בצומת המבחנה Neuromuscular המושרה מתאי גזע פלורופוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

זה מערכת אינדוקציה צומת neuromuscular אנושי יכול לשמש כדי לגרום להיווצרות של רכיבים לפני ופוסט סינפטית, כולל נוירונים מוטוריים, שריר השלד, ותאי שוואן. לא רק שניתן להשיג מבנה NMJ בוגר ומורכב בצלחת תרבות אחת מאוכלוסיית תא התחלתית אחת, אלא של- NMJ שנוצר יש גם את היכולת להתכווץ. לשיטה זו יש פוטנציאל לחקר מחלות נוירומוסקולריות, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה, ולהקרנת תרכובת טיפולית.

ה- NMJ המובחן הוא רקמה עבה ומורכבת מאוד, וקשה לדמיין אותה. על ידי הדגמת ההליך, אנו יכולים להורות לקוראים כיצד לזהות מבנים ספציפיים. לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של PBS לפני הוספת מיליליטר אחד של פתרון ניתוק התא לצלחת פטרי.

לאחר 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף שלושה מיליליטר של תא גזע עוברי פרימטים בינוני לכל באר בעדינות pipette שלוש פעמים כדי לנתק את התאים מן coverslips. לאחר מכן, בריכת תאי גזע מנותק המכילים עלנטנטים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה ו resuspend גלולת תא גזע בשלושה מיליליטר של תא גזע עוברי פרימט טרי בינוני בתוספת 10 מיקרומולרי Y-27632 מעכב רוק לספירה. לאחר מכן לדלל את התאים פעמיים 10 לחמשת התאים למיליליטר של בינוני בתוספת ריכוז מעכבי ROCK ולהחזיר שני מיליליטר של תאים לכל כיסוי בכל באר של צלחת מטריצה חוץ תאית מצופה שש באר.

לאחר 24 שעות, להחליף את supernatant בכל באר עם שני מיליליטר של תא גזע עוברי פרימטים טריים בינוני בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך 24 שעות. בסוף האינקובציה, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של בינוני ההידול בתוספת דוקסיציקלין ל הבאר ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 10 ימים. בסוף האינקובציה, החלף את העל-טבעיים בשני מיליליטר של מדיום ההתבידול המיוגני בתוספת דוקסיציקלין ל הבאר והחזר את הצלחת לאנקובטור תרבות התאים למשך 10 ימים נוספים.

בסוף האינקובציה, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של צומת neuromuscular בינוני ל הבאר ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך 30 ימים. בסוף הדגירה, לדמיין את הצמתים neuromuscular מובחן על ידי מיקרוסקופיה הפוכה. כדי להפעיל את התכווצויות myotube, להוסיף 25 מילימולר סידן כלורי לכל באר של תאי צומת neuromuscular מובחן.

ובתוך 1-2 דקות של טיפול, מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים, להקליט סרט של התכווצות myotube במשך 20 שניות. בסוף ההקלטה, להוסיף 300 ננוגרם למיליליטר של curare למדיום התרבות ולהקליט את הסרט עוד 20 שניות לפני פתיחת קובץ הסרט בתוכנת ניתוח וקטור תנועה מתאימה לניתוח.

כתמים immunofluorescent של כלי סינפטית neurofilament קולטני אצטילכולין יכול להתבצע כדי לזהות את הנוירונים. נוירונים מוטוריים יכולים להיות מזוהים על ידי TUJ 1 ו איון 1 מכתים, בעוד myotubes פוסט סינפטית ניתן לזהות על ידי כתמים עבור שרשרת כבדה myosin. ניתן לסמן תאים שוואניים בנוגדן S-100.

בתמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים סריקה אלה, ניתן לראות את המורפולוגיה של צמתים נוירומוסקולריים בוגרים עם הדמיה ברורה של מסופי האקסון המורחבים, האקסונים וסיבי השריר. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור יכול לשמש כדי לדמיין את המבנה אולטרה בוגרת של רכיבים neuromuscular, כולל מסוף אקסון presynaptic עם ארס סינפטית ואת האזור הפוסט סינפטית, אשר מופרד על ידי שסוע סינפטית. קפלי צמתים מסמנים את הצומת בין הנוירון לסיבי השריר.

כאן מוצגים מסופי אקסון בוגרים המכילים וקסיקים סינפטיים. יחד, תכונות מורפולוגיות אלה מצביעות על כך שהרכיבים הנוירומוסקולריים היו המושרים היטב והתבגרו. הערכה תפקודית של התאים מגלה כי אותות תנועה בולטים צומת neuromuscular יכול להיות המושרה על ידי סידן כלורי, כי התכווצויות אלה ניתן להפריע על ידי curare המאשר כי אותות נוירון מוטורי מועברים דרך צומת neuromuscular כדי לעורר התכווצות שרירים.

צפיפות זריעת התאים משפיעה על היעילות של היווצרות NMJ. זה יכול להיות שונה כדי להתאים את הפרוטוקול, על פי המטרות הניסיוניות. תרבות צומת נוירומוסקולרית זו מכילה סוגי תאים מרובים, ורכיבים אלה יכולים לשמש לחקר האינטראקציות בין תאים אלה במהלך התפתחות צומת neuromuscular או בתגובה פתולוגיות מחלה ספציפיות.