Name: גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: למד גישה גנטית חיה-תא לזיהוי ולבידוד מוטנטים התפתחותיים ב-Chlamydia trachomatis באמצעות דיווחי פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה חיה. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר מחזור התפתחות החיידק וזיהוי גנים מכוונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר אנדרס אומסלנד מאוניברסיטת וושינגטון על שסיפק את התקשורת הגרזן CIP-1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AI130072, R21AI135691 ו- R21AI113617. תמיכה נוספת סופקה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת איידהו והמרכז לאינטראקציות מורכבות מידול באמצעות מענק NIH שלהם P20GM104420.

<ol><li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chlamydial+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li>
<li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li>
<li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CF%8328+RNA+polymerase+regulates+hctB%2C+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li>
<li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li>
<li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).</li>
<li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).</li>
<li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li>
<li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817(2016).</li>
<li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
<li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li>
<li>Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdelstein%2C+A+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14-20 (2010).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Collaborative+data+science%22">Collaborative data science</a>. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li>
<li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li>
<li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

ניתוח המנגנונים לשלוט מחזור התפתחותי כלמידיאלי כבר התעכב על ידי המגבלות של הכלים הגנטיים הזמינים כיום. העסקת היזם שלנו-כתב כלמידיה בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי תא חי, מערכת נבנתה המאפשר ניטור של פיתוח סוג תא בהכללות בודדות על פני תקופה של 24 שעות. מערכת זו, בשילוב עם mutagenesis כימי ובידוד הכללה ישירה הקימה שיטה כדי לבחור במהירות וclonally כלמידיה המביעה פרופילים התפתחותיים שונה(איור 5).
EBs כלמידיאלי פעילים באופן מטבולית מחוץ למארח כאשר מסופקים ...

כלמידיה trachomatis (Ctr) הוא פתוגן תאי חובה המתקדם דרך מחזור התפתחותי דו-פאזי חיוני להישרדותווהתפשטותו 1. מחזור זה מורכב משתי צורות התפתחותיות, הגוף היסודי (EB) והגוף reticulate (RB). EB הוא שכפול לא יושר אבל מתווכת פלישה לתא באמצעות אפקט המושרה אנדוציטוזיס2. פעם אחת במארח, EB מתבגר RB משוכפל. RB מבצע סיבובים מרובים של שכפול לפני המרה בחזרה EB על מנת ליזום סיבובים הבאים של זיהום.
המערך המוגבל של כלים גנטיים הגביל את רוב המחקר הכלמידלי למחקרים ביוכימיים או לשימוש במערכות חלופיות. כתוצאה מכך, ההבררה של ויסות גנים ושליטה במחזור ההתפתחותי היהקשה 3,4. אחד האתגרים החשובים יותר בתחום הכלמידיאלי הוא מעקב זמני ברזולוציה גבוהה של מחזור התפתחותי כלמידיאלי וזיהוי החלבונים המעורבים בוויסותו. ביטוי גנים במהלך מחזור התפתחותי כלמידי בוצע באופן מסורתי על ידי הרסני "נקודת קצה" שיטות כולל RNAseq, qPCR, מיקרוסקופית תאקבוע 5,6. למרות ששיטות אלה סיפקו מידע רב ערך, הטכניקות המועסקות הן מייגעות ויש להןרזולוציה זמנית נמוכה 5,6.
בעשור האחרון, מניפולציה גנטית של Ctr התקדמה עם המבוא של טרנספורמציה פלסמיד ושיטות mutagenesis7,,8,9. עבור מחקר זה, מערכת מבוססת פלסמיד פותחה כדי לפקח על התפתחות כלמידיאל בהכללות בודדות בזמן אמת במהלך זיהום. נוצר טרנספורמטציה כלמידית שהביעה הן RB והן EB סוג ספציפי יחצ"ן ספציפי-כתב. הכתב הספציפי RB נבנה על ידי היתוך היזם של הגן RB מוקדם euo במעלה הזרם של קלובר חלבון פלורסנט. EUO הוא רגולטור שעתוק המדכא תת קבוצה של גנים הקשורים EB מאוחר10. היזם של hctB, אשר מקודד חלבון דמוי היסטון מעורב עיסוק גרעין EB, שוכפל ישירות במעלה הזרם של mKate2 (RFP) כדי ליצור את הכתב הספציפי EB11. עמוד השדרה של hctBנשף-mKate2 /euoהנשף-תלתן היה p2TK2SW27. מקדמי HCTB ו-euo הוגדלו מהדנ"א הגנומי CTR-L2. כל רצף מקדם כלל ~ 100 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר ההתחלה שעתוק חזוי עבור הגן הכלמידיאלי שצוין בתוספת 30 נוקלאוטיד הראשון (10 חומצות אמינו) של ORF בהתאמה. גרסאות FP פלורסנט הושגו באופן מסחרי כמו Ctr קודון אופטימיזציה בלוקים גנים משוכפלים במסגרת עם 30 נוקלאוטיד הראשון של כל גן כלמידיאלי יחצ"ן. המחסל של ה-INCD שוכפל ישירות במורד הזרם של mKate2. האמרגן-כתב השני הוכנס במורד הזרם של המחסל של ה-INCD. גן התנגדות אאמפיצילין(bla)ב p2TK2SW2 הוחלף בגן aadA (התנגדות ספקטינומיצין) מ pBam4. התוצאה הייתה המבנה הסופי p2TK2-hctBנשף-mKate2/euoנשף-תלתן (איור 1A) שהפך Ctr-L27. זן זה RB / EB כתב מותר להתבוננות של מחזור התפתחותי בתוך הכללות יחיד באמצעות מיקרוסקופי תא חי(איור 1B,C).
העסקת היזם-כתב שלנו מבנה בשילוב עם mutagenesis כימי, פרוטוקול הומצא כדי לעקוב ולבודד שיבוטים בודדים שהפגינו חריגות התפתחותיות מאוכלוסיות mutagenized של Ctr serovar L2. פרוטוקול זה מאפשר ניטור ישיר של הכללות כלמידיות בודדות, מעקב אחר פרופילי ביטוי גנים לאורך זמן, זיהוי שיבוטים כלמידיים המבטאים דפוס ביטוי גנים התפתחותי שונה, ובידוד מוחלט של כלמידיה מהכללות בודדות.
למרות פרוטוקול זה נוצר במיוחד לזיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות כלמידית, זה יכול להיות מותאם בקלות לחקור כל מספר של מסלולים גנטיים כלמידיים.

