ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

הי לך. אז זה פרוטוקול RNA צפוני קטן. זה נגזרת של פרוטוקול במקור אופטימיזציה על ידי ד"ר ראשיד Akbergenov.

בשיטה זו, ניתן לזהות RNA קטן של בכל מקום בין 20-24 נוקלאוטיד באורך, בדיוק רב וברזולוציה גבוהה מאוד. הפרוטוקול הוא בעצם צורה שונה של ניתוח צפון מסורתי, אבל כאן, אחוז האקרילאמיד הוא די גבוה, זה 15 אחוזים. ניתן להשתמש בצפון זה לגילוי RNA קטן ידוע כבר, RNA מיקרו או קבוצה אחרת של RNA קטן, כאשר הרצף ידוע או שזה יכול לשמש לאישור של שפע של RNA קטן מגיע מהדור הבא רצף datasets.

היתרון של שיטה זו הוא, אפשר לא רק להסתכל על שפע מיקרו RNA, אלא גם את השפע של מבשרים, למשל מיקרו RNAs עשוי להשאיר את מבשר אשר סביב 30 עשוי להיות כמה מאות נוקלאוטיד ארוך, זה יכול להיות מזוהה גם בו זמנית, יחד עם מיקרו RNA. הפרוטוקול הוא פשוט מאוד, ישר מאוד קדימה, אבל צריך להיות זהיר מאוד בעת ביצוע כמה צעדים קריטיים המפורטים בסוף פרוטוקול זה. להכנת תערובת ג'ל 10 מ"ל, הוסיפו 4.8 גרם אוריאה, 3.75 מ"ל של 40% פתרון אקרילאמיד, ו-1 מ"ל של 10X TBE שהוכן טרי, pH 8.2 ומערבבים בעדינות את הפתרון.

ממיסים את אוריאה לחלוטין, על ידי חימום התערובת באמבט מים, עד שהתמיסה נראית ברורה. הפוך את עוצמת הקול ל 10 מ"ל, באמצעות מים מיליQ סטריליים לקרר את תערובת הג'ל לטמפרטורת החדר. לשטוף את המנגנון הנדרש עם חומר ניקוי, לשפשף אותם בעדינות כדי להסיר TBE שיורית אקרילאמיד.

יש לשטוף אותם עוד יותר במים מיליQ ולאפשר להם להתייבש. להרכיב את צלחת הזכוכית יחד, להבטיח את שניהם באותה רמה. מניחים אותם בחוזקה על הספוג.

הוסיפו 8 מיקרו ליטר TEMED ו-80 מיקרו ליטר של 10% APS טרי לתערובת הג'ל. מערבבים בעדינות ויוצקים את תערובת הג'ל לצלחות המורכבות. ודא כי הג'ל לא דולף.

מניחים את המסרק בזהירות. אפשר לג'ל לעשות פולימריזציה במשך כ-45 דקות. לאחר פולמריזציה של הג'ל, להסיר את צלחות הזכוכית מן ההרכבה.

לשטוף את צלחות הזכוכית עם מים מיליQ. ות למקם אותם בקלטת הריצה. מניחים את קלטת הריצה בתוך המיכל.

יוצקים טרי מוכן 1X TBE, pH 8.2. הסר את המסרק בזהירות. לשטוף את בארות הג'ל ביסודיות על ידי צינורות החיץ.

שלב זה מסיר משקעים של אוריאה מה הבאר ומקל על ה-RNA לרוץ באופן אחיד על פני הג'ל. סגור את המכסה של המנגנון מראש להפעיל את הג'ל הריק ב 80 וולט במשך 30 דקות, כדי לבדוק כל דליפת חיץ. להכנת 10 מ"ל טעינת צבע, לשקול 5 מ"ג של כחול bromophenol, 5 מ"ג של קסילן ציאנול ולהוסיף 10 מ"ל של formamide deioinised ומערבבים אותם היטב.

יש לאחסן את הצבע ולאחסן ב-4 מעלות להמשך שימוש. Aliquot 10 מיקרוגרם של RNA הכולל לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל. ודא כי איכות ה- RNA, כלומר.

