Name: מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למד מדידת קשירת ATP לקולטנים בזמן אמת באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים לחלבונים מסומנים בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניטור מדויק של אינטראקציות קולטן בתאי HEK293T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לראול טרון אקספוזיטו על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/R002517/1; MCP ו-FMA) וקרן Wellcome (203731/Z/16/A; SGU)

<ol><li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy.+3rd+edn%22">Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li>
<li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases%3A+excitement+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li>
<li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNG+and+HCN+channels%3A+two+peas%2C+one+pod%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li>
<li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strict+coupling+between+CFTR%27s+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1%3A+A+Mechanistic+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li>
<li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li>
<li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K%28%2B%29+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103(2019).</li>
<li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K%2B+channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775(2020).</li>
<li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li>
<li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+%27cell+cortices%27+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li>
<li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase%2FtRNA+expression+and+engineered+eRF1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li>
<li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562(2015).</li>
<li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li>
<li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding%2C+gating%2C+affinity+and+efficacy%3A+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li>
<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li>
<li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7(2003).</li>
<li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li>
<li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K%2B+channel+with+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K%28V%29+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li>
<li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K%28%2B%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li>
<li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li>
<li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li>
<li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li>
<li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876(2017).</li>
<li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1%2C+P2X3%2C+and+heteromeric+P2X2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li>
<li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פיתחנו שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד בזמן אמת לחלבוני ממברנה שלמים. השיטה שלנו מתבססת על מספר טכניקות מבוססות אחרות, כולל תיוג חלבונים עם ANAP באמצעות דיכוי קודון עצירה ענבר 12, הסרת קירוי תאים 14, ופלואורומטריית מהדק מתח/PCF19,20,21,22,23,24,25. הסינתזה של גישות אלה מאפשרת מדידה של קשירת נוקלאוטידים ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. ואכן, בעבודתנו הקודמת הצלחנו להבחין בין אתרי קישור שונים על אותו קומפלקס חלבונים באמצעות גישה זו10,11. חשוב לציין כי ניתן ליישם טכניקה זו ישירות על כמויות קטנות של חלבון בסביבה תאית בתנאים המשמרים את תפקוד החלבון. השימוש בשיטת הקשירה שלנו בשילוב עם קריאה ישירה ואלקטרופיזיולוגית של זרמי תעלות יונים מאפשר לנו לקבל תובנות עשירות על היסודות המולקולריים של ערוץגאטינג 11.
מכיוון שספקטרומטרים הם ציוד מעבדה לא סטנדרטי, ניתן לנטר את עוצמת ANAP גם בבידוד יחסי באמצעות מסנני פסים. איור 5B מתאר את התכונות הספקטרליות של שני מסננים כאלה. מסנן הפס 470/10 ננומטר מסנן ביעילות את אות הפלואורסצנטיות מ-TNP-ATP וחופף היטב לשיא הפלואורסצנטיות של ANAP. עם זאת, שיא ההעברה של מסנן זה הוא רק סביב 50%, מה שעלול להקשות על קבלת אותות טובים מממברנות עמומות (או בכתמי קרום נכרתו תחת מהדק מתח). אפשרות נוספת היא מסנן פסים של 460/60 ננומטר. יש מעט יותר חפיפה בין מסנן 460/60 ננומטר לבין כף הרגל של שיא הפליטה TNP-ATP בהשוואה למסנן 470/10 ננומטר. עם זאת, לפס 460/60 ננומטר יש העברה של 90-95% על פני טווח רחב של שיא ANAP, אשר צפוי להגביר את אות הפלואורסצנטיות.
ANAP הוא פלואורופוררגיש לסביבה 12,26,27. שיא הפליטה ותפוקת הקוונטים משתנים בהתאם לאתר ההתאגדות של החלבון המעניין ועשויים להשתנות כאשר החלבון משנה קונפורמציה. שינויים כאלה יהיו ברורים באופן מיידי מספקטרום הפליטה, אך לא יהיו ברורים כל כך כאשר עוצמת ANAP נמדדת באמצעות מסננים. בכל מקרה, נדרשות בקרות מתאימות כדי להוכיח שהאות הפלואורסצנטי אינו משתנה בגלל שינויים בסביבה המקומית סביב ANAP בעקבות קשירת הנוקלאוטידים. ניסויי בקרה עם נוקלאוטידים לא מסומנים יכולים לעזור לוודא שכל שינוי בעוצמת ANAP הוא תוצאה של FRET בין ANAP לנוקלאוטידים TNP. TNP-נוקלאוטידים יכולים להיקשר באופן לא ספציפי לממברנות שמקורן בתאים לא נגועים (לקרום הפלזמה או לחלבוני הממברנה המקומיים)10. אנו מכמתים את הכריכה כגזירה בפלואורסצנטיות של התורם, מכיוון שאות זה הוא ספציפי לערוץ המסומן. עם זאת, אנו ממליצים לבצע ניסויי בקרה נוספים עבור כל זוג אגוניסטים/קולטנים, למשל מוטציה באתר קשירת הנוקלאוטידים אם ידוע, כדי לוודא שהשינוי בפלואורסצנטיות של התורם הוא אכן תוצאה של קשירה ישירה לקולטןהמסומן 11. לבסוף, מומלץ לעבוד עם מבנים המכילים תג חלבון פלואורסצנטי בנוסף לתווית ANAP. זה עוזר להבדיל בין פלואורסצנטיות קולטן מסומן לבין רקע / אוטופלואורסצנטיות. ניתן להבדיל בין פלואורסצנטיות רקע לבין ANAP על ידי שיא וצורה של ספקטרום פליטה10, אך קביעות כאלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר משתמשים רק בערכות סינון. בנוסף, ניתן לזהות תאים וקרומים לא מקורים המבטאים קולטנים פלואורסצנטיים באמצעות תג החלבון הפלואורסצנטי מבלי לעורר ANAP ולהסתכן בהלבנה מוגזמת.
ברבות מרישומי ה-PCF שלנו ראינו שיא שלילי חזק בספקטרום שלנו בריכוזי TNP-ATP גבוהים (איור 4C). שיא שלילי זה הוא תוצר של פרוטוקול חיסור הרקע שלנו. איור 4D מראה תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של פיפטת טלאי שנחשפה ל-1 mM TNP-ATP. ניתן להבחין בצל בקצה הפיפטה, הנובע מהרחקת TNP-ATP מנפח דפנות הפיפטה, הניכרת ביותר במישור המיקוד. התמונה הספקטרלית באיור 4E מראה פס כהה, המתאים לצל הזה. כאשר אזור מעל או מתחת לפס כהה זה משמש לחיסור רקע, הוא מפיק שיא שלילי. חשוב לציין כי שיא זה התרחש בטווח אורכי גל המתאים לפליטת TNP-ATP ולא השפיע על המדידות שלנו של מרוות ANAP.
המגבלה העיקרית של הניסויים שלנו הייתה בהשגת ביטוי הולם של קרום פלזמה של מבנים המתויגים על ידי ANAP כדי למדוד פלואורסצנטיות. בדרך כלל היה קל יותר לרכוש ספקטרום איכותי מממברנות לא מקורות, מאשר ב-PCF, בשל גודלן הגדול יותר ויכולתנו לסרוק במהירות צלחת שלמה של ממברנות לא מקורות, בניגוד ל-PCF שם ניתן לקבל טלאים רק אחד בכל פעם. בניסויים שלנו, הנתונים מממברנות לא מקורות, ומניסויי PCF היו דומים אך לא שווי ערך (איור 6)11. עם זאת, אין סיבה אפריורית מדוע זו צריכה להיות תצפית אוניברסלית מכיוון שחלבונים בפיפטת טלאי עשויים להיות במצב תפקודי שונה מאלה שבממברנות לא מקורות.
כאן, נעשו ניסיונות למקסם את הביטוי של המבנים המתויגים ANAP שלנו, במיוחד הורדת טמפרטורת תרבית התא ל 33 ° C10,11,16. מניסיוננו, הניסיון לזהות אתרים בחלבון שבהם ANAP יהיה תחליף שמרני לא הניב באופן עקבי מבנים שהתבטאו היטב. הייתה לנו הצלחה רבה יותר בסריקה שיטתית של אזורי חלבון שלמים עבור אתרי שילוב ANAP וסינון מועמדים לביטוי פני שטח10. מערכת התיוג ANAP פועלת גם בביציות Xenopus laevis, המאפשרת כריתה של מדבקות קרום גדולות בהרבה, ובכך מגבירה את האות לרעש26,27,28.
בעוד שרמות ביטוי גדולות יותר צפויות לגרום לאותות בהירים יותר, מספר הערוצים המינימלי הדרוש למדידת פלואורסצנטיות תלוי במספר גורמים, כולל בהירות הפלואורופור, מידת ההלבנה, עוצמת אור העירור ומישור המיקוד. בתיאוריה, ניתן לבצע הערכות על ידי מתאם בין עוצמת הפלואורסצנטיות לבין זרם הערוץ כפי שהוכח בעבר28,29. עם זאת, מהימנותם של אומדנים כאלה דורשת ידע מסוים על המוליכות החד-ערוצית ועל ההסתברות הגלויה של הערוץ. בנוסף לגורמים המפורטים לעיל, האות הפלואורסצנטי יושפע גם מתעלות הקשורות לשלפוחיות או חלקים של קרום הפלזמה הדבוקים לזכוכית פיפטה שאינם תחת מהדק מתח.
שיטה זו מותאמת בקלות לחקר תעלות יונים אחרות הרגישות לנוקלאוטידים. CFTR דומה מבחינה מבנית לתת-היחידה של קולטן סולפונילאוריאה של KATP30,31. כמו KATP CFTR GATING נשלט על ידי קשירת נוקלאוטידים, מה שהופך אותו למטרה עתידית ברורה של שיטה7 שלנו. קולטני P2X פורינרגיים הם תעלות יונים המגודרות על ידי ATP9 חוץ-תאי. TNP-ATP פועל כאנטגוניסט לקולטני P2X32,33. לכן, זה לא יהיה שימושי לחקר הפעלת P2X, אם כי ניתן להשתמש בו במבחני תחרות עם אגוניסטים P2X. לחלופין, נגזרות ATP פלואורסצנטיות אחרות עם חפיפה ספקטרלית מספקת עם פליטת ANAP עשויות לשמש לחקר ההפעלה. Alexa-647-ATP הוא אגוניסט P2X פלואורסצנטי34. R0 המחושב בין Alexa-647 ו- ANAP הוא ~ 85 Å, מה שאומר שקשירה ישירה ל- P2X אמורה לגרום לרוויה משמעותית של ANAP המשולב בתעלה. עם זאת, R0 ארוך כזה יגרום גם למרווה מ-Alexa-647-ATP הקשור לתת-יחידות שכנות ויגדיל את הסבירות שקשירת נוקלאוטידים לא ספציפיים תגרום ל-FRET. מכיוון שאתר קשירת הליגנד בקולטני P2X הוא חוץ-תאי, מדידות הקשירה יבוצעו על תאים שלמים, במהדק מתח של כל התא, או בכתמי קרום חיצוניים. ניתן להרחיב את השיטה שלנו גם לחקר קשירה והפעלה של טרנספורטרים ומשאבות אלקטרוגניים ולא אלקטרוגניים התלויים ב-ATP עבור מחזור התגובה שלהם, כמו גם קולטני P2Y מצומדים לחלבון G. לבסוף, למרות שפיתחנו שיטה זו למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), ניתן להשתמש באותה גישה כדי לחקור קשירה כמעט לכל קולטן שעבורו זוהה ליגנד פלואורסצנטי מתאים.

מספר סוגים חשובים של חלבון מווסתים ישירות על ידי קשירת ליגנד. אלה נעים בין אנזימים מסיסים לחלבונים משובצים בקרום, כולל קולטן טירוזין קינאזות, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) ותעלות יונים. GPCRs וערוצים מהווים ~34% ו~15% מכלל יעדי התרופות הנוכחיים, בהתאמה 1,2. לכן, קיים עניין ביוכימי ורפואי רב בפיתוח שיטות המספקות תובנות מכניסטיות לגבי אינטראקציות ליגנד-קולטן. שיטות מסורתיות למדידת קשירת ליגנדים, כולל תיוג זיקת אור ומחקרי קשירת רדיוליגנד, דורשות כמויות גדולות של חלבון מטוהר חלקית ומבוצעות בדרך כלל בתנאים לא פיזיולוגיים ובסקאלות זמן. שיטה אידיאלית תדרוש כמויות קטנות בלבד של חלבון, תוכל להתבצע על חלבונים שלמים המבוטאים בסביבה תאית או ממברנה, תוכל להיות מנוטרת בזמן אמת, ותהיה תואמת לקריאות ישירות של תפקוד החלבון.
Förster resonance energy transfer (FRET) היא שיטה המזהה את הקרבה בין שתי מולקולות המתויגות באופן פלואורסצנטי3. FRET מתרחש כאשר פלואורופור תורם נרגש מעביר אנרגיה באופן לא קרינתי למולקולת קבלה (בדרך כלל פלואורופור אחר). העברת אנרגיה גורמת למרווה של פליטת הפלואורסצנטיות של התורם ולרגישות של הפליטה המקבלת (אם המקבל הוא פלואורופור). יעילות ההעברה תלויהבחזקת 6 של המרחק בין התורם למקבל. יתר על כן, התורם והמקבל חייבים להיות בקרבת מקום (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) כדי ש- FRET יתרחש. ככזה, ניתן לנצל את FRET כדי למדוד את הקישור הישיר בין קולטן חלבון המסומן באופן פלואורסצנטי לבין ליגנד פלואורסצנטי.
מספר חלבונים שונים מווסתים או מופעלים על ידי קשירת נוקלאוטידים אדנין תוך-תאיים או חוץ-תאיים (ATP, ADP, AMP, cAMP). חלבוני טרנספורטר רבים זקוקים להידרוליזה של ATP עבור מחזור התגובה שלהם, כולל מובילי קלטות קושרי ATP ו-ATPases מסוג P כמו משאבת Na+/K+ 4,5. תעלות K+ (K ATP) רגישותל-ATP, וסת ההולכה הטרנסממברנה של סיסטיק פיברוזיס (CFTR) ותעלות מווסתות נוקלאוטידים מחזוריות הן כולן תעלות יונים המגודרות על ידי קשירה של נוקלאוטידים אדנין תוך-תאיים, מה שהופך אותם לרגישים להפליא לשינויים בחילוף החומרים התאי ובהעברת אותות 6,7,8. קולטני P2X ו-P2Y פורינרגיים מגיבים לשינויים ב-ATP חוץ-תאי, שיכול להשתחרר כמוליך עצבי או כתוצאה מנזק לרקמות9. פיתחנו בדיקה מבוססת FRET למדידת קשירת נוקלאוטידים אדנין לחלבוני ממברנה בזמן אמת. בעבר יישמנו שיטה זו כדי לחקור קשירת נוקלאוטידים לתעלות KATP 10,11.
כדי למדוד קשירת נוקלאוטידים באמצעות FRET, חלבון מעניין חייב להיות מתויג תחילה עם פלואורופור. התג הפלואורסצנטי חייב להיות מוכנס לחלבון המעניין אותו כך שיהיה קרוב מספיק לאתר קשירת הליגנד כדי ש-FRET יתרחש, תוך הקפדה מיוחדת על כך שהתג לא ישפיע על המבנה הכללי של החלבון ותפקודו. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בטכניקה שפותחה על ידי Chatterjee et al., באמצעות דיכוי סטופ-קודון ענבר כדי להחדיר חומצת אמינו לא קנונית פלואורסצנטית (l-3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropionic; ANAP) באתר הרצוי12. אנו מודדים קשירת נוקלאוטידים כ-FRET בין חלבון המסומן בתווית ANAP לבין נגזרות נוקלאוטידים פלואורסצנטיים של טריניטרופניל (TNP) (איור 1A). ספקטרום הפליטה של ANAP חופף לספקטרום הספיגה של TNP-נוקלאוטידים, תנאי הכרחי להתרחשות FRET (איור 1B). כאן אנו מתארים שני סוגים שונים של ניסוי מחייב. בראשון, קשירת נוקלאוטידים לצד התוך-תאי של תעלות KATP המסומנות על ידי ANAP נמדדת בתאים שלא כוסו על ידי סוניקציה והותירו שברים דבקים של קרום פלזמה על מכסה זכוכית10,11,13,14.
בשיטה השנייה, קשירת נוקלאוטידים לתעלות KATP המסומנות על ידי ANAP נמדדת בטלאי קרום תחת מהדק מתח, מה שמאפשר מדידה בו זמנית של זרמים יוניים ופלואורסצנטיים. על ידי שילוב שתי גישות ניסיוניות אלה, שינויים בקשירה יכולים להיות בקורלציה ישירה עם שינויים בפונקציית ערוץ11. תוצאות אופייניות, מלכודות פוטנציאליות וניתוח נתונים נדונים.

<table><tbody><tr><td>T75 בקבוק שטופל בתרבית</td><td>רקמות StarLab</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>0.1% משקל/נפח פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>30 מ"מ כיסוי בורוסיליקט החלקות זכוכית</td><td>VWR</td><td>631-0174</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כלים סטריליים לא מטופלים</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-3340</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ כיסוי זכוכית תחתון צלחת</td><td>WPI</td><td>FD35-PDL-100</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE select (tryosin)</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>מגיב טריפסין/EDTA</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure מים מזוקקים</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T תאים</td><td>ATTC</td><td>CRL-3216</td><td>בשימוש בין מעברים 5-30</td></tr><tr><td>ANAP-TFA</td><td>AsisChem</td><td>ASIS-0014</td><td>משוחזר ב -30 מ"מ NaOH לריכוז סופי של 1 מ"מ</td></tr><tr><td>ביטוי pANAP פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #48696</td><td>מקודד זוג סינתטאז tRNA / tRNA לביטוי חלבון מתויג ANAP</td></tr><tr><td>peRF1-E55D</td><td>מעבדת צ'ין (מעבדת MRC לביולוגיה מולקולרית, קיימברידג', בריטניה)</td><td>ג'ייסון צ'ין: DOI: 10.1021/ja5069728</td><td>מקודד גורם שחרור ריבוזומלי אוקריוטי שלילי דומיננטי</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td><td>מגיב טרנספקציה ליפופוליפלקס</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט בעלי קירות עבים</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>GC150F-15</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילרודמין-5-מלימיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94506</td><td></td></tr><tr><td>TNP-ATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-221L</td><td>נמסר ב-10 מ"מ במים</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U מיקרוסקופ מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60x מטרת טבילה במים (1.4 NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr><tr><td>4 אורכי גל LED בהספק גבוה</td><td>ThorLabs</td><td>LED4D245</td><td>נוריות LED 385/490/565/625 ננומטר</td></tr><tr><td>דרייבר LED ארבעה ערוצים</td><td>ThorLabs</td><td>DC4100</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עירור מעבר פס 390/18 ננומטר</td><td>ThorLabs</td><td>MF390-18</td><td>לעירור ANAP</td></tr><tr><td>מסנן פליטה מעביר ארוך 400 ננומטר</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0400</td><td>להדמיה ספקטרום ANAP</td></tr><tr><td>416 ננומטר קצה דיכרואי</td><td>ThorLabs</td><td>MD416</td><td>להדמיה ספקטרום ANAP</td></tr><tr><td>מסנן פליטת פס 460/60 ננומטר</td><td>ThorLabs</td><td>MF460-60</td><td>מסנן