<table><tbody><tr><td>לוחות פוליסטירן 24 בארות</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>גידול תרבית תאים להדבקה חוזרת של מבודדים</td></tr><tr><td>לוחות תחתונים מזכוכית 6 בארות</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>גידול תרבית תאים להדמיה</td></tr><tr><td>צלחות תחתונות זכוכית 96 בארות</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>גידול תרבית תאים להדמיה</td></tr><tr><td>יחידת CO2 קו מודגש</td><td>OKO Labs</td><td>יחידת CO2 שלב BL</td><td>בקרת CO2</td></tr><tr><td>קו מודגש T Unit</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>בקרת טמפרטורה של חממת במה צינורות</td></tr><tr><td>נימיים מזכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>צינורות נימיים</td></tr><tr><td>מסנן פליטת פס פס BrightLine (514/30 ננומטר)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>קוביית מסנן פלואוסנט</td></tr><tr><td>מסנן פליטת פס פס BrightLine (641/75 ננומטר)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/ 75-25</td><td>קוביית מסנן פלואוסנט</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>מיקרו-מזרק</td></tr><tr><td>כלמידיה טרכמטיס סרובר L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>כלמידיה טרכומטיס</td></tr><tr><td>CIP-1 מדיה</td><td>בבית</td><td>NA</td><td>Axenic. IPB בתוספת 1% FBS, 25 ו-mu; חומצות אמינו M, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT ו-50 &mu; M GTP, UTP, ו CTP. (Omsland, A. 2012) תוצרת החברה.</td></tr><tr><td>תאי Cos-7 (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>תא כליה של קוף ירוק אפריקאי (תאי מארח)</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MP Biomedicals</td><td>194527</td><td>מעכב צמיחת תאי מארח</td></tr><tr><td>אתיל מתאן סולפונט, 99%</td> <td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>Mutagen</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>תוסף למדיית גידול בסיס</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>תוכנה לניתוח תמונות מקורות פתוחים. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>חממת CO2 גלקסי 170</td><td>S Eppendorf</td><td>CO1700100X</td> בלוקים <td>של דגירה של תרבית תאים</td></tr><tr><td>(גרסאות FP פלואורסצנטיות: Clover ו-mKate2)</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>NA</td><td>gblock ORFs של גרסאות FP מותאמות ל-Ctr לשיבוט לתוך p2TK2SW2</td></tr><tr><td>Gentamycin 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>אנטיביוטיקה למצע גידול</td></tr><tr><td>HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק)</td><td>קורנינג</td><td>21-020-CM</td><td>תאי מארח שוטפים</td></tr><tr><td>את הפרין נתרן</td><td>אמרשם מדעי החיים</td><td>16920</td><td>מעכב והופך את האינטראקציות האלקטרוסטטיות המוקדמות בין התא המארח ל-EBs</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>מאגר pH למצע גדילה</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>הדמיה של עקבות הכללה. https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td>LB10-3</td><td>שולט גלגל מסנן</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>ממשק מגע Oko Touch</td><td>לשליטה בקו המודגש T ויחידת CO2</td></tr><tr><td>שלב XY קודם</td><td>קודם</td><td>H107</td><td>ממונע שלב מיקרוסקופ XY פריזמה</td></tr> R <tr><td>צנטריפוגה</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>מיקרוצנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה</td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה Problot</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>חממת נדנדה לזיהום בכלמידיה</td></tr><tr><td>Proscan II</td><td>קודם</td><td>H30V4</td><td>XYZ בקרת שלב מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מטהר Class 2 ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>עבודת תרבית תאים</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (ללא פנול אדום)</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>מדיית גידול בסיס להדמיה</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (פנול אדום)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td> היקף <td>מדיית גידול</td></tr><tr><td>בסיסנוריות עירור LED (470nm, 595nm)</td><td>scopeLED</td><td>F140</td><td>אור עירור</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator דגם 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>סוניקטור, השעיית גלולה כלמידית</td></tr><tr><td>חממת שלב</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>אשכול תא דגירה של צלחת</td></tr> באר <tr><td>מאגר סוכרוז-פוספט-גלוטמט 1X (SPG)</td> <td>בבית</td><td>NA</td><td>מאגר אחסון כלמידיה. (10 מ"מ נתרן פוספט [8 מ"מ K 2HPO 4, 2 מ"מ KH 2PO 4], 220 מ"מ סוכרוז, 0.50 מ"מ חומצה L-גלוטמית; pH 7.4)</td></tr><tr><td>T-75 צלוחיות</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>גידול תרבית תאים</td></tr><tr><td>TE 300 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td></td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>אור לבן</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>מסיר תאים מארחים מבקבוק לזריעה לצלחות</td></tr><tr>מצלמת הדמיה<td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td></td></tr><tr><td>ומיקרו; מנהל 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>חבילת תוכנה לבקרת מיקרוסקופ אוטומטי מקור פתוח</td></tr></tbody></table>

