שיטת זיהוי כמותית למיקרו-רנ"א בכליה של מודל עכבר פגיעה כלייתית איסכמית

ביטוי שונה של מיקרו-רנ"א ב-AKI עשוי להיות שימושי לסמן ביולוגי ולטיפול. פרוטוקול זה פשוט ומשיג תוצאות קבועות בין מעבדות. IRI של הכליה מייצג את אחד מגורמי הסיכון העיקריים ל-AKI. כימות מיקרו-רנ"א שמשתנים על ידי IRI מוביל לאבחנה. מיקרו-רנ"א מטוהרים מדגימת כליה מוחלים על מערכת אחרת. עקוב בקפידה אחר היפותרמיה, לחות מעיים ועומק ההרדמה לאורך כל ההליך. הסיבה לכך היא שישנן טכניקות ידניות רבות שצריך להתרגל אליהן.

[קריין] לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, הנח את העכבר המורדם על משטח ניתוח מחומם במצב שכיבה. לאחר ביצוע חתך בטן בקו האמצע, השתמש בצמר גפן רטוב ב-PBS כדי לדחוף בעדינות את המעי לצד שמאל של חלל הבטן הנוסף כדי לחשוף את הכליה והשופכן הימני והשתמש במלקחיים זוויתיים כדי להרים את השופכן הימני. קשרו את השופכן בשני מקומות עם תפרים קלועים משי 4-0, והשאירו קשרים ארוכים יותר לתפר הקרוב יותר לכליה, וחתכו בין התפרים. החזיקו בזהירות את התפר שנותר, נתחו בבוטות את רקמת החיבור והשומן לאורך הכליה וזהו כלי דם שאינו עורקי הכליה או הוורידים המספקים דם לכליה הימנית. לקשור את כלי הדם, וכאשר הכליה הימנית נותקה מספיק, לקשור את וריד הכליה והעורק. בעזרת צמר גפן רטוב ב-PBS, דחפו בעדינות את המעי לכיוון הצד הימני של חלל הבטן הנוסף כדי לחשוף את הכליה השמאלית ולכסות את המעי בווילון לח. לאחר הכנת הכליה השמאלית כפי שהודגם, מהדק את עורק הכליה והווריד סנטימטר אחד מהכליה כדי לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית. איסכמיה מוצלחת יכולה להיות מאושרת חזותית על ידי התכהות אחידה הדרגתית של רקמת הכליה. כאשר האיסכמיה מאומתת, החזר את רקמת המעי לחלל הבטן, הקפד להימנע מפיתול המעיים, וסגור ועטוף באופן זמני את עור הבטן. לאחר 25 עד 45 דקות, הסר את המהדק ואשר כי זרימת הדם וצבע הכליות משתפרים. לאחר אישור שהמעי אינו מעוות, יש להחדיר PBS תוך צפקי ולסגור את שריר הבטן והעור בשתי שכבות באמצעות תפרי ניילון 4-0. 24 שעות לאחר השראת פציעה איסכמית, פתח מחדש את חתך קו האמצע והשתמש במחט בגודל 27 כדי לאסוף את הדם מהווריד הנבוב התחתון. בצע חתך בקו האמצע בדופן החזה והכנס מחט בגודל 23 לחדר השמאלי. לאחר אישור זרימה חוזרת לתוך המחט, בצע חתך באונה הימנית של הכבד והזריק 20 מיליליטר PBS. הכבד ישתנה לאדום לוורוד, מה שמאשר שמספיק דם נוקז. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי להסיר את הכליה השמאלית ולשטוף את הרקמה שנכרתה בכלי PBS. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להסיר את הפאשיה הכלייתית מבלי לייבש את הכליה וחתוך את הכליה לשניים לאורך קו האמצע האנכי. לטיהור מיקרו-RNA, הנח 30 מיליגרם מדגימת הכליה הקפואה לתוך הומוגנייזר זכוכית המכיל 700 מיקרוליטר של מגיב ליזה מבוסס פנילגואנידין על קרח וסובב לאט ושוב ושוב את העלי כדי להפוך את הדגימה להומוגניזציה מוחלטת. כאשר הרקמה נותקה לחלוטין, העבירו את הליזט ההומוגני למערכת גריסת הביופולימר בעמודת ספין מיקרו צנטריפוגה בצינור איסוף של שני מיליליטר ואספו את הדגימה לתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה. העבירו את הליזאט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש המכיל 140 מיקרוליטר כלורופורם וערבבו את הצינור בהיפוך למשך 15 שניות כשהמכסה מהודק היטב. לאחר דגירה של שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, משקעים את הדגימה על ידי צנטריפוגה ומעבירים את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש המכיל פי 1.5 מנפח 100% אתנול מבלי להפריע לגלולה. מערבבים את הדגימה במשך חמש שניות על ידי מערבולת לפני העברת 700 מיקרוליטר מהדגימה לעמוד ספין מבוסס קרום סיליקה בצינור איסוף של שני מיליליטר. לאחר צנטריפוגה קצרה, השליכו את הזרימה ושטפו את הדגימה פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה 2 בעמודת סיבוב חדשה מבוססת קרום סיליקה לכל שטיפה כדי להסיר עקבות מלח. לאחר הכביסה השנייה, צנטריפוגה שוב את עמוד הסיבוב המבוסס על קרום סיליקה, ולאחר השלכת הזרימה, העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר מים נטולי RNase לעמודה ודגר את הדגימה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני צנטריפוגה נוספת של הדגימה. לאחר מכן העבירו את האלויט המכיל מיקרו-רנ"א בנפח 25 מיקרוליטר לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. במחקר זה נחקרו שבעה מיקרו-רנ"א שהתבטאו בבני אדם שהיו מווסתים בכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית חריפה. הרמות של שישה מהמיקרו-רנ"א נמצאו מוגברות באופן משמעותי בכליות של עכברים שנפגעו מאיסכמיה בהשוואה לאלו בעכברים מדומים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת כפי שהודגם. רמות החנקן והקריאטינין בדם בסרום ונמק צינורי חריף היו גם הם מווסתים באופן משמעותי.

הסמנים הביולוגיים לאבחון IRI וטיפול ספציפי ב-AKI נותרו לא ברורים. אני מקווה שמחקר המיקרו-רנ"א יתקדם ויתרום לאבחון ולטיפול ב-AKI.