מעבר פס רחב מוצע להדמיית פלואורסצנציה של ANAP (איור 4B)</td></tr> <tr><td>מסנן פליטת פס פס של 470/10 ננומטר</td><td>ThorLabs</td><td>FB470-10</td><td>מסנן מעבר פס צר מוצע להדמיית פלואורסצנציה של ANAP (איור 4B)</td></tr> <tr><td>מסנן עירור מעבר פס 531/40</td><td>Brightline</td><td>FF01-531/40-25</td><td>עבור עירור חלבון פלואורסצנטי כתום (OFP)</td></tr><tr><td>מסנן עירור מעבר פס 540/25 ננומטר</td><td>Chroma</td><td>D540/25X</td><td>לעירור טטרמתילרודמין-5-מלימיד (TMRM)</td></tr><tr><td>562 ננומטר קצה דיכרואי</td><td>Semrock</td><td>FF562-Di03</td><td>להדמיה פלואורסצנטי OFP</td></tr><tr><td>565 ננומטר קצה דיכרואי</td><td>כרומה</td><td>565DC</td><td>להדמיה TMRM פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>593/40 ננומטר מסנן עירור מעבר פס</td><td>Brightline</td><td>FF01-387/11-25</td><td>להדמיה פלואורסצנטי OFP</td></tr><tr><td>605/55 ננומטר פס מעבר מסנן פליטה</td><td>Chroma</td><td>D605/55M</td><td>להדמיה TMRM פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>IsoPlane-160 ספקטרומטר הדמיה</td><td>Princeton Instruments</td><td>IsoPlane-160</td><td></td></tr><tr><td>PIXIS 400BR_eXcelon מצלמה</td><td>Princeton Instruments</td><td>PIXIS: מגבר 400BR_eXcelon</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>Axopatch 200B-2</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A דיגיטייזר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור בדיקה</td><td>סוניקה & חומרים</td><td>VC-50</td><td>לפתיחת קירוי</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית דיגיטלית</td><td>REGLO Ismatec</td><td>ISM 832</td><td>לזלוף אמבטיה</td></tr><tr><td>מערכת זלוף מיקרו-נפח</td><td>ALA מכשירים מדעיים</td><td>ALA &mu; Flow-8</td><td>עבור זלוף TNP-ATP</td></tr><tr><td>pClamp 10.6.2</td> התקנים <td></td><td>מולקולריים</td><td>הקלטה וניתוח זרמים</td></tr><tr><td>Lightfield 5.20.1507</td><td>Princeton Instruments</td><td></td><td>תוכנת רכישה לתמונות וספקטרום</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>לניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Python 3.8.1</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td>לניתוח נתונים</td></tr></tbody></table>

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

פיתחנו שיטה למדידת קשירה של נוקלאוטידים אדנין לקולטנים טרנסממברנליים שלמים ופונקציונליים בסביבה תאית או ממברנה. שיטה זו משלבת ביטוי של חלבונים המתויגים עם חומצת האמינו הפלואורסצנטית הלא קנונית ANAP, ו- FRET בין ANAP ונגזרות נוקלאוטיד פלואורסצנטיות (trinitrophenyl). אנו מציגים דוגמאות של קשירת נוקלאוטידים לתעלות יון KATP המתויגות על ידי ANAP שנמדדו בקרומי פלזמה לא מקורים ובכתמי קרום שנכרתו מבפנים החוצה תחת מהדק מתח. האחרון מאפשר מדידות בו זמנית של קשירת ליגנד וזרם ערוץ, קריאה ישירה של תפקוד החלבון. טיפול וניתוח נתונים נדונים בהרחבה, יחד עם מלכודות וחפצים. שיטה זו מספקת תובנות מכניסטיות עשירות לגבי ה-gating תלוי הליגנד של תעלותK ATP וניתן להתאים אותה בקלות לחקר חלבונים אחרים המווסתים נוקלאוטידים או כל קולטן שעבורו ניתן לזהות ליגנד פלואורסצנטי מתאים.

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

מכיוון ש-ATP הוא שליח תאי חשוב, פיתחנו שיטה המאפשרת לנו למדוד את קשירת ה-ATP לקולטנים שלו בדיוק גבוה. באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית, אנו יכולים לעקוב אחר קשירת נוקלאוטידים לקולטנים פונקציונליים שלמים בזמן אמת וברזולוציה מרחבית מצוינת. אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את ההשפעות של חילוף החומרים התאי על תעלת האשלגן הרגישה ל-ATP, אשר מעורבת בצורות מסוימות של סוכרת.כדי לערוך ניסוי בממברנה ללא גגות, השתמשו תחילה בזוג מלקחיים כדי לשבור שבר קטן מחליק כיסוי עם תאים נגועים ושטפו את המקטע עם PBS. אם החלקת הכיסוי מצופה מראש בפוליליזין, הניחו את השבר בתחתית צלחת 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר PBS והחזיקו סוניק בדיקה של שלושה מילימטרים שלושה עד חמישה מילימטרים מעל הדגימה, פועם בעוצמה של 50 וואט ומשרעת של 20% עד 40% למשך 200 עד 500 אלפיות השנייה כדי לפתוח את גג התאים. אם החלקות הכיסוי אינן מצופות מראש, לאחר שטיפה עם PBS, טבלו את השבר בצינור המכיל 0.1% פולי-L-ליזין למשך כ-30 שניות לפני שתפרקו את קירוי התאים עם סוניקציה קצרה כפי שהודגם בהדגמה.מעבירים את השבר הסוני לצלחת זכוכית מכוסה תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ומרכיבים את הצלחת על מיקרוסקופ הפוך המצויד ביעד טבילה במים בעל מפתח נומרי גבוה פי 60. בדקו שיציאת המצלמה של המיקרוסקופ מחוברת לספקטרוגרף בסדרות עם מצלמת CCD בעלת רגישות גבוהה והשתמשו במשאבה פריסטלטית כדי לחורר את תא האמבטיה עם חיץ בקצב זרימה של 0.5 עד מיליליטר חיץ לדקה. כדי לזהות שברי קרום לא מקורים המבטאים את התעלה המסומנת ANAP, עיין בדגימה כדי לאתר ממברנות עם תעלות פלואורסצנטיות.הפעילו חלקית את מסיכת הספקטרומטר בין יציאת המצלמה במיקרוסקופ לבין הספקטרוגרף. צל המסכה יופיע על תמונת המצלמה. לרכוש שדה בהיר תמונה פלואורסצנטית של הממברנה unroofed כדי לאפשר בחירה של האזור של עניין לניתוח.קרבו את קצה מערכת הזילוח למיקרו-נפח לקרום הלא מקורה. כדי לקבל תמונה של פלואורסצנטיות ANAP, לעורר את הממברנה עם LED 385 ננומטר דרך מסנן עירור מעבר פס 390/18 ננומטר ודיכרואית קצה 416 ננומטר, איסוף האור הנפלט דרך מסנן פליטה 400 ננומטר ארוך. הפעילו את מסיכת הספקטרומטר וודאו שהאור הנפלט עובר דרכה.יישר את אזור העניין עם החריץ של מסיכת הספקטרומטר. הפעילו את גרגרי הספקטרומטר. עם הגרגרים במקומם, האור המפוזר על ידי הספקטרומטר יוקרן על השבב של מצלמת CCD כדי להפיק תמונות ספקטרליות.התמונות ישמרו מידע מרחבי בממד Y. ממד X יוחלף באורך גל. תוך כדי התעסקות עם תמיסת חיץ ללא נוקלאוטידים, קבל חשיפה אחת או יותר של 0.1 עד עשר שניות לתיקון במורד הזרם ולנורמליזציה של הנתונים שנאספו לאורך שאר הניסוי.לאחר מכן, יש למרוח טווח של ריכוזי TNP ATP בתמיסת אמבטיה כדי לקבוע עקומת תגובת ריכוז, תוך ערבוב כל תמיסה למשך דקה אחת לפחות כדי להבטיח הגעה למצב יציב ולקבל חשיפה לכל ריכוז. לאחר כל ריכוז, שטפו את TNP ATP בתמיסת אמבטיה נטולת נוקלאוטידים למשך דקה אחת לפחות לפני קבלת תמונת חשיפה לאחר הטיפול. כדי לבצע ניסוי פלואורומטריה מהדק טלאי, תחילה משוך פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט עבים בעלי דופן להתנגדות של 1.5 עד 2.5 מגה-אוהם כאשר הם מלאים בתמיסת פיפטה.לאחר מכן, להעביר כיסוי להחליק עם תאים נגועים לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ולהרכיב את הצלחת על המיקרוסקופ ההפוך. יש לנקב את תא האמבטיה בתמיסת אמבטיה ולזהות תא המבטא תעלות מסומנות ANAP. הפעילו לחץ חיובי עדין על פיפטת טלאי והניחו את הפיפטה בתא אמבטיה.לחץ על פיפטה כנגד קרום התא והחל יניקה עדינה כדי להשיג אטם ג'יגה-אוהם. כדי להסיר את המדבקה, הרחיקו במהירות את מחזיק פיפטה מהתא המתוקן. קרבו את קצה פיפטת המדבקה לקצה מערכת הזילוח, ובדקו שהמדבקה נמצאת בתוך החריץ של מסיכת הספקטרומטר.לאחר מכן החל TNP ATP ואסוף ספקטרום תמונה. בתמונות אלה ניתן להבחין בשבר קרום טיפוסי ללא גג מתא HEK293T המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות בחלבון פלואורסצנטי כתום. בתמונה ספקטרלית זו של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בקרום לא מקורה מתא HEK293T שנחשף לחמישה מיקרו-טוחנים TNP ATP, ניתן לראות שני אזורים בעוצמה גבוהה המתאימים לשיא הפליטה של ANAP ו-TNP ATP.ניתן לקבל ספקטרום סופי על ידי חיסור ספקטרום הרקע הממוצע מהאזור הממוצע של ספקטרום העניין. כאן, ניתן לראות את הירידה בפלואורסצנטיות שיא ANAP לאחר חשיפות מרובות. שיא הפלואורסצנטיות ממספר חשיפות בהיעדר TNP ATP הותאם לדעיכה מעריכית אחת.נתונים אלה שימשו לאחר מכן לתיקון ממצאי פוטו-הלבנה. כאן מוצגות תמונות ספקטרליות מייצגות מקרום לא מקורה המתקבל מתא המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בהיעדר ונוכחות TNP ATP. התבוננות בספקטרום הפליטה המתוקן מגלה הפרדה ברורה בין הפליטה הפלואורסצנטית של התורם למקבל.באיור זה מוצגים זרמים מייצגים וספקטרום מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP מניסוי פלואורומטריה טיפוסי של מהדק טלאי. ספקטרום הפליטה מתוקן עבור רקע והלבנה כפי שהודגם עבור ממברנות ללא קירוי. היזהר עם פקדים כדי לוודא שהאות הפלואורסצנטי ספציפי לקולטן שלך.ודאו שהשפע שלכם מהיר, יעיל ושלם ושמרו על חשיפות קצרות ככל האפשר. שיטה זו עונה על שאלות לגבי תפוסת קולטנים וכיצד היא קשורה לתפקוד. טכניקות FRET אחרות המשמשות עם מערך דומה יכולות לחקור שינויים אישור הנגרמים על ידי ליגנד בקולטן.

measuring-nucleotide-binding-to-intact-functional-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

השיטה של ​​שימוש מצב מוצק nanopores לפקח על הלא ספציפית ספיחה של חלבונים על פני השטח אורגניים מתואר. השיטה משתמשת בעיקרון דופק-התנגדות, ומאפשר ספיחה להיות נחקר בזמן אמת והן ברמת מולקולה בודדת. בגלל תהליך ספיחה של חלבון יחיד רחוק שיווי משקל, אנו מציעים את העסקתם של מערכים מקבילים של nanopores סינתטי, מה שמאפשר לקביעת כמותית של קצב מסדר ראשון נראית לעין תגובה קבועה של חלבון ספיחה, כמו גם את לאנגמיור ספיחה מתמדת.

חלבון ניטור ספיחה עם מצב מוצק nanopores

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

למד מדידת קשירת ATP לקולטנים בזמן אמת באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים לחלבונים מסומנים בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת ניטור מדויק של אינטראקציות קולטן בתאי HEK293T.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

גלה סרטונים נוספים