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

הפתוגן התוך תאי כלמידיה trachomatis עובר מחזור התפתחותי המורכב משתי צורות התפתחותיות מורפולוגית דיסקרטית. הגוף היסודי שאינו משוכפל (EB) יוזם זיהום של המחשב המארח. ברגע שנכנס, EB מבדיל לתוך הגוף reticulate (RB). לאחר מכן RB עובר סיבובים מרובים של שכפול, לפני ההבדיל בחזרה לטופס EB מדבק. מחזור זה חיוני להישרדות כלמידית ככישלון לעבור בין סוגי תאים מונע פלישה מארחת או שכפול.
מגבלות בטכניקות גנטיות בשל האופי התוך תאי המחייב של כלמידיה יש לעכב את הזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח סוג התא. עיצבנו מערכת פלסמיד מקדם-כתב-יזם-חדשני, שבילוב עם מיקרוסקופית תאים חיים, מאפשרת הדמיה של החלפת סוג תא בזמן אמת. כדי לזהות גנים המעורבים ברגולציה של פיתוח סוג תא, מערכת יחצ"ן-כתב תא חי היה ממונף לפיתוח גישה גנטית קדימה על ידי שילוב mutagenesis כימי של זן הכתב הכפול, הדמיה ומעקב של כלמידיה עם קינטיקה התפתחותית שונה, ואחריו בידוד clonal של מוטציות. זרימת עבודה גנטית זו קדימה היא כלי גמיש שניתן לשנות לחקירה מכוונת למגוון רחב של מסלולים גנטיים.

