Name: מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למד שיטה לייצור מניות וירוס צהבת E (HEV) בטיטר גבוה באמצעות תרביות תאי כבד. פרוטוקול זה מאפשר הפקת חלקיקים ויראליים מעטיפים ובלתי מעטיפים לחקר תרופות וחיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה לסוזן אמרסון. על וירוס הפטיטיס p6 שיבוט מערכת החיסון העצמי הספציפית של הארנב מסופקת באדיבות ריינר אולריך, מכון פרידריך לופלר, גרמניה. כמו כן, אנו מודים לכל חברי המחלקה לוירולוגיה מולקולרית ורפואית באוניברסיטת רוהר בוכום על תמיכתם ושיוריהם. דמויות 1-7 נוצרו עם BioRender.com.

. למחברים אין מה לגלות

החל עם ההכנה הפלסטיות, התשואות DNA צריך לחרוג 150 ng/μL כדי להיות מסוגל לבצע לינריזציה מרובים מן המלאי באותו פלסטלינה, אשר ממזער את הסיכון של חיידקים המושרה מוטגנזה של רצפי הגנום המכריע. יתר על כן, חשוב לבדוק את תקציר ההגבלה עבור שורה מלאה פלריזציה על ידי ג'ל אלקטרופורזה (איור 8b). העדר דנ א לינבית הפלסטיות יגרום להגברה מעגל הגורם לתמלול באמצעות מבחנה כדי להיות פחות יעיל. בנוסף, שלמות RNA צריך להיות מאושר כדי להעריך את השפע של RNases בתוך המדגם (איור 8c). יש לשק...