יחס 260:230 גדול או קרוב יותר לשניים. מניחים את הצינור בתוך speedVac ואקום לייבש את הדגימות. להשעות מחדש את דגימות RNA מיובש 8 מיקרו ליטר של צבע טעינה.

מחממים את הדגימות ב-98 מעלות לשתי דקות. מקררים אותם לדקה בטמפרטורת החדר. Vortex דגימות RNA מקורר כדי להבטיח השעיה מחדש נאותה בצבע הטעינה.

סובב את הצינורות. חזור על שלבי החימום, הקירור והמערבולת במשך שלוש פעמים לקבלת רנ"א זורם חופשי. עצרו את הריצה המוקדמת של הג'ל.

לשטוף את בארות ביסודיות, לפני טעינת המדגם, כדי להסיר פיקדונות של אוריאה בתוך בארות. מחממים את דגימות ה-RNA המושעות מחדש ב-98 מעלות למשך דקה אחת. לטעון את הדגימות חם לתוך בארות באמצעות טיפים נימי.

הימנע החדרת בועות אוויר. טעינה מלאה של כל הדגימות ולהרכיב את המכסה. הפעל את הג'ל ב 80 וולט במשך שלוש שעות או עד כחול bromophenol פועל לחלוטין.

השתמש קרום ניילון טעון חיובית עבור ההעברה. חותכים אותו לממדים של צלחת הזכוכית. תייג את הממברנה בפינה הימנית העליונה.

מניחים בעדינות את הממברנה על פני המים הסטריליים של מיליQ, הקפד למקם את צד התווית כלפי מטה, מול פני המים. קח מגש נקי והכן כריך ג'ל להעברת אלקטרו. מניחים את הצד האפור של הקלטת למטה.

יוצקים 1X TBE מעט מעל לרמת הקלטת. הרטיבו מראש את כרית הסיבים ב-1X TBE וסחטו אותה כדי להסיר בועות אוויר. חותכים שתי חתיכות של נייר סופג לגודל של כרית סיבים.

הרטיבו מראש פיסת נייר סופג ב-1X TBE והמקמים אותה מעל כרית הסיבים. הסר בועות אוויר על ידי גלגול פיפטה מפלסטיק על הנייר. הרטיב מראש עוד פיסת נייר סופג ב 1X TBE ולהניח אותו על הקלטת.

להתהפך כדי להסיר בועות אוויר. עכשיו הגדרת הכריך מוכנה להעברת אלקטרו. לאחר השלמת האלקטרופורזה, לעצור את הריצה ולהסיר את המכסה מן המנגנון.

הסר את המגירה הפועלת מההגדרה. תוציא את צלחות הזכוכית מקלטת הריצה. בזהירות להסיר את הג'ל מן ההרכבה.

הנח אותו על נייר סופג כך מדגם RNA טעון הראשון הוא לכיוון הזכות שלך. טובלים בעדינות את הממברנה השרויה מראש ב-1X TBE ומציבים אותה מעל הג'ל, מול הצד המסויג כלפי מטה. אין לאפשר לממברנה וג'ל להתייבש.

מגלגלים בעדינות להסרת בועת אוויר. טובלים פיסת נייר סופגת אחת ב-1X TBE ומניחים אותה מעל הממברנה. הסר בועות אוויר.

מניחים עוד פיסת נייר סופג ולהסיר את בועות האוויר. השלם את הכריך על ידי הנחת כרית הסיבים מעל ההרכבה. סגור את הקלטת בחוזקה.

מקם את הקלטת הטרנס-בלוק במודול. מלאו את המיכל ב-1X TBE, pH 8.2, עד לסימן הנפיחות. סגור את המכסה של המנגנון ולהעביר ב 10 וולט לילה ב 4 מעלות או בחדר קר.

שמור על מקשר UV לחצות מוכן ולהגדיר אותו 1200, ממש לפני השלמת העברת אלקטרו. לאחר השלמת ההעברה, הסר את הקלטת מהמודול. מניחים את הממברנה הלחה על גיליון A4, ומניחים את הצד המסומן כלפי מעלה.