מוטגנזה EMS ישיר של זן כלמידיאל היזם-כתב שלנו הביא לירידה של ~75% בהדבקה. באמצעות פרוטוקול הדמיה תא חי המתואר, כ-600 הכללות נותינו ואותרו במשך תקופה של 24 שעות. הביטוי הפלורסנט קינטיקה של שני הכתבים בכל הכללה היה חזותי באמצעות סקריפטים ניידים פיתון מותאם אישית. שתי גישות הדמיה יושמו כדי לזהות מועמד mutagenized כלמידיה לבידוד. המתודולוגיה הראשונה (שלב 3.3.8) מדמיינת את הזמן לביטוי חצי-מקסימלי של מקדמי euo ו-HCTB מבודדים כלמידיים בודדים בחלקת פיזוראינטראקטיבית (איור 2).</stro...

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

פרוטוקול זה מספק כלי ייחודי לדור ולבידוד של כלמידיה עם פרופילים התפתחותיים משתנים, ובסופו של דבר מאפשר זיהוי של הגנים המווסתים את מחזור ההתפתחות. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם היכולת לעקוב אחר התפתחות סוג תא כלמידיה בזמן אמת ואת היכולת לבודד כלמידיה, עם לשנות תוכניות התפתחותיות. כדי לשתק כתבת כלמידיה טרכומטיס, ראיתי מניית כלמידיאל המכילה בערך פי 3 מהמקום העשירי לגופים היסודיים השביעיים.המחשבה, שהשתנתה עם הפלזמה הכתבת של עניין וכדור, מצוידת בסנטרופוגיה. השתמש sonication ב 10% כוח במשך 10 שניות, כדי לנצל מחדש את הגופים היסודיים ב 100 microliters של חיץ חילוף החומרים בשוגג ולפצל את ההשעיה הגוף היסודי וכתוצאה מכך שווה, בין שני צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הוסף 50 microliters של פתרון חילוף החומרים של EMS מוכן טרי לתוך aliquots כלמידיה עבור mutagenesis ו 50 microliters של מאגר חילוף החומרים חיסון כדי aliquot כלמידיאל רק עבור מוטציה מלאי דגירה שתי הדגימות במשך 20 דקות, בטמפרטורת החדר.EMS הוא חומר מסרטן ידוע ללבוש כפפות במהלך הטיפול, ולהשרות את כל הציוד המזוהם EMS ובינוני, בנתרן הידרוקסיד טוחן אחד במשך 24 שעות לפני סילוק. כדי להקים תרבות סיטונאית, להדמיה ובידוד של קנה הנשימה הכלמידי mutigenized. זרעים שש צלחות זכוכית תחתונה היטב, עם שש פעמים 10 עד החמישי עלות שבעה תאים, בשני מיליליטר של מדיום שלם לעין וזרע צלחת פוליסטירן 24 היטב עם 10 עד החמישי לגרום שבעה תאים במיליליטר אחד של מדיום שלם לגם.כדי להדביק את תרבות התא המארח עם mutagenized מכחיש כלמידיה Trachomatis להדביק, חמש בארות של צלחת תחתית זכוכית עם בערך שש פעמים 10 לחמישי, של גופים יסודיים mutagenized. ב 1.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח לגם. ולהדביק את הטוב שנותר, עם בערך פעמיים 10 לגופים היסודיים המושתקים המדומה החמישיים ב 1.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח ל הבאר, לאחר דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם נדנדה, לשטוף את התאים הנגועים עם 37 מעלות צלזיוס HBSS בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של הפרין, ואחריו מיד על ידי שטיפת HBSS.לשטוף את התאים עם הפרין שוב, ואחריו מיד על ידי שתי שטיפות עם HBSS לבד כדי להבטיח כי כל הפרין מוסר. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס הדמיה בינונית, לכל באר. ולמלא את החללים בין באר עם 37 מעלות צלזיוס deionized מים ואז למקם את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 10 שעות.בסוף האינקובציה קבעה חממת שלב המיקרוסקופ ל-5%פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. ומ מניחים את הצלחת התחתונה של ששת הזכוכית היטב, לתוך אינקובטור הבמה. בתוכנת ההדמיה, השתמש בתוסף סינון התוכן הגבוה כדי לבחור את תבנית לוח ששת התכנים, וליצור רשימת מיקום דימות המורכבת מ- 12 שדות תצוגה לכל באר השתמש באפשרות המיקוד האוטומטי כדי להגדיר את המוקד להדמיה האוטומטית ולהגדיר את החשיפה ל- 250 אלפיות שניה בעוצמה של 4% בערוץ GFB וצפיפות של 18% בערוץ RFP.אז במחזור ההדמיה במשך 24 שעות, עם מרווחים של 30 דקות, כדי ללכוד את הקינטיקה של מחזור ההתפתחות ולהגדיר את לכידת התמונה לכלול ערימות Z מרובות עם טווח של מיקוד המסתיים משני צדי פרוסת InFocus, ולאחר מכן לבחור Z יחסי להדמיה, פרוסות מרובות בחלון הרכישה ולהשתמש באפשרות קובץ מחסנית תמונה. כדי להגדיר את התמונות שיש לשמור כקבצי מחסנית TIFF. כדי לזהות רצועות הכללה, עם פרופילי שינוי התפתחותיים, השתמש בתא הייבוא במסך EMS, במחברת Python של סימון, כדי לייבא את נתוני מסלול ההכללה מהנקודות בסטטיסטיקות הרצועה, קבצי CSV למסגרת הנתונים של Panda.