאה של ננוצלולוז בקטריאלי המגנטי פונקציונלי עם חלקיקים של תחמוצת ברזל

אספקת תאים ממוקדת שימושית במגוון יישומים ביו-רפואיים.  מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (SPION) כדי לתייג תאים ובכך לאפשר גישות מיקוד לתאים מגנטיים לרמה גבוהה של שליטה על העברת התאים ולוקליזציה.

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

מוצג פרוטוקול לסינתזה וקטיונים של מגנטופריטין מסומם בקובלט, כמו גם שיטה למגנט במהירות תאי גזע עם מגנטופריטין קטיוני.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

עבודה זו מתארת פרוטוקולים להכנת חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO2, ואחריו פונקציונליזציה האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקוניוגציה שלה עם דפרוקסמין באמצעות moiety מקשר. תיאור מבני עמוק באפיון וחיידק לכידת שיטת Y. enterocolitica עבור כל חלקיקי ביניים המשלים הסופי מתוארים גם בפרוטרוט.

סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים

חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים באמצעות הליך ג'ל סול לא רקיקי ומצוידים במולקולות קצרות אניוניות או פולימר. השימוש מגנטומטריה לניטור התאגדות ו biotransformations של חלקיקים מגנטיים בתוך תאי גזע אנושיים מודגם באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM).

שימוש במגנטומטריה לניטור התאגדות תאית והתפרקות ביולוגית של חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתטיים כימית

עבודה זו מציגה גישה מלמטה למעלה להנדסה של כוחות מגנטיים מקומיים לשליטה בארגון העצבי. תאים דמויי נוירון עמוסים ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) מצופים על גבי ונשלטים על ידי פלטפורמה מיקרו בדוגמת עם מגנטיזציה בניצב. כמו כן מתוארים אפיון מגנטי, ספיגה תאית MNP, כדאיות התא, וניתוח סטטיסטי.

ייצור פלטפורמות מגנטיות עבור ארגון בקנה מידה מיקרון של נוירונים מחוברים

אנו מדווחים על סינתזה הידרותרמית של סיר אחד של אשכולות פריט מנגן (MFCs) המציע שליטה עצמאית על ממד החומר והרכב. הפרדה מגנטית מאפשרת טיהור מהיר בעוד פונקציונליזציה פני השטח באמצעות פולימרים גופרתיים מבטיח החומרים אינם צבירה במדיום רלוונטי ביולוגית. המוצרים המתקבלים ממוקמים היטב עבור יישומים ביו-רפואיים.

מתלים מימיים יציבים של אשכולות פריט מנגן עם ממד ננומטרי טונה והרכב

למדו פרוטוקול לביופונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות ננו-חוטי ברזל ואנטיגנים לטירגוט ספציפי של תאי סרטן. השיטה מאפשרת מסירה ממוקדת של תרופות בטיפולים אונקולוגיים עתידיים.

ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים מגנטיים

גלה סרטונים נוספים