גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

פרוטוקול זה מספק כלי ייחודי לדור ולבידוד של כלמידיה עם פרופילים התפתחותיים משתנים, ובסופו של דבר מאפשר זיהוי של הגנים המווסתים את מחזור ההתפתחות. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם היכולת לעקוב אחר התפתחות סוג תא כלמידיה בזמן אמת ואת היכולת לבודד כלמידיה, עם לשנות תוכניות התפתחותיות. כדי לשתק כתבת כלמידיה טרכומטיס, ראיתי מניית כלמידיאל המכילה בערך פי 3 מהמקום העשירי לגופים היסודיים השביעיים.

המחשבה, שהשתנתה עם הפלזמה הכתבת של עניין וכדור, מצוידת בסנטרופוגיה. השתמש sonication ב 10% כוח במשך 10 שניות, כדי לנצל מחדש את הגופים היסודיים ב 100 microliters של חיץ חילוף החומרים בשוגג ולפצל את ההשעיה הגוף היסודי וכתוצאה מכך שווה, בין שני צינורות מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הוסף 50 microliters של פתרון חילוף החומרים של EMS מוכן טרי לתוך aliquots כלמידיה עבור mutagenesis ו 50 microliters של מאגר חילוף החומרים חיסון כדי aliquot כלמידיאל רק עבור מוטציה מלאי דגירה שתי הדגימות במשך 20 דקות, בטמפרטורת החדר.

EMS הוא חומר מסרטן ידוע ללבוש כפפות במהלך הטיפול, ולהשרות את כל הציוד המזוהם EMS ובינוני, בנתרן הידרוקסיד טוחן אחד במשך 24 שעות לפני סילוק. כדי להקים תרבות סיטונאית, להדמיה ובידוד של קנה הנשימה הכלמידי mutigenized. זרעים שש צלחות זכוכית תחתונה היטב, עם שש פעמים 10 עד החמישי עלות שבעה תאים, בשני מיליליטר של מדיום שלם לעין וזרע צלחת פוליסטירן 24 היטב עם 10 עד החמישי לגרום שבעה תאים במיליליטר אחד של מדיום שלם לגם.

כדי להדביק את תרבות התא המארח עם mutagenized מכחיש כלמידיה Trachomatis להדביק, חמש בארות של צלחת תחתית זכוכית עם בערך שש פעמים 10 לחמישי, של גופים יסודיים mutagenized. ב 1.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח לגם. ולהדביק את הטוב שנותר, עם בערך פעמיים 10 לגופים היסודיים המושתקים המדומה החמישיים ב 1.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח ל הבאר, לאחר דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם נדנדה, לשטוף את התאים הנגועים עם 37 מעלות צלזיוס HBSS בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של הפרין, ואחריו מיד על ידי שטיפת HBSS.

לשטוף את התאים עם הפרין שוב, ואחריו מיד על ידי שתי שטיפות עם HBSS לבד כדי להבטיח כי כל הפרין מוסר. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס הדמיה בינונית, לכל באר. ולמלא את החללים בין באר עם 37 מעלות צלזיוס deionized מים ואז למקם את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 10 שעות.

בסוף האינקובציה קבעה חממת שלב המיקרוסקופ ל-5%פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. ומ מניחים את הצלחת התחתונה של ששת הזכוכית היטב, לתוך אינקובטור הבמה. בתוכנת ההדמיה, השתמש בתוסף סינון התוכן הגבוה כדי לבחור את תבנית לוח ששת התכנים, וליצור רשימת מיקום דימות המורכבת מ- 12 שדות תצוגה לכל באר השתמש באפשרות המיקוד האוטומטי כדי להגדיר את המוקד להדמיה האוטומטית ולהגדיר את החשיפה ל- 250 אלפיות שניה בעוצמה של 4% בערוץ GFB וצפיפות של 18% בערוץ RFP.

אז במחזור ההדמיה במשך 24 שעות, עם מרווחים של 30 דקות, כדי ללכוד את הקינטיקה של מחזור ההתפתחות ולהגדיר את לכידת התמונה לכלול ערימות Z מרובות עם טווח של מיקוד המסתיים משני צדי פרוסת InFocus, ולאחר מכן לבחור Z יחסי להדמיה, פרוסות מרובות בחלון הרכישה ולהשתמש באפשרות קובץ מחסנית תמונה. כדי להגדיר את התמונות שיש לשמור כקבצי מחסנית TIFF. כדי לזהות רצועות הכללה, עם פרופילי שינוי התפתחותיים, השתמש בתא הייבוא במסך EMS, במחברת Python של סימון, כדי לייבא את נתוני מסלול ההכללה מהנקודות בסטטיסטיקות הרצועה, קבצי CSV למסגרת הנתונים של Panda.

השתמש בתא החישוב כדי לחשב את הזמן כדי לקבל ביטוי מרבי הן עבור הכתבים המוקדמים והן עבור הכתבים המאוחרים עבור כל רצועה ולהשתמש בחבילת ההתוויה של bokeh, בתא ההתוויה החצי-מקסימום, כדי להמחיש את הביטוי המחצית המרבי לביטוי חצי מרבי מול זה של hctB prom. השתמש בסייר מזהי המסלולים האינטראקטיביים של bokeh, כדי לזהות תכלילים מאוכלוסיית המוטנטים, שנופלים מחוץ לענן פיזור מדומה מטופל. כדי לדמיין שינויים בביטוי האמרגן קינטיקה באופן דינמי בגרף תא הדם המונפש את ההבעה של התעצמות נשף EOU נגד נשף hctB.

לאחר מכן דמיינו תמונה מהגרף המונפש, בתא מאתר ההכללה. כדי לבודד את ניוטונים התפתחותיים, מן התכלילים של עניין, למקם את שדה הראייה על פני באר עם הכללה מזוהה, ולהעביר את המחט על הפרעה דיפרנציאלית שלב ניגודיות מקור אור ערוץ אור לבן, כדי לדמיין את המחט, להשתמש 595 ננומטר, ערוץ העירור, כדי לדמיין את הגופים היסודיים לחילוץ. ולהשתמש בהתאמות העדינות ובמיקרו מניפולטור, לתמרן את מחט נימי להכללה, לקרוע את ההכללה עם המחט, ולהשתמש מזרק מיקרו כדי למשוך את הגופים היסודיים לתוך קצה מחט נימי.

לגרש את הגופים היסודיים שחולצו, מן המחט נימי לתוך באר אחת, של מוכן ב 24 צלחת פוליסטירן היטב, ולהשתמש מחט נימי חדש עבור החילוץ הבא. לאחר הרחבה מספקת של כל מבודד, לשבש את monolayer נגוע עם קצה micropipet מיליליטר אחד ולהעביר את פסולת התא הבינוני ושחרר כלמידיה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. גלולה כלמידיה שנקטפה על ידי צנטריפוגה, ו resuspend את גלולה ב 75 microliters של קרח קר, סוכרוז פוספט גלוטמט חיץ, ואז לפצל את ההשעיה הכללה באופן שווה, בין שלושה חדש 1.5 מיליליטר בורג כובע מיקרו צינורות צנטריפוגה, ולאחסן את הצינורות במינוס 80 לקרוא צלזיוס.

כדי להקים תרבות תאים מארחת להדמיה של MUTAGEN ISED מבודד זרע צלחת תחתונה זכוכית 96 עם 1.6 פעמים 10 עד הרביעי עלות שבעה תאים, ב 100 microliters של מדיום שלם ל הבאר. לאחר שמונוליית התאים המארחים מגיעה לקונפלונציה מפשירה את שיבוטי המוטנטים שנקטפו ומניות כלמידיה פראיות על קרח ולהשתמש בעמודה אחת לכל מבודד כדי לבצע, דילול סדרתי כפול של כל מוטנט מבודד. להדביק, הטור הנותר עם כלמידיה מסוג פראי, בריבוי של זיהום של כ 0.5, ולמקם צלחת ב החממה תרבות התא במשך 10 שעות בסוף הדגירה, לבחור שלוש בארות לכל לבודד מוטציה התואמים ריבוי של זיהום של פחות מאחד, וליצור רשימת מיקום הדמיה.

מורכב משני שדות מבט לכל באר. ב פיזור זה, הזמן לביטוי מרבי למחצה של מקדמי EOU ו- hctB ממבודדים כלמידיים בודדים ניתן לראות שיבוטים A3667 ו B3858 נבחר לבידוד כפי שהם יצרו זמנים קצרים יותר כדי לקבל ביטוי מקסימלי, מן מקדם EOU ו פעמים ארוכות יותר ארבעה hctB. ניתן לזהות הכללות עם קינטיקה שהשתנתה בהתבסס על ההדמיה, על ביטוי הגנים הדינמי של שני היזמים, ותמונה של הגרף המונפש, כדי לזהות את מיקום הכללות העניין.

בפריטים חזותיים מייצגים אלה, זוהו בסך הכל 24 תכלילים לבידוד, 10 מהם הציגו קינטיקה דיפרנציאלית, לאחר בדיקה חוזרת בשלוש קטגוריות פנוטיפיות שונות, שמונה מבודדים הציגו ירידה בביטוי מקדם EOU בסביבות 24 שעות לאחר ההדבקה. כפי שהודגם על ידי שיבוט A3667, B3858 לבודד, גם הפגין ביטוי מקדם EOU ירד, על 24 שעות לאחר ההדבקה. אבל עלייה כוללת בביטוי מקדם hctB, ואילו B3662 לבודד, הביע רמות גבוהות של florescence מקדם EOU ואחריו אובדן פתאומי של ביטוי בשני היזמים.

ניתוח של מיקרוגרפים תאים חיים עבור מוטציה B3662, מגלה כי תזה תא מארח התרחשה, בתאים נגועים מוטציה זו, הרבה יותר מוקדם מאשר בתאים נגועים סוג הבר. פיתוח סוג תא חסר התאוששות כלמידיה, לא יכול להיות אפשרי, כמו תאים אלה לא יכולים להדביק מחדש את המחשב המארח. ניתן להשתמש במחקרי אסוציאציה רחבים של הגנום לאחר הבידוד, כדי לזהות גנים התפתחותיים, באמצעות מתאם סטטיסטי, עם שילוב של כתבי מקדמים חלופיים.

שיטה זו יכולה להיות מורחבת, כדי בדיקה של מסלולים גנטיים רבים, לתוך הניתוח של מנגנוני מעגל גנטי, פתוגנים תאיים אחרים.