השתמש בתא החישוב כדי לחשב את הזמן כדי לקבל ביטוי מרבי הן עבור הכתבים המוקדמים והן עבור הכתבים המאוחרים עבור כל רצועה ולהשתמש בחבילת ההתוויה של bokeh, בתא ההתוויה החצי-מקסימום, כדי להמחיש את הביטוי המחצית המרבי לביטוי חצי מרבי מול זה של hctB prom. השתמש בסייר מזהי המסלולים האינטראקטיביים של bokeh, כדי לזהות תכלילים מאוכלוסיית המוטנטים, שנופלים מחוץ לענן פיזור מדומה מטופל. כדי לדמיין שינויים בביטוי האמרגן קינטיקה באופן דינמי בגרף תא הדם המונפש את ההבעה של התעצמות נשף EOU נגד נשף hctB.לאחר מכן דמיינו תמונה מהגרף המונפש, בתא מאתר ההכללה. כדי לבודד את ניוטונים התפתחותיים, מן התכלילים של עניין, למקם את שדה הראייה על פני באר עם הכללה מזוהה, ולהעביר את המחט על הפרעה דיפרנציאלית שלב ניגודיות מקור אור ערוץ אור לבן, כדי לדמיין את המחט, להשתמש 595 ננומטר, ערוץ העירור, כדי לדמיין את הגופים היסודיים לחילוץ. ולהשתמש בהתאמות העדינות ובמיקרו מניפולטור, לתמרן את מחט נימי להכללה, לקרוע את ההכללה עם המחט, ולהשתמש מזרק מיקרו כדי למשוך את הגופים היסודיים לתוך קצה מחט נימי.לגרש את הגופים היסודיים שחולצו, מן המחט נימי לתוך באר אחת, של מוכן ב 24 צלחת פוליסטירן היטב, ולהשתמש מחט נימי חדש עבור החילוץ הבא. לאחר הרחבה מספקת של כל מבודד, לשבש את monolayer נגוע עם קצה micropipet מיליליטר אחד ולהעביר את פסולת התא הבינוני ושחרר כלמידיה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. גלולה כלמידיה שנקטפה על ידי צנטריפוגה, ו resuspend את גלולה ב 75 microliters של קרח קר, סוכרוז פוספט גלוטמט חיץ, ואז לפצל את ההשעיה הכללה באופן שווה, בין שלושה חדש 1.5 מיליליטר בורג כובע מיקרו צינורות צנטריפוגה, ולאחסן את הצינורות במינוס 80 לקרוא צלזיוס.כדי להקים תרבות תאים מארחת להדמיה של MUTAGEN ISED מבודד זרע צלחת תחתונה זכוכית 96 עם 1.6 פעמים 10 עד הרביעי עלות שבעה תאים, ב 100 microliters של מדיום שלם ל הבאר. לאחר שמונוליית התאים המארחים מגיעה לקונפלונציה מפשירה את שיבוטי המוטנטים שנקטפו ומניות כלמידיה פראיות על קרח ולהשתמש בעמודה אחת לכל מבודד כדי לבצע, דילול סדרתי כפול של כל מוטנט מבודד. להדביק, הטור הנותר עם כלמידיה מסוג פראי, בריבוי של זיהום של כ 0.5, ולמקם צלחת ב החממה תרבות התא במשך 10 שעות בסוף הדגירה, לבחור שלוש בארות לכל לבודד מוטציה התואמים ריבוי של זיהום של פחות מאחד, וליצור רשימת מיקום הדמיה.מורכב משני שדות מבט לכל באר. ב פיזור זה, הזמן לביטוי מרבי למחצה של מקדמי EOU ו- hctB ממבודדים כלמידיים בודדים ניתן לראות שיבוטים A3667 ו B3858 נבחר לבידוד כפי שהם יצרו זמנים קצרים יותר כדי לקבל ביטוי מקסימלי, מן מקדם EOU ו פעמים ארוכות יותר ארבעה hctB. ניתן לזהות הכללות עם קינטיקה שהשתנתה בהתבסס על ההדמיה, על ביטוי הגנים הדינמי של שני היזמים, ותמונה של הגרף המונפש, כדי לזהות את מיקום הכללות העניין.בפריטים חזותיים מייצגים אלה, זוהו בסך הכל 24 תכלילים לבידוד, 10 מהם הציגו קינטיקה דיפרנציאלית, לאחר בדיקה חוזרת בשלוש קטגוריות פנוטיפיות שונות, שמונה מבודדים הציגו ירידה בביטוי מקדם EOU בסביבות 24 שעות לאחר ההדבקה. כפי שהודגם על ידי שיבוט A3667, B3858 לבודד, גם הפגין ביטוי מקדם EOU ירד, על 24 שעות לאחר ההדבקה. אבל עלייה כוללת בביטוי מקדם hctB, ואילו B3662 לבודד, הביע רמות גבוהות של florescence מקדם EOU ואחריו אובדן פתאומי של ביטוי בשני היזמים.ניתוח של מיקרוגרפים תאים חיים עבור מוטציה B3662, מגלה כי תזה תא מארח התרחשה, בתאים נגועים מוטציה זו, הרבה יותר מוקדם מאשר בתאים נגועים סוג הבר. פיתוח סוג תא חסר התאוששות כלמידיה, לא יכול להיות אפשרי, כמו תאים אלה לא יכולים להדביק מחדש את המחשב המארח. ניתן להשתמש במחקרי אסוציאציה רחבים של הגנום לאחר הבידוד, כדי לזהות גנים התפתחותיים, באמצעות מתאם סטטיסטי, עם שילוב של כתבי מקדמים חלופיים.שיטה זו יכולה להיות מורחבת, כדי בדיקה של מסלולים גנטיים רבים, לתוך הניתוח של מנגנוני מעגל גנטי, פתוגנים תאיים אחרים.

