Name: חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: חקור הכנת חתכים רוחביים של גרעיני אורז Oryza sativa ללא פגיעה באנדוספרם, תוך שימוש בטיפי פיפטה כתמיכה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של גרגירי עמילן במיקרוסקופיה אלקטרונית לסריקה ולשיפור זני אורז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה למערכות למחקר (SFR Corp.) על השימוש במכשיר הפנומן ProX Desktop SEM שלהם, כמו גם על הסיוע הטכני המסופק על ידי מריה פילרינוס (מערכות למחקר (SFR) קורפ) ו Chloë van Oostende-Triplet (ביולוגיה של התא ומתקן הליבה לרכישת תמונה, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת אוטווה). המימון ניתן על ידי קרן החדשנות דלת הפחמן (LCIF) ממשרד הפיתוח הכלכלי של אונטריו, יצירת מקומות עבודה וסחר, וחלבונים קלים קורפ.

1. הכנת קטע אורז רוחבי
<ol><li>דל הקליפה יבשה, גרעינים שלמים כפי שמוצג באיור 1A.<ol>
<li>לשחרר את הקליפים ואת גרעיני האורז dehull על ידי טחינת הגרעינים בין שני פקקי גומי שטוחים. הסר את גרעיני האורז קליפה מן הפאניקה, במידת הצורך.</li>
		<li>הניחו גרעין אחד על פקק גומי שטוח על ספסל עבודה(איור 1B). ודא כי פקק זה נשאר נייח.</li>
		<li>השתמש פקק גומי שטוח שני (איור 1C) כדי לשחט את הקרנל על ידי פיתול אותו נגד פקק הגומי הראשון, באמצעות לחץ מספיק (איור 1D). הסר קליפות מהגרעין, דואג לא לנפץ את endosperm. הסר כל קליפה שנותרה באמצעות מלקחיים עדינים. גרעין נטול קליפה מוצג באיור 1E.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעזרת מלקחיים עדינים, הכנס גרעין קליפה בודד לתוך קצה פיפטה מפלסטיק (גודל 250 μL, זרע/קצה אחד)(איור 1F). ודאו שקצה העובר של הקרנל פונה לכיוון הקצה (החרוטי) של קצה הפיפטה(איור 1G). הערה: החדרת הליבה בדרך זו מבטיחה כי הקרנל יתאים בצורה נוחה ככל האפשר לתוך קצה pipette כמו הליבה צרה יותר לקראת הקצה הפרוקסימלי שלה.</li>
	<li>הכנס טיפ פיפטה שני של 250 μL כדי לכפות על הקרנל את קצה הפיפטה ולשמור על חוסר תנועה של הליבה במהלך החתך, תוך שמירה על כך שלא לפגוע בליבה או לכופף את קצה הפיפטה השני (איור 1H). הרכב ה'טלסקופ' הנכון מצוין באיור 1I.</li>
	<li>הניחו את מכלול הטיפים שטוח על ספסל עבודה והחזקו במקומם ביד(איור 1J). מצד שני, השתמשו בלהב אזמל חד (מס' 20) כדי לחתוך את מרכז הקרנל ולחתוך את קצה קצה הטיפה(איור 1K). בעזרת האזמל לחתוך חלקים בעובי 1 מ"מ של גרעין האורז(איור 1L). הערה: מקטע הקרנל סגור היטב בתוך אנולוס של פלסטיק(איור 1M). עובי מקטע ממוצע עבור שלושה גנוטיפים למופת נמצאים בטבלה 1. חלקים דקים משמעותית מ-1 מ"מ יתנפצו או יתפוררו. חשוב לציין מאיזה חלק של הקרנל כל חלק מקורו אם ניסוי זה מבוצע על מספר סוגים של אורז להשוואה, כמו מורפולוגיה עמילן משתנה לאורך אנדוספרם11.</li>
</ol>2. מיקרוסקופיה אור משתקף של מקטעי אורז רוחביים
<ol><li>השתמש במלקחיים עדינים כדי למקם את מקטעי האורז הרוחבים (שהוכנו בסעיף 1) על פיסת נייר שחורה של מד כבד.</li>
	<li>השג תמונות קלות של קטעים רוחביים של ניפונברה באמצעות סטריאומיקוסקופ עם עור ברווז רכוב להארה אלחונית, כפי שמוצג באיור 1N-S.</li>
	<li>שימו לב למורפולוגיה אנדוספרם תחת הגדלה של פי 10 לפחות. הערה: כל מקור אפילייט עדיף על מיקרוסקופיית שדה בהירה מכיוון שחלקים המתקבלים בטכניקה זו אינם דקים מספיק כדי שהאור יעבור דרכם.</li>
</ol>3. סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של מקטעי אורז רוחביים
<ol><li>מניחים את הדגימות על דיסק פחמן דבוק לספח אלומיניום ומניחים על מחזיק דגימת הפחתת טעינה. הסר את טבעת הפלסטיק מן הרכב קצה pipette באמצעות מלקחיים עדינים כדי למנוע את הפלסטיק מלהיכנס למנגנון ואקום של SEM. הערה: תמונות של תאי אנדוספרם, SGs ותת-כבידה מתקבלות באמצעות מחשב SEM שולחני שאינו דורש דגימות לציפוי מלוטש.</li>
	<li>השג את התמונות באמצעות גלאי אלקטרונים אחורי מרובה מצבים ברגישות גבוהה (BSE) ב- 10 kV.</li>
</ol>

<ol><li>James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+synthesis+in+the+cereal+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Starch synthesis in the cereal endosperm.</a> Current Opinion in Plant Biology. 6 (3), 215-222 (2003).</li>
