הערכת PCR בזמן אמת כמותית של ביטויי microRNA בכליות עכבר עם חסימה חד צדדית שופך

שיטה זו מאפשרת לספק ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם מגוון רחב של תנאים פתולוגיים, כגון פיברוזיס כליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת פרופיל ביטוי microRNA עם דיוק גבוה ורגישות באמצעות תהליך פשוט החוסך זמן ומונע שגיאה טכנית. כדי לבצע את הניתוח המזויף, השתמש במספריים כירורגיים פינצטה לעשות חתך בעור בבטן לחתוך את השריר ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה התחתון השמאלי של הצלעות.

להרדים שתי צמר גפן עם PBS בזהירות למשוך את המעיים לצד. מניחים את ספוגיות לחות כדי לזהות את הכליה השמאלית ואת השופכה. סגור את קרום צפדית ולאחר מכן את החתך עם 4-0 ניילון.

כדי לבצע את חסימת השופכה החד צדדית, או UUO, לבצע חתך בעור בבטן לחתוך את השריר ואת קרום צפק כפי שהוכח לניתוח מזויף. מניחים מזרק 2.5 מיליליטר מתחת לעכבר. להרדים שתי צמר גפן עם PBS, ולאחר מכן למשוך את המעיים בזהירות לצד עם פינצטה ולהנחות את ספוגיות לזהות את השופכה השמאלית.

השתמש פינצטה כדי להרים את הכליה השמאלית. השתמש 4-0 משי כדי לייגד את השופכה השמאלית בשני מקומות כ סנטימטר אחד זה מזה. חותכים את השופכה בנקודת המרכז של שתי ליגות ולאחר מכן להשתמש 4-0 תפרים ניילון כדי לסגור את קרום צפדית חתך.

לאחר חיתוך קרום הצפי, כפי שהוכח בעבר, להרים אותו עם פינצטה ולהשתמש מספריים כירורגיים לעשות חתך לצדדים בקצה העליון, ולאחר מכן להמשיך את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות. לזהות את הכליה השמאלית reflux אותו עם PBS עד הכליה הופכת צהוב לבן. הסר את הכליה על ידי חיתוך עורק הכליה השמאלית ואת וריד עם מספריים כירורגיים למקם אותו בצלחת פטרי, ולאחר מכן לשטוף אותו בזהירות עם PBS.

חותכים את הכליה לדגימות של כ -10 מיליגרם עם המספריים הכירורגיים והפינצטה, שמים כל חתיכה של הכליה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר משלה וסגרו את כובע הצינור. שים דגימת כליות homogenizer סיליקון ולהוסיף 700 microliters של ריאגנט תמוגה מבוסס פניל / גואנידין. לאט לאט ללחוץ ולסובב את העלי של homogenizer נגד דגימת הכליה כדי הומוגניזציה זה.

חזור על הלחיצה והתפתל עד שהדגימה תתמוסס לחלוטין בריג'נט התמיס. כדי להומוגניזציה נוספת של המדגם, העבר את ה-lysate ההומוגני לעמוד הסיבוב הביופולימרי וסובב אותו במהירות של 14,000 פעמים G למשך שלוש דקות, ולאחר מכן העבר את ה-lysate המזרז לצינור מיקרוצנטריפוגה לא נוצל של 1.5 מיליליטר. מערבבים את ה-lysate בצינור עם 140 מיקרוליטרים של כלורופורם ומכסים את הצינור בחוזקה.

כדי לערבב את ליסט וכלורופורם, להפוך את הצינור 15 פעמים. דגירה הדגימות במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לסובב אותם ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מבלי להפריע למשקעים, העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, והוסף פי 1.5 מנפחו של 100%אתנול.

מערבולת את התערובת במשך חמש שניות. לטעון 700 microliters של המדגם על עמוד ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה במהירות של 15,000 פעמים G למשך 15 שניות, ולאחר מכן השלך את ה- lysate המזרז בצינור האיסוף.

לשטוף את המדגם ביסודיות על ידי הוספת 700 microliters של חיץ לשטוף אחד לטור ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר. ואז לחזור על הצנטריפוגה ולזרוק את צינור האיסוף. חזור על לשטוף פעמיים עם 500 microliters של חיץ לשטוף שני לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, לסובב את עמוד ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר ב 15, 000 פעמים G לדקה אחת ולזרוק את lysate זירז. מעבירים את עמוד הסיבוב המעוגן קרום לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. ממיסים את ה-RNA הכולל על ידי הוספת 30 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase לעמוד, סוגרים את מכסה העמודה ומשאירים אותו לחמש דקות בטמפרטורת החדר.

ואז לסובב את הטור ב 15, 000 פעמים G לדקה אחת. מעבירים את הדגימה המכילה RNA כולל לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש על קרח, ולמדוד את הריכוז של RNA הכולל על ידי ספקטרופוטומיטריה. הכינו פתרון תמהיל ראשי בהתאם לכיווני כתב היד והוסיפו שמונה מיקרוליטרים לכל צינור של רצועת צינור בת שמונה בארות.

לאחר התאמת צפיפות ה- RNA הכוללת, מניחים אליטקוט 12 מיקרוליטר של RNA כולל לתוך כל צינור וסגרו את המכסה. צנטריפוגה הצינורות במשך 15 שניות. שים את הצינורות בתרמוצ'ילר ודגירה אותם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסיום, מיד דגירה אותם במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס לסינתזה של cDNA. מעבירים את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר ומדללים אותו 10 פעמים במים מזוקקים. Vortex ו צנטריפוגה הצינור במשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע PCR כמותי בזמן אמת, כמתואר בכתב היד טקסט.

פרוטוקול זה שימש ליצירת מודל עכבר חסימת שופכה חד צדדי באמצעות רצועות השופכה השמאלית בעכברים זכרים בני שמונה שבועות במשקל של 20 עד 25 גרם. השופכים נחסמו לחלוטין על ידי רצועות כפולות עם תפרי משי 4-0. הכליות נאספו בשמונה ימים לאחר הניתוח.

נתוני microRNA qRT-PCR הצביעו על כך שרמת המיקרו-רנ"א 3070-3p עלתה באופן משמעותי ורמות המיקרו-רנ"א, 7218-5p ו-microRNA 7219-5p ירדו בכליות של עכברי UUO בהשוואה לפקדים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לחזור לסובב את דגימת הכליה עד שהוא מומס לחלוטין בריאגנט תמיסת תמיסה מבוסס פניל / גואנידין כדי להשיג מיצוי RNA טוב.