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה לביצוע ניתוח גנטי בכלמידיה מבוסס על mutagenesis הכימי וכל רצף הגנום. בנוסף, מערכת להמרת ה-DNA בתאים נגועים מתוארת שיכול לשמש למיפוי גנטי. שיטה זו יכולה להיות ישימה באופן נרחב למערכות חיידקים חסרות מערכות טרנספורמציה וכלים גנטיים מולקולריים.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

התנגדות מתח היא אחד מסימני ההיכר לאריכות ימים, והוא ידוע להיות נשלטת גנטי. כאן, פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה משוחדת למסך למוטציות המעניקות התנגדות מתח בתאי גזע עובריים שבה לפתח מודלים של עכברים ללימודי אריכות ימים.

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה (ts) הן כלים רבי ערך לזיהוי וניתוח פונקציות חיוניות. כאן אנו מתארים שיטות ליצירה וסיווג של מוטציות קטלניות בתפוקה גבוהה.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

Forward genetics היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים בפתוגנים תוך-תאיים החשובים לעמידות לחסינות אוטונומית של התאים. הגישה הנוכחית משתמשת בתאי חיסון מולדים, במיוחד מקרופאגים, כדי לזהות גנים חדשים של טוקסופלזמה גונדי החשובים להתחמקות חיסונית.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

למד גישה גנטית חיה-תא לזיהוי ולבידוד מוטנטים התפתחותיים ב-Chlamydia trachomatis באמצעות דיווחי פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה חיה. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר מחזור התפתחות החיידק וזיהוי גנים מכוונים.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

גלה סרטונים נוספים