<li>Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosperm+and+starch+granule+morphology+in+wild+cereal+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Genetic+Resources%22%5BJournal%5D)">Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives.</a> Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).</li>
<li>Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+physical%2C+and+chemical+properties+of+grain+and+flour+from+chalky+rice+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants.</a> Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).</li>
<li>Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+direct+observation+method+to+isolate+mutants+with+defects+in+starch+grain+morphology+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stable+QTLs+causing+chalk+in+rice+grains+in+nine+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).</li>
<li>Nagato, K., Ebata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+temperature+during+ripening+period+on+the+development+and+the+quality+of+rice+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels.</a> Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).</li>
<li>Zhao, X., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change%3A+implications+for+the+yield+of+edible+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Climate change: implications for the yield of edible rice.</a> PLoS One. 8 (6), 66218(2013).</li>
<li>Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+hydrostatic+pressure+and+microbial+transglutaminase+treatment+on+structure+and+gelation+properties+of+sweet+potato+protein%5BTitle%5D)+AND+%22LWT+-+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein.</a> LWT - Food Science and Technology. 115, 108436(2019).</li>
<li>Feiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puroindolines+co-localize+to+the+starch+granule+surface+and+increase+seed+bound+polar+lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content.</a> Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+preparing+the+whole+section+of+starchy+seed+to+investigate+the+morphology+and+distribution+of+starch+in+different+regions+of+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed.</a> Plant Methods. 14 (1), 16(2018).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+and+application+of+the+new+combination+of+hybrid+rice+%22Xieyou+7954%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+%28Agriculture+and+Life+Sciences%29%22%5BJournal%5D)">Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954".</a> Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).</li>
<li>Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+digestion+properties+of+rice+different+in+resistant+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Slow digestion properties of rice different in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+soluble+starch+synthase+SSIIIa+and+granule-bound+starch+synthase+Waxy+in+synthesizing+resistant+starch+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).</li>
<li>Yang, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+properties+of+mutant+rice+high+in+resistant+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Starch properties of mutant rice high in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, 523-528 (2006).</li>
<li>Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+methods+for+resistance+starch+content+of+Yi-Tang+rice+and+optimization+of+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment.</a> Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-transformed+rice+plants+expressing+synthetic+cryIA%28b%29+and+cryIA%28c%29+genes+are+highly+toxic+to+striped+stem+borer+and+yellow+stem+borer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+P-35S+and+T-nos+in+genetically+modified+organisms+by+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+a+lateral+flow+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip.</a> Food Control. 107, 106775(2020).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+with+a+synthetic+cry1Ab+gene+from+Bacillus+thuringiensis+were+highly+resistant+to+eight+lepidopteran+rice+pest+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species.</a> Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).</li>