לחצות את RNA לממברנה על ידי הקרנה עם 254 ננומטר אור UV ב 120 מילי joules. ניתן לאחסן את הכתם המקושר בארבע מעלות או להשתמש בו להכלאה. תכנן בדיקה כי הוא מחמיא לחלוטין RNA קטן שיש לזהות.

סיים לתייג את הגשוש בקצה החמישי שלו באמצעות אנזים PNK ולשלב את הרכיבים כפי שמוצג. הדגירה את תערובת התגובה ב 37 מעלות במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות של דגירה להשתמש בעמודות G-25 כדי להפריד בדיקות ללא תריס מתערובת התגובה.

לקבלת תיוג משופר של הגשוש, הכן את עמודת G-25 לפני השימוש. מניחים את הכתם, צד RNA פונה למעלה, בתוך בקבוק הכלאה. יש לערבב במרץ את מאגר ההכלאה לפני השימוש.

מוסיפים 10 מ"ל של חיץ הכלאה בפנים ומניחים את בקבוק ההכלאה בתוך תנור ההכלאה, לשמור על 35 מעלות עם סיבוב. בצע הכלאה מראש במשך 20 עד 30 דקות. לאחר טרום הכלאה להסיר את הבקבוק מהתנור.

הוסף בעדינות את הבדיקה המסוווית למאגר ההכלאה. ודא שבועות אוויר אינן נוצרות. הדגירה הכתם בתוך התנור ב 35 מעלות עם סיבוב במשך 12 שעות.

לאחר ההכלאה, הסר את מאגר ההכלאה מהבקבוק. בצע שטיפה מהירה של הכתמים, באמצעות חיץ לשטוף-I. שלב זה מבוצע כדי להסיר פתרון הכלאה עודף מן הכתמים.

עוד להתהגר כתמים ב 35 מעלות במשך 30 דקות באמצעות חיץ לשטוף-I. בצע שטיפה נוספת באמצעות Buffer-II ב 35 מעלות במשך 30 דקות. לאחר שטיפת הכתם, מניחים אותו בתוך מכסה הכלאה, להסיר חיץ עודף ולאטום אותו.

מניחים אותו בתוך קלטת ולחשוף אותו למסך זרחן-imager חינם קרינה במשך 12 שעות. לזהות את אות ההכלאה באמצעות דימוי ביומולקולרי טייפון ולנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ImageJ. עבור הכלאה של הכתם עם בדיקות אחרות, לבצע צעדי הפשטה כפי שמודגם.

עם טכניקה זו ניתן להעריך את השפע של מיקרו RNA, כמו גם את אורכו. מתוך תמונה זו, ביטוי של מיקרו RNA 397 ניתן לזהות בכל הדגימות. ב כתם זה, השפע של מדגם אחד הוא כ 5 קריאות למיליון, לפי נתוני רצף הדור הבא, מה שמרמז כי הטכניקה שלנו יכולה לזהות פחות מיקרו RNAs בשפע מדי.

בנוסף, באמצעות תוכנת כימות ImageJ, ניתן לכמת את הביטוי של מיקרו 397 בין הדגימות. כאן השתמשנו U6 ומיקרו RNA 168 כפקדי טעינה. אני אדבר על כמה צעדים מכריעים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הניסוי.

הקפד להשתמש RNA באיכות טובה להכנת מדגם. בעוד ואקום ייבוש הדגימות, להימנע מעל ייבוש אותם. השעיה מחדש של רנ"א בצבע הטעינה היא קריטית.

הקפד להכין מדגם זורם חופשי. יש לדאוג בעת טעינת הג'ל. בארות הג'ל חייבות להישטף ואת המדגם יש לטעון בקו ישר בתוך בארות.

במהלך העברת האלקטרו, התפשטות הממברנה במים, ממש לפני טבילתו ב- 1X TBE היא חיונית, היא משפרת את ההעברה. ההכלאה של הכתם חייבת להתבצע ב 35 מעלות. שמור על הטמפרטורה של תנור ההכלאה.

לשימוש חוזר של הכתמים, יש לאחסן קרום ב-4 מעלות. הם צריכים להישמר לחים ב 2X SSE. שלא כמו שיטות מבוססות PCR אחרות, שיטה זו מבטיחה כימות של הביטוי, כמו גם קביעת גודל המיקרו RNAs.