צהבת E היא מחלה די מזלזל עם שכיחות גוברת ברחבי העולם. כ 20,000,000 זיהומים לגרום ליותר מ 70,000 מקרי מוות בשנה1. הסוכן הבסיסי, וירוס הפטיטיס (שלום), הוצב מחודש לאחרונה והוא מסווג כיום בתוך המשפחה Hepe, כולל הנגיף האורתופהווירוס ו piscihepevirus. האוהב של מקורות שונים מסווג בתוך מינים Orthohepevirus A-D כולל מבודד מבני אדם, חזיר, ארנבים, חולדות, ציפורים ויונקים אחרים2. בזמן הנוכחי, שמונה גנוסוגים שונים (GT) של חיובי, וירוס יחיד שנתקע RNA זוהו2. למרות שהם נבדלים בזהות הרצף שלהם, נתיבי שידור והפצה גיאוגרפית, מבנה גנומית שלהם הוא שימור מאוד. יותר ספציפי, הגנום 7.2 kbp האוהב מחולק ל 3 מסגרות קריאה הגדול פתוח (ORF1 -3). בעוד ORF1 מקודד את כל האנזימים הדרושים עבור שכפול מוצלח בתא המארח, ORF2 מקודד את חלבון הקפיסיד, והחלבון ORF3 מתפקד כערוץ יונים פונקציונלי הנדרש להרכבה ושחרור של חלקיקים זיהומיות3. שוחרר פעם לתוך הבסיס או לומן פסגה חי קיים בשני, quasienveloped ו מינים לא עטוף/עירום תלוי אם הנגיף מקורו דם או צואה, בהתאמה4,5.
בעוד GT1 ו GT2 נמצאים בעיקר במדינות מתפתחות רק מדביק את בני האדם6 דרך הדרך הצואה אוראלי, GT3, GT4 ו GT7 מתרחשים בעיקר במדינות מפותחות1,7 עם מגוון של מינים המשרתים כמו מאגרים, למשל, חזיר8, חולדה9, עוף10,11, צבי12,,22נמייה13, בת14, ארנב15,16, בר חזיר17 ועוד הרבה יותר7,18,19, מתן ראיות של zoonosis7,20,21 בנוסף לתנאים הסניטריים מספיק23 ומוצרי מזון מזוהם12,24,25,26, העברה באמצעות עירוי דם ושתילת איברים ניתן גם כן27,28. אוהב הוא גורם נפוץ של שחמת הכבד וכישלון הכבד29 במיוחד בחולים עם מחלת הכבד הקיימים מראש, אנשים בסיכון חיסוני (גנוטיפ 3, 4 ו 7) ונשים הרות (גנוטיפ 1). של הערה, יש גם ביטויים מחוץ לכבד כגון מחלה המטפאות30,31,32, הפרעות נוירולוגיות33 ופציעה הכליה34.
עד כה, התרופה מחוץ לתווית ריבוירין (rbv) היא הטיפול בבחירה עבור חולים רבים נגועים35,36. עם זאת, דווח על מקרים של כישלון הטיפול והתוצאות הרפואיות העניות לטווח הארוך דווחו. כישלון הטיפול נקשר מוטגנזה ויראלית ומוגברת טרוגניות ויראלי בחולים37נגועים באופןכרוני 37,38,39. להפך, האחרונה רטרוספקטיבי האירופי הכנס למחקר לא היה מסוגל לתאם פולימונאז מוטציות לכשל הטיפול RBV40. בתצפיות קליניות ובניסויים מחוץ למבחנה, אינטרפרון41,42,43, sofosbuvir44,45, מלחי אבץ46 ו-סילברול47,48 הראו גם אפקטים אנטי-ויראליים. למרות זאת, טיפול מסוים בנושא החיים נותר להימצא, והוא מושפע מחוסר הידע על מחזור חיי החיות והפתוגנזה שלה. לפיכך, מערכת תרבות תא חזקה למחקרים וירולוגיים ופיתוח תרופות אנטי-ויראליות חדשות, נחוצה בדחיפות49.
למרבה הצער, כמו וירוסים אחרים הפטיטיס, כלומר, קשה להפיץ בקווי התא קונבנציונאלי בדרך כלל מתקדם לאט מאוד מוביל ויראלי נמוך עומסים. אף על פי כן, קבוצות מסוימות הצליחו להגביר את העומסים ויראלי על ידי הדור של קו התא subclones50 או התאמה של תוספי מדיה51. לאחרונה הדור של cdna שיבוטים52 ו עיבוד של המטופל הראשי מבודד על ידי passaging53,54 הפצת האוהב משופרת נוסף בתרבות התא55. בפרוטוקול זה, השתמשנו הגנום של תרבות התא הותאם מאמץ Kernow-C1 (המכונה p6_WT)54 ו מוטציה זן מחסה מוטציה שיפור שכפול (המכונה p6_G1634R)37. Kernow-C1 הוא זן הנפוץ ביותר בתרבות תא מאוהב והוא מסוגל לייצר עומסים ויראלי גבוהה. על ידי הערכת ויראלי מספרים העתק RNA, שכפול האוהב יכול להיות מנוטרים בתוך מבחנה. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות הערכה של מספר החלקיקים הזיהומיות המיוצרים. לכן, יש לנו הקימה מודלובורנציה כתמים כדי לקבוע מיקוד ויוצרים יחידות (FFU/mL).
השיטה המתוארת כאן56 יכולה לשמש להפקת חלקיקים ויראליים מדבקים באורך מלא, המסוגלים להדביק מגוון סוגי תאים ממקורות שונים, כולל תאים ראשוניים וקווי תאים. זהו תנאי מוקדם בסיסי לפענח היבטים חשובים של זיהום והטרוריזם. אין צורך בחיסונים. בדרך כלל מוגבלים בחולים הייצור של חלקיקי אוהב זיהומיות מפלמידים מהווה מקור אינסופי, מה שהופך פרוטוקול זה זהובה יעיל. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש עבור הגנטיקה הפוכה המאפשרת את המחקר של שינוי הגנום מזוהה vivo ואת השפעתם על שכפול וכושר. טכניקה זו גוברת על מגבלות רבות, ויכולה לסלול את הדרך להתפתחות הסמים, ללימודי מוטגנזה ולהערכת אינטראקציות של מארחי וירוסים כגון מגבלות או מקדמי כניסה.

<table><tbody><tr><td>0.45 ומיקרו; m mesh</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td>קציר וירוס חוץ-תאי</td></tr><tr><td>4% היסטופיקס</td><td>CarlRoth</td><td>P087.4</td><td>אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>CarlRoth</td><td>6755.1</td><td>פתרון עבודה קולגן</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910024</td><td>וירוס קצירת</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>מבחר של טרנספורמציה חיידקים</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td>in vitro שעתוק ואלקטרופורציה</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Figure Generation</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Collagen R solution 0.4%</td><td>סטרילי Serva</td><td>47256.01</td><td>תמיסת עבודה קולגן</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Roche</td><td>11140922001</td><td>in vitro תמלול</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Biorad</td><td>165-2088</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>41965-039</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>in vitro תמלול</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>כלול בתעתיק P2077</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Escherichia coli JM109</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td>טרנספורמציה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>gibco</td><td>10270106</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורציה של GenePulser Xcell</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>gibco</td><td>15710049</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Roche</td><td>11140957001</td><td>in vitro שעתוק</td></tr><tr><td>H2O</td><td>בראון</td><td>184238001</td><td>אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-03</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>gibco</td><td>16050122</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.1</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Roth</td><td>6781.3</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>gibco</td><td>25030081</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5G</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>MEM</td><td>gibco</td><td>31095-029</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100&)</td><td>gibco</td><td>11140-035</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>מיקרונפח ספקטרופוטומטר UV-Vis NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ריכוז ND-ONE-W</td><td>DNA/</td></tr><tr><td>RNA אנזים MluI NEB</td><td></td><td>R0198L</td><td>ליניאריזציה</td></tr><tr><td>NEB מאגר NEB</td><td></td><td>כלול בליניאריזציה</td><td></td></tr> <tr><td>R0198Lערכת פלסמיד NucleoSpin</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740588.250</td><td>הכנת פלסמיד</td></tr><tr><td>ערכת ניקוי RNA NucleoSpin</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740948.250</td><td>טיהור RNA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>gibco</td><td>70011051</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוקוס</td><td>תרמו פישר</td><td>15140122</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פלסמיד המקודד גנום HEV באורך מלא (p6_G1634R)</td> ייצור <td>וירוס</td> <td>Todt et.al</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד המקודד גנום HEV באורך מלא (p6_WT)</td> <td>שוקלה ואחרים.</td><td>הצטרפות GenBank מס. JQ679013</td><td>ייצור וירוס</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני 1E6</td><td>LS-Bio</td><td>C67675</td><td>אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני 8282</td><td></td><td></td><td>ריינר אולריך, מכון פרידריך לופלר, גרמניה</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>מיצוי DNA</td></tr><tr><td>Ribo m7G Cap אנלוגי</td><td>Promega</td><td>P1711</td><td>in vitro</emשעתוק ></td></tr><tr><td>RNase משם</td><td>CarlRoth</td><td>A998.3</td><td>טיהור RNA</td></tr><tr><td>RNasin (מעכב RNase)</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td>in vitro שעתוק</td></tr><tr><td>נוגדן משני חמור אנטי עכבר 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>נוגדן משני עז נגד ארנב 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>נתרן פירובאט</td><td>גיבקו</td><td>11360070</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>P2077</td><td>in vitro שעתוק</td></tr><tr><td>מאגר שעתוק</td><td>Promega</td><td>כלול ב-P2077</td><td>in vitro שעתוק</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CarlRoth</td><td>3051.3</td><td>אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%)</td><td>gibco</td><td>15400054</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>IgG gibco נמוכה במיוחד</td><td></td><td>1921005PJ</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>UTP</td><td>Roche</td><td>11140949001</td><td>in vitro שעתוק</td></tr></tbody></table>

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג titer גבוהה

A Cell Culture Model for Producing High Titer Hepatitis E Virus Stocks

וירוס צהבת E הוא הגורם המוביל של שחמת הכבד ואת אי ספיקת כבד עם הגדלת שכיחות ברחבי העולם. וירוס ה-RNA היחיד המועבר ברובו על ידי עירויי דם, תנאים סניטריים מספיקים ומוצרי מזון מזוהמים. כדי לצאת התרופה מחוץ לתווית ריבוירין (rbv) היא הטיפול בבחירה עבור חולים רבים. למרות זאת, יש לזהות את הטיפול המסוים. עד כה, הידע על מחזור החיים האוהב והפתוגנזה הושפע באופן קשה בשל היעדר מערכת יעילה של התרבות התאית של הגוף. מערכת התרבות הסלולרית האיתנה חיונית לחקר מחזור החיים הנגיפי הכולל גם את הפתוגנזה הנגיפית. עם השיטה המתוארת כאן ניתן לייצר מגדל ויראלי של עד 3 x 106 מיקוד להרכיב יחידה/ml (ffu/ml) של האדם הלא עטוף ואת עד 5 x 104 ffu/ml של מעטפת. באמצעות חלקיקים אלה, ניתן להדביק מגוון של תאים של מקורות מגוונים, כולל תאים ראשוניים ואנושיים, כמו גם קווי תאים של בעלי חיים. הייצור של חלקיקי אוהב זיהומיות מפלמידים מהווה מקור אינסופי, מה שהופך את הפרוטוקול הזה ליעיל ביותר.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההפקה של חברת הייטק מדבקת. הצעד הראשון הוא לבודד את ה-DNA פלמיד (pBluescript_SK_HEVp654 ו-PBLUESCRIPT_SK_HEVP6-G1634R37, איור 8a), אשר לאחר מכן הוא לאחר לבידוד על ידי הגבלת העיכול ומטוהר עבור תמלול מתורבת (איור 1). ניתן לאמת לינלון מוצלח על ידי השוואת ה-DNA הבלתי מתעכל ל-dna של מתעכל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל. בנוסף לשינוי גודל, רק להקת DNA אחת צריכה להיות גלויה המייצגת את הצורה הליניארית....

מתוארים כאן היא שיטה יעילה כיצד לייצר מניות סיכוייו גבוהה ויראלי של וירוס הפטיטיס E (האוהב) כדי להדביק ביעילות תאים hepatoma. עם השיטה המוצגת, הן לא מעטפת, כמו גם חלקיקים ויראלי מעטוף ניתן לקצור ומשמש לצורך הצגת קווי תאים שונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

Hepatitis E virus is the leading cause of liver cirrhosis and liver failure with increasing prevalence worldwide. The single-stranded RNA virus is ...

מחקר וירוס הפטיטיס E כבר קשה על ידי היעדר מערכת תרבות תאים יעילה. הטכניקות שלנו מתגברות על מגבלות אלה וסוללות את הדרך לעיצוב תרופות ופיתוח חיסונים. עם פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לייצר וירוסים טיטר גבוה זיהומיות של חלקיקי HEV שאינם מעטפה ומעטפה, להקל על זיהום של מגוון רחב של תאים.ביצוע פרוטוקול זה דורש גישה למתקן BSA-2 וניסיון בטכניקות בסיסיות של תרבות תאים. כדי להפוך את הדנ"א הפלסמיד ליניארי, יש לערבב 10 מיקרוגרם של הדנ"א של התבנית עם 10 מיקרוליטרים של חיץ ושני מיקרוליטרים של אנזים הגבלת המיקרוקוקוס לוטוס ולהתאים את הנפח הסופי ל-100 מיקרוליטרים במים. ואז לה הדגיר את הפתרון במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולאשר ליניאריזציה של פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר בידוד DNA פלסמיד ליניאריזציה, ההצלחה של ליניאריזציה ניתן לאמת על ידי השוואת ה- DNA פלסמיד לא מתעכל ל- DNA פלסמיד מתעכל על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לקבלת תמלול במבחנה של הדנ"א המטוהר, באורך מלא של נגיף הפטיטיס E, יש לערבב שני מיקרוגרם של תבנית הדנ"א ליניארית עם חברי ההנהלה המתאימים ולהשתמש במים נטולי גרעין כדי להביא את הנפח הסופי של הפתרון ל-100 מיקרוליטרים. לאחר ערבוב יסודי, הדגירה את הפתרון במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר שעתיים, מוסיפים שני מיקרוליטרים נוספים של פולימראז T7 RNA לצינור. לאחר מכן מערבבים את התגובה ו דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים נוספות. בסוף הדגירה, לעכל את תבנית ה-DNA הראשונית עם 7.5 microliters של DNAs עם ערבוב יסודי דגירה במשך 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר החילוץ, בזהירות לבדוק את שלמות RNA ותפוקה על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקרה של RNAs נמוך abundancy, להקות נפרדות, ולא כתם מטושטש יש לצפות. חלק מהצעדים דורשים ביצוע מהיר ולכן הכנה יסודית.כמו כן, לשים לב במיוחד שלמות RNA וכדאיות התא. כדי להכין תאים סרטניים בכבד האנושי לייצור וירוס הפטיטיס E שמקורו בתרבות התאים, זרע את התאים ב 20 מיליליטר של DMEM מלא על צלחת תרבות מצופה קולגן 15 ס"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים 90% confluency. בסוף התרבות, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS לפני ניתוק אותם מצלחת תרבות התא עם שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס.תן שימוש חוזר בתאים המנותקים ב-10 מיליליטר של DMEM מלא ותעביר את התאים לצינור חרוט של 50 מיליליטר לספירה. להעביר חמש פעמים 10 לשישה תאים לצינור חדש 50 מיליליטר ולשטוף את התאים פעמיים עם 35 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את התאים על הקרח מבלי להסיר את העל-טבעי.עבור אלקטרופורציה של תאי היעד, תוספת 384 microliters של ציטומיקס עם שני ATP מילימולר וחמישה גלוטתיון מילימולרי, לאחר מכן לאחסן על קרח עד שימוש נוסף. בזהירות להחליף את supernatant עם כל 400 microliters של פתרון. הוסף חמישה מיקרוגרם של רנ"א גנומי נגיפי מטוהר לתאים והעבר את ההשעיה התאית לקובט ארבעה מילימטרים לאלקטרופורציה ב 975 מיקרופאראד ו 270 וולט עבור 20 אלפיות שנייה.לאחר אלקטרופורציה, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את התאים מהר ככל האפשר לתוך 11 מיליליטר של DMEM מלא וזרע 10 מיליליטר של התאים אלקטרופולציה לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ מצופה קולגן. לאחר מכן, להוסיף 1.3 פעמים 10 לתאים החמישיים ב 300 microliters של בינוני באופן שווה על להחליק כיסוי באר אחת של צלחת 24 microtiter מצופה קולגן ולהמקם את הצלחת ואת המנה באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את supernatant בצלחת עם 10 מיליליטר של DMEM טרי ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא במשך שישה ימים נוספים.ביום החמישי עד השביעי, בהתאם לצפיפות התא, לבצע כתמים immunofluorescent של בקרת transfection כדי לאפשר חישוב של מספר התאים המבטאים את חלבון היעד של עניין מנורמל למספר הכולל של תאים. אלקטרופוזיה מוצלחת יכולה להיות מנוטרת על ידי כתמים immunofluorescent של בקרת ההמרה. יעילות ההמרה צריכה לחרוג מ- 40%A מוטציה חסרת שכפול יכולה לשמש כפקד שלילי כדי לאשר את הספציפיות של הכתם.כדי לקצור חלקיקי וירוס הפטיטיס E חוץ-תאיים שמקורם בתרבות התאים, ביום השישי, סנן את העל-טבעי דרך רשת מיקרוליטר של 0.45 כדי להסיר פסולת תאים ולאחסן את נגיף הפטיטיס E הנקצר הנגזר מתרבות התאים החוץ-תאיים בארבע מעלות צלזיוס. עבור קציר חלקיקי נגיף הפטיטיס E שמקורו בתרבות תאית, שטפו תאים עם PBS וניתקו את התאים עם 1.5 מיליליטר של 0.05%Trypsin-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם 8.5 מיליליטר של DMEM ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה.הוסף 1.6 מיליליטר של DMEM להשלים בינוני לכל אלקטרופורציה בודדים שני צינורות תגובה מיליליטר ולהשתמש 800 microliters של המדיום כדי resuspend התאים, ובכך להעביר את התאים לצינורות. להקפיא את התאים החוצה חנקן נוזלי, ולאחר מכן להפשיר את התאים על קרח שלוש פעמים לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה lysates וכתוצאה מכך במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים גרם. ואז להעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים מבלי להפריע כדורי פסולת התא עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.כדי להעריך את titers של מלאי נגיף הפטיטיס E המיוצר לאחרונה חוץ תאית, זרע פעמיים 10 לארבעת התאים לכל 100 microliters של MEM לתוך 60 בארות מרכז של צלחת מיקרוטיטר מצופה קולגן 96 היטב ולמלא את בארות החיצוניות ביותר עם 100 microliters של PBS לבא. לאחר 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 microliters של חלקיקי וירוס חוץ תאיים על טבעי לשורה הראשונה של תאים. לאחר ערבוב יסודי, לדלל באופן סדרתי את תוכן הבאר שש פעמים בריכוז אחד עד שלושה ל הבאר על ידי העברת 50 microliters של supernatant מן השורה הקודמת לשורה הבאה של תאים כפולים עד השורה האחרונה של תאים.כדי להדביק את התאים עם חלקיקי וירוס הפטיטיס E שמקורם בתרבות תאית, להוסיף 25 microliters של חלקיקי וירוס תאיים על טבעי לשורה העליונה של תאים ומערבבים היטב לפני דילול סדרתי של התאים שש פעמים ביחס של אחד עד חמישה עם 25 microliters של דילול כפול כפי שהוכח. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שבעה ימים לפני כתמים immunofluorescent על פי הפרוטוקול בכתב היד. לאחר הדגירה וכתמים חיסוניים, ניתן לנתח את הצלחות באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence.לאחר כשל חיסוני ניתן לחשב את הטיטר הסופי של החלקיקים האינטראקטיביים והחוץ-תאיים באמצעות הנוסחה המתאימה כפי שצוין. לאחר זיהום תא היעד עם חלקיקי וירוס E שמקורם בתרבות התא על ידי דילול סדרתי, titers בין אחד פעמים 10 לחמישי ושלוש פעמים 10 כדי שש יחידות היוקד להרכיב למיליליטר ניתן לצפות מתרבות התא נגועים חלקיקי נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים בתרבות תאית. בתרבויות נגועות בחלקיקי וירוס הפטיטיס E המופקים מתרבית תאים חוץ-תאיים עטופים, צפויים טיטרים בין פעם אחת 10 לשניה ו-10 פעמים להתמקדות הרביעית ויוצרים יחידות למיליליטר.בנוסף, היחס בין עותקי גנום וחלקיקי וירוס זיהומיות תאיים שאינם עטופים הוא בדרך כלל נמוך יותר מזה שנצפה עבור תרבויות נגועות בנגיף הפטיטיס E המופק מתרבות חוץ-תאית, מה שמרמז על זיהום ספציפי גבוה יותר של מיני נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים. ייצור חלקיקים ויראלי וזיהום תאי יעד דורשים מחזור חיים ויראלי מלא, והוא יכול לספק תובנות חדשות על אינטראקציות בין מארח וירוסים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לבצע קינטיקה שכפול או לייצר חלקיקים שניתן להשתמש בהם ב- assays זיהום.רוב המחקר שלנו תלוי כיום בחלקיקים זיהומיות, הן ב- HEV האפוי והן ב- HEV שאינו עטוף. ומאמרים המשתמשים בטכניקות שלנו מתפרסמים כעת.

a-cell-culture-model-for-producing-high-titer-hepatitis-e-virus-stocks

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.

באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג&#39;ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות

שתי שיטות של גיבוש Heterokaryon לגלות גורמים הגבלת HCV

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לזיהוי זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) באמצעות מערכת דיווח HBV רקומביננטית. כאשר הגנום הנגיפי הרקומביננטי מדביק תאים מארחים, הוא מבטא את האנזים luciferase reporter, אשר מייצר ביולומינסנציה עם חמצון המצע שלו - מה שעוזר לזהות זיהום נגיפי.

מערכת מדווח וירוסים רקומביננטי במבחנה לזיהוי זיהום ויראלי

נגיף הפטיטיס C (HCV) הוא פתוגן אנושי עיקרי הגורם להפרעות בכבד, כולל שחמת וסרטן. מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חיונית להבנת המנגנון המולקולרי של שכפול HCV ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחקירת שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

המטריצה החוץ-תאית של כבד חולדה נטול תאים יכולה לשמש כמודל ex vivo תלת מימדי אנושי כדי לחקור את התפוצה והביטוי הטרנסגני של נגיף או וקטור ויראלי.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).

מודל הפטוציטים מוסמך הבוחן את כניסת נגיף הפטיטיס B דרך נתרן טאורוחולאט קוטרנספורטינג פוליפפטיד כמטרה טיפולית

למד שיטה לייצור מניות וירוס צהבת E (HEV) בטיטר גבוה באמצעות תרביות תאי כבד. פרוטוקול זה מאפשר הפקת חלקיקים ויראליים מעטיפים ובלתי מעטיפים לחקר תרופות וחיסונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

גלה סרטונים נוספים