<li>Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalky+and+translucent+rice+grains+differ+in+starch+composition+and+structure+and+cooking+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties.</a> Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+development+of+starch+granules+and+the+regulation+of+starch+biosynthesis+in+Brachypodium+distachyon%3A+comparison+with+common+wheat+and+Aegilops+peregrina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 198(2014).</li>
<li>Giroux, M. J., Morris, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+grain+hardness+results+from+highly+conserved+mutations+in+the+friabilin+components+puroindoline+a+and+b%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6262-6266 (1998).</li>
<li>Matsushima, R., Hisano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+amyloplasts+in+the+developing+endosperm+of+barley+and+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging amyloplasts in the developing endosperm of barley and rice.</a> Scientific Reports. 9, 3745(2019).</li>
<li>Matsushima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloplast-localized+SUBSTANDARD+STARCH+GRAIN4+protein+influences+the+size+of+starch+grains+in+rice+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm.</a> Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).</li>
<li>Monjardino, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+flange+and+reticulate+wall+ingrowths+in+maize+%28Zea+mays+L.%29+endosperm+transfer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Development of flange and reticulate wall ingrowths in maize (Zea mays L.) endosperm transfer cells.</a> Protoplasma. 250 (2), 495-503 (2013).</li>
<li>Tizro, P., Choi, C., Khanlou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for transmission electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 417-424 (2019).</li>
<li>International Rice Genebank. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.irri.org">www.irri.org</a> (2018).</li>
<li>Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chalkiness+on+cooking%2C+eating+and+nutritional+qualities+of+rice+in+two+indica+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Rice+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties.</a> Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).</li>
<li>Morita, S., Wada, H., Matsue, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countermeasures+for+heat+damage+in+rice+grain+quality+under+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Production+Science%22%5BJournal%5D)">Countermeasures for heat damage in rice grain quality under climate change.</a> Plant Production Science. 19 (1), 1-11 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הטכניקה המוצגת כאן מייצגת גישה מהירה, פשוטה וחדה לקראת הכנת חתך אורז רוחבי להדמיית SEM שולחנית. טכניקת חתך זו מאפשרת תצפית מהירה של מבנה אנדוספרם, צורת תא אנדוספרם, גודל ותבנית, גרגירים מורכבים ומורפולוגיה של עמילן. לצורך סינון פנוטיפינג אנדוספרם ונבטים, חיוני להשיג חתך שלם של גרעין האורז4,23,24. חשוב ביותר להכניס את הקרנל כולו בתוך קצה הפיפטה כדי למנוע את הלחץ של להב האזמל מלאלץ את האנוספרם להתפורר או להתנפץ. בתנאי שהרכבת 'הטלסקופ' בנויה כראוי, ניתן להכין דגימות להדמיה תוך 15 שניות(טבלה 2)תוך שימוש בחומרים שכבר נמצאים ביד בסביבת מעבדה טיפוסית. טכניקה זו חלה על חתך רוחב של כל זרע אליפסואידי כארבעה מילימטרים בקוטר בנקודה הרחבה ביותר שלה. זרעי דגם הדשא Brachypodium distachyon (איור S2A) ניתן לחלק באופן דומה אך אינם נשארים סגורים בתוך אנולוס. זרעים גדולים יותר, כמו חיטה, שבר בקלות ודורשים טיפול בעת חתך(איור S2B).
עם זאת, ישנן מספר מגבלות לטכניקה המוצגת כאן. חלקים שהושגו בטכניקה זו אינם דקים מספיק כדי שהאור יעבור דרכה אוסר על שימוש בטכניקה זו לגישות מיקרוסקופיות מבוססות אור משודר כמו שדה בהיר (עובי מדגם מרבי של 500 מיקרומטר עבור חלקי ליבת אורז25) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) (500 ננומטר עובי מדגם מרבי26 ). השימוש בקצה פיפטה כ'מטריצה ' של חתך מגביל גם את גודל הזרע שניתן לחלק באמצעות טכניקה זו. פתרון בעיות נוסף יידרש כדי להתאים טכניקה זו עבור מינים שונים מאוד מאורז, ואת הגודל של "מטריצה" מוגבל על ידי גודל טיפים pipette זמין לרכישה.
יתרון מובהק נוסף שטכניקה זו מספקת הוא איכות הדגימות שניתן להפיק מגרעיני אורז פנוטיפ גיר. ראוי לציין כי אפילו מחקר Matsushima הודה כי היה קשה להשיג חתך בשיטה מסוימת זו עבור פנוטיפיםגיר 4, כפי ששוכפל במחקר זה לצורך השוואה (איור 1S). במקרה שלהם, היה צורך לתקן כימית דגימות אורז גיר שלהם ולהטביע אותם שרף לחתך. הטכניקה החדשה, בשילוב עם הדמיית SEM שולחנית, מאפשרת לחוקר להכין בקלות חלקים רוחביים של גרעיני אורז למיקרוסקופיה עם עקביות רבה יותר מאשר ללא תמיכה בלי תנועה (טבלה 3).
בעידן החדש של פנומיקה ומטבולומיה, חשוב לפקח על קווים מוטגניים וספריות מתויגות טרנספוסון כדי להבין טוב יותר את הפונקציה והחשיבות של עמילן בזרעים. בנוסף, ג'נבנק רייס הבינלאומי מחזיק מעל 130,000 גישות אורז27. טכניקת פנוטיפינג זרעים מהירה כמו זו המוצגת כאן תזרז סיווג ודגימה לאיכות תזונתית28. לבסוף, טכניקה זו עשויה להיות שימושית לאור השפעות שינוי האקלים פולש. מתח עונתי בטמפרטורה גבוהה במהלך מילוי תבואה כבר זוהה כגורם העיקרי לגיר6, אבל מחקרים אחרונים סיבכו את עליית הטמפרטורות העולמיות בהגדלת הגיר של תשואות אורז7,29. פנוטיפינג אנדוספרם מזורז כזה עשוי לעזור לספק תמונה חקלאית רחבה של ההשפעה של עליית הטמפרטורות העולמיות.

גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמחים, במיוחד באנוספרם של משפחת פואצ'אי 1,2. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסווג גנוטיפים המבוססים על פנוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים. ניתן לדמיין SGs באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) על ידי חיתוך הקרנל וחטטנות קירות תא אנדוספרם2.
מטרת טכניקה זו היא להכין בקלות מקטעי גרעיני אורז רוחביים אך ורק לניתוח SEM המהיר. הפיתוח של טכניקה זו הונע על ידי הצורך בגישה מהירה של חתך מהיר לפיה דגימות מוכנות למיקרוסקופיית SEM מיד לפני הדמיה באמצעות ציוד מינימלי.
טכניקה זו כוללת החדרת גרעין האורז הקלוף לתוך קצה הפיפטה לשתק מוחלט. זה חשוב במיוחד בעת חתך פנוטיפים גרעיני אורז גיר, אשר פריך בקלות להתפורר תחת לחץ3. גיר הוא איכות לא רצויה באורז שכן היא משפיעה על המראה של הקרנל וגורמת לליבה להישבר בקלות במהלך ליטוש וכרסום3. גיר מציג כאזור אטום בחתך של הקרנל שניתן לראות בעין בלתי מזוינת; ברמה המיקרוסקופית, הגיר מאופיין בגרגרי עמילן קטנים ארוזים באופן רופף. גורמים לגיר יכול להיות גנטי4,5 או סביבתי6,7.
חתך זרעי דגנים הוכנו באופן מסורתי בשיטות תיקון כימיות וחתך בעקבