ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות

זהו הפרוטוקול הראשון ליצירת ציסטות מרה, המספק ניתוח שיטתי המאפשר הערכה של היווצרות ציסטה, יעילות וגודל לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של היווצרות ציסטה אפיתל, ומאפשרת להעריך תהליך זה כפונקציה של סוג תאי אפיתל או הידרוג'ל. מכיוון שהאפשרויות הטיפוליות להפרעות מרה מוגבלות, פרוטוקול זה פותח את הדלת לתקנון מחקרי תרופות, זיהוי מטרות טיפוליות תקינות והבנת מנגנוני מחלה.

השיטה הפשוטה מאפשרת שאלות חשובות על המנגנונים של מידע חדש בתוך הנדסה ביולוגית של שדה מבנים צינוריים להיות מטופלים. לפני תחילת ניסוי, להפשיר פתרון הידרוג'ל מתאים בארבע מעלות צלזיוס וטיפים פיפטה מראש מגניב שקופית תא שמונה היטב במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, מניחים את הידרוג'ל ושמונה שקופיות תא היטב על קרח ולהוסיף את הנפח המתאים של הידרוג'ל כדי קר נורמלי חולדה cholangiocyte להשלים מדיום כדי להשיג 500 microliters של 40% פתרון הידרוג'ל.

לאחר מכן השתמשו בטיפים הקרים של פיפטה כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של פתרון הידרוג'ל למרכז כל באר של שקופית התא ולהשתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את הפתרון על פני השטח כולו של התחתית היטב באופן שווה ככל האפשר ללא בועות. כדי להכין את התאים לניסוי, בעוד הידרוג'ל הוא פילמור, לשטוף את התאים מ 70% תרבות cholangiocyte עכברוש נורמלי קונפלוסנט עם PBS מחומם מראש דגירה התאים עם חמישה מיליליטר של PBS מחומם מראש טרי במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, להחליף את PBS עם מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA מחומם מראש ולהחזיר את הבקבוק לחממה תרבות התא במשך חמש עד 10 דקות.

כאשר התאים התנתקו, לנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר של מראש מחומם נורמלי חולדה cholangiocyte מדיום ולהעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום מחומם מראש ולסנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר לספירה. כדי ליצור ציסטות, להוסיף את הנפח המתאים של הידרוג'ל קר להשלים חולדה נורמלית cholangiocyte בינוני כדי להשיג 1, 600 microliters של 80% הידרוג'ל פתרון על קרח לדלל את התאים חמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של קר להשלים ריכוז בינוני חולדה נורמלית ב 1, 600 microliters של מדיום.

מיד לערבב את התא ואת פתרונות תא הידרוג'ל ולהוסיף 400 microliters של תאים לכל באר של שקופית תא מצופה הידרוג'ל, דואג להימנע בועות. כדי להבטיח רכישה של תוצאות ניתנות לשחזור ומשמעותיות, הקפד לטפל בהידרוגל בזהירות ולערבב ביסודיות את פתרון המימן הראשוני לתאים כדי להשיג פתרון הומוגני. כאשר כל התאים כבר זרעו, למקם את השקופית באינקובטור תרבות התא.

לאחר יומיים בתרבות, להסיר 250 microliters של המדיום מפינה אחת של כל באר, דואג לא לשטוף את הידרוג'ל, ולאט לאט להחליף את supernatant מושלך עם 250 microliters של מדיום תרבות טרייה. להדמיית ציסטה, ביום המתאים לתרבות, בחר את המטרה 10 X במיקרוסקופ ניגוד פאזה המצויד בתוכנה לרכישת תמונה, הפעל את המנורה הלבנה ובחר באפשרות ההדמיה של שדה בהיר. בחר לשחק כדי להפעיל את המצלמה ולהתמקד בשדה של ציסטות.

הגדר את זמן החשיפה ופתח את חלון תיקיית הלכידה האוטומטית כדי לאפשר שמירה אוטומטית של התמונות. פתח את חלון סדרת Z ללכידה, אפס את מיקום ברירת המחדל ולהשתמש ב- Z-בורג כדי להגדיר את המישורים העליונים והתחתונים של מחסנית Z, התאמת שלב Z בהתאם למטרה ואת רמת הרזולוציה. לאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי להפעיל את הרכישה.

לאחר ההדמיה, פתח את מחסנית Z בפיג'י. כדי לשכפל את הערימה, לחץ על תמונה, כפול וערימה כפולה. ליצירת הקרנה בעצימות מינימלית מהערימה המשוכפלת, תחת תפריט תמונה, בחרו 'ערימות' ו'פרוייקט Z'.

בחר בעוצמה מינימלית עבור סוג ההקרנה ולחץ על אישור. כדי להחסיר את הרקע מההקרנה, תחת תפריט התהליך, בחר חיסור רקע ובחר 500 פיקסלים של רדיוס כדור מתגלגל ורקע בהיר כדי להפוך את הציסטות לניגודיות יותר מהרקע. כדי למדוד את קוטר הציסטה המשוער, הגדל את הציסטה הממוקדת, בחר בכלי הקו הישר ולחץ על לחצן T במקלדת.

צייר קו לאורך הקוטר של כל ציסטה בהקרנה הסופית. אזור העניין הבא שנוצר עבור כל ציסטה יתווסף לאזור מנהל העניין. לאחר ספירת כל הציסטות, לחץ על חלון מחסנית Z כדי לבחור אותו ולחץ על הצג הכל כדי לראות את הציסטות שנספרו.

הזז את הסמן לאורך מחסנית Z כדי לבדוק שכל הציסטות נספרו בכל תמונה, תוך הוספת ציסטות חדשות לאזור מנהל העניין לפי הצורך. לאחר ספירת כל הציסטות, בחר את אזור קבוצת העניין ולחץ על עוד ושמור כדי לשמור את הנתונים. כדי לקבוע את הגודל של כל ציסטה, כאשר אזורי העניין עדיין נבחרו, לחץ על מידה.

יופיע חלון המפרט כל ציסטה וגודלה המשוער. לאחר מכן שמור את הנתונים בתבנית CSV. כפי שהוכח, רישום מספר הציסטות והגדלים המתאימים להן לאורך זמן מאפשר ניתוח של האבולוציה של היווצרות ציסטה וצמיחה.

הכדאיות של אוכלוסיית התאים ההתחלתיים וציסטות ישנות של 10 ימים ניתן להעריך על ידי כתמים חיים / מתים. תאים מתים מייצגים פחות מ -3% מאוכלוסיית התאים ביום 10 והם ממוקמים בעיקר מחוץ לציסטה כתאים מבודדים או כחלק מצטברות קטנות, אם כי כמה הצטברות פסולת תאים נמקית נצפית בתוך כמה ציסטות גדולות. הדגירה עם ניקוד פלואורסין והוישט מאפשרת הערכה של היווצרות הפרשת פלואורסין מהבסל לחלל הזוהר האפי.

יש לציין, הפרשת פלואורסצין מעוכב על ידי טיפול מקדים עם מעכב עמידים לתרופות מרובות, המציין כי הצטברות פלואורסצין פלואורסצנטי בתוך לומן נובע הפרשה באמצעות טרנספורטר עמידים לתרופות מרובות ולא דליפה מהחלל הבין תאי. כתמים לביטוי E-cadherin מגלה כי cholangiocytes עכברוש נורמלי לשמור על פנוטיפ האפיתל שלהם הידרוג'ל לפחות 10 ימים. בעת הכנת הציסטות להערכת immunofluorescence, שמירה על אלבומין סרום בקר ב 0.1% או פחות במהלך הרוויה הוא המפתח לשמירה על שלמות ציסטה, כמו ריכוזים גבוהים יותר לגרום נסיגת ציסטה ולומן לקרוס.

הידרוג'ל לילה, הפשרה, קצה פיפטה והקלטת מגלשה קאמרית, עבודה על קרח והפצת תערובת הידרוג'ל תא הומוגנית באופן אחיד על מגלשת התא התרבותית הם קריטיים להצלחה ניסיונית. שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור ציסטות מתאים אפיתל אחרים או הידרוג'לים, המאפשר השוואות להבנה טובה יותר של קיטוב אפיתל. שיטה כמותית זו יכולה לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של תרופות או מוטציות גנטיות על תפקוד המרה ו organogenesis.