מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת
11 במרץ 2021
פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.
מכיוון ש-ATP הוא שליח תאי חשוב, פיתחנו שיטה המאפשרת לנו למדוד את קשירת ה-ATP לקולטנים שלו בדיוק גבוה. באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית, אנו יכולים לעקוב אחר קשירת נוקלאוטידים לקולטנים פונקציונליים שלמים בזמן אמת וברזולוציה מרחבית מצוינת. אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את ההשפעות של חילוף החומרים התאי על תעלת האשלגן הרגישה ל-ATP, אשר מעורבת בצורות מסוימות של סוכרת.
כדי לערוך ניסוי בממברנה ללא גגות, השתמשו תחילה בזוג מלקחיים כדי לשבור שבר קטן מחליק כיסוי עם תאים נגועים ושטפו את המקטע עם PBS. אם החלקת הכיסוי מצופה מראש בפוליליזין, הניחו את השבר בתחתית צלחת 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר PBS והחזיקו סוניק בדיקה של שלושה מילימטרים שלושה עד חמישה מילימטרים מעל הדגימה, פועם בעוצמה של 50 וואט ומשרעת של 20% עד 40% למשך 200 עד 500 אלפיות השנייה כדי לפתוח את גג התאים. אם החלקות הכיסוי אינן מצופות מראש, לאחר שטיפה עם PBS, טבלו את השבר בצינור המכיל 0.1% פולי-L-ליזין למשך כ-30 שניות לפני שתפרקו את קירוי התאים עם סוניקציה קצרה כפי שהודגם בהדגמה.
מעבירים את השבר הסוני לצלחת זכוכית מכוסה תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ומרכיבים את הצלחת על מיקרוסקופ הפוך המצויד ביעד טבילה במים בעל מפתח נומרי גבוה פי 60. בדקו שיציאת המצלמה של המיקרוסקופ מחוברת לספקטרוגרף בסדרות עם מצלמת CCD בעלת רגישות גבוהה והשתמשו במשאבה פריסטלטית כדי לחורר את תא האמבטיה עם חיץ בקצב זרימה של 0.5 עד מיליליטר חיץ לדקה. כדי לזהות שברי קרום לא מקורים המבטאים את התעלה המסומנת ANAP, עיין בדגימה כדי לאתר ממברנות עם תעלות פלואורסצנטיות.
הפעילו חלקית את מסיכת הספקטרומטר בין יציאת המצלמה במיקרוסקופ לבין הספקטרוגרף. צל המסכה יופיע על תמונת המצלמה. לרכוש שדה בהיר תמונה פלואורסצנטית של הממברנה unroofed כדי לאפשר בחירה של האזור של עניין לניתוח.
קרבו את קצה מערכת הזילוח למיקרו-נפח לקרום הלא מקורה. כדי לקבל תמונה של פלואורסצנטיות ANAP, לעורר את הממברנה עם LED 385 ננומטר דרך מסנן עירור מעבר פס 390/18 ננומטר ודיכרואית קצה 416 ננומטר, איסוף האור הנפלט דרך מסנן פליטה 400 ננומטר ארוך. הפעילו את מסיכת הספקטרומטר וודאו שהאור הנפלט עובר דרכה.
יישר את אזור העניין עם החריץ של מסיכת הספקטרומטר. הפעילו את גרגרי הספקטרומטר. עם הגרגרים במקומם, האור המפוזר על ידי הספקטרומטר יוקרן על השבב של מצלמת CCD כדי להפיק תמונות ספקטרליות.
התמונות ישמרו מידע מרחבי בממד Y. ממד X יוחלף באורך גל. תוך כדי התעסקות עם תמיסת חיץ ללא נוקלאוטידים, קבל חשיפה אחת או יותר של 0.1 עד עשר שניות לתיקון במורד הזרם ולנורמליזציה של הנתונים שנאספו לאורך שאר הניסוי.
לאחר מכן, יש למרוח טווח של ריכוזי TNP ATP בתמיסת אמבטיה כדי לקבוע עקומת תגובת ריכוז, תוך ערבוב כל תמיסה למשך דקה אחת לפחות כדי להבטיח הגעה למצב יציב ולקבל חשיפה לכל ריכוז. לאחר כל ריכוז, שטפו את TNP ATP בתמיסת אמבטיה נטולת נוקלאוטידים למשך דקה אחת לפחות לפני קבלת תמונת חשיפה לאחר הטיפול. כדי לבצע ניסוי פלואורומטריה מהדק טלאי, תחילה משוך פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט עבים בעלי דופן להתנגדות של 1.5 עד 2.5 מגה-אוהם כאשר הם מלאים בתמיסת פיפטה.
לאחר מכן, להעביר כיסוי להחליק עם תאים נגועים לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ולהרכיב את הצלחת על המיקרוסקופ ההפוך. יש לנקב את תא האמבטיה בתמיסת אמבטיה ולזהות תא המבטא תעלות מסומנות ANAP. הפעילו לחץ חיובי עדין על פיפטת טלאי והניחו את הפיפטה בתא אמבטיה.
לחץ על פיפטה כנגד קרום התא והחל יניקה עדינה כדי להשיג אטם ג'יגה-אוהם. כדי להסיר את המדבקה, הרחיקו במהירות את מחזיק פיפטה מהתא המתוקן. קרבו את קצה פיפטת המדבקה לקצה מערכת הזילוח, ובדקו שהמדבקה נמצאת בתוך החריץ של מסיכת הספקטרומטר.
לאחר מכן החל TNP ATP ואסוף ספקטרום תמונה. בתמונות אלה ניתן להבחין בשבר קרום טיפוסי ללא גג מתא HEK293T המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות בחלבון פלואורסצנטי כתום. בתמונה ספקטרלית זו של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בקרום לא מקורה מתא HEK293T שנחשף לחמישה מיקרו-טוחנים TNP ATP, ניתן לראות שני אזורים בעוצמה גבוהה המתאימים לשיא הפליטה של ANAP ו-TNP ATP.
ניתן לקבל ספקטרום סופי על ידי חיסור ספקטרום הרקע הממוצע מהאזור הממוצע של ספקטרום העניין. כאן, ניתן לראות את הירידה בפלואורסצנטיות שיא ANAP לאחר חשיפות מרובות. שיא הפלואורסצנטיות ממספר חשיפות בהיעדר TNP ATP הותאם לדעיכה מעריכית אחת.
נתונים אלה שימשו לאחר מכן לתיקון ממצאי פוטו-הלבנה. כאן מוצגות תמונות ספקטרליות מייצגות מקרום לא מקורה המתקבל מתא המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בהיעדר ונוכחות TNP ATP. התבוננות בספקטרום הפליטה המתוקן מגלה הפרדה ברורה בין הפליטה הפלואורסצנטית של התורם למקבל.
באיור זה מוצגים זרמים מייצגים וספקטרום מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP מניסוי פלואורומטריה טיפוסי של מהדק טלאי. ספקטרום הפליטה מתוקן עבור רקע והלבנה כפי שהודגם עבור ממברנות ללא קירוי. היזהר עם פקדים כדי לוודא שהאות הפלואורסצנטי ספציפי לקולטן שלך.
ודאו שהשפע שלכם מהיר, יעיל ושלם ושמרו על חשיפות קצרות ככל האפשר. שיטה זו עונה על שאלות לגבי תפוסת קולטנים וכיצד היא קשורה לתפקוד. טכניקות FRET אחרות המשמשות עם מערך דומה יכולות לחקור שינויים אישור הנגרמים על ידי ליגנד בקולטן.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קישור של נוקלאוטיד אדנין לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. באמצעות העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים וחלבונים מסומנים בפלואורסצנטיות, חוקרים יכולים לפקח על קישור הנוקלאוטידים לקולטנים תפקודיים בדיוק גבוה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ביאופיזיקה
רקע
- ATP הוא שליח תאי חיוני המעורב במסלולי איתות שונים.
- הבנת קישור ה-ATP לקולטניו חיונית לחקר המטבוליזם התאי.
- תעלת האשלגן הרגישה ל-ATP מעורבת בצורות מסוימות של סוכרת.
- טכניקות מדידה בזמן אמת משפרות את ההבנה של דינמיקת הקולטנים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה למדידה בזמן אמת של קישור ATP לקולטנים.
- לחקור את ההשפעות של המטבוליזם התאי על תעלות האשלגן הרגישות ל-ATP.
- לספק פרוטוקול מפורט לביצוע ניסויים בסביבה תאית.
שיטות ששימשו
- מדידת FRET באמצעות נגזרות נוקלאוטיד של טריניטרופניל.
- גילוי חלקי קרום מתאים טרנספקטיים.
- שימוש במיקרוסקופיה בעלת צמצם מספרי גבוה לצורך הדמיה.
- פלוארומטריה של פאטץ'-קלמפ לניתוח פעילות הקולטן.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של דינמיקת קישור ATP בזמן אמת.
- זיהוי חלקי קרום שנחשפו המבטאים תעלות מסומנות בפלואורסצנטיות.
- ביסוס עקומות תגובת ריכוז עבור TNP ATP.
- הפרדה ברורה של פליטות פלואורסצנטיות של התורם והמקבל שנצפתה.
מסקנות
- השיטה שפותחה מאפשרת ניטור מדויק של אינטראקציות של קולטני ATP.
- הממצאים תורמים להבנת תפקידו של ATP במטבוליזם התאי.
- פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים על דינמיקה ופונקציה של קולטנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables real-time quantification of nucleotide binding to functional membrane proteins, providing mechanistic insights into ligand-dependent gating that can inform target validation for nucleotide-regulated receptors. By integrating binding measurements with functional readouts such as ion channel current, it supports de-risking of therapeutic hypotheses in discovery programs targeting metabolic and neurological disorders. The approach is adaptable to other receptors with suitable fluorescent ligands, offering a reusable platform for assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time occupancy of nucleotide-binding sites on intact, functional receptors to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables direct correlation of ligand binding with protein function via simultaneous current measurement in excised patches.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by resolving ligand-dependent gating dynamics of targets like KATP channels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative concentration-response curves using TNP ATP derivatives to establish binding affinity and potency.
- Reproducibility: Uses standardized unroofed membrane and patch-clamp fluorometry setups to minimize variability across experiments.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging and spectral analysis for multi-condition testing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to ATP-sensitive potassium channels implicated in certain forms of diabetes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges binding kinetics to functional outcomes, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic Insight: Reveals how nucleotide binding modulates channel activity, informing structure-function relationships in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing binding-function correlation data.
- Discovery Biology: Tests target engagement and pathway modulation by measuring nucleotide binding in native-like membrane environments.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible binding data suitable for hit confirmation and SAR development.
- Analytics: Produces corrected emission spectra and binding isotherms that enable comparison of ligand efficacy and potency.
- Translational Research: Links binding events to functional readouts in disease-relevant systems such as metabolically active cells.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other nucleotide-regulated proteins or receptors with compatible fluorescent ligands, supporting platform-level investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on ligand-receptor interactions, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes real-time binding measurements with spatial and temporal resolution in intact membranes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement with functional correlation.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on binding kinetics and functional impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular tagging with non-canonical amino acids like ANAP and FRET-based detection.
- Depends on instrumentation including spectrograph-equipped microscopes, high-sensitivity CCD cameras, and microvolume perfusion systems.
- Necessitates standardization of membrane preparation (unroofed or excised patches) and buffer conditions across teams.
- Adaptation to other systems requires identification of suitable fluorescent nucleotide derivatives and compatible protein tags.
- Potential limitations include photobleaching artifacts and the need for careful controls to ensure signal specificity, as noted in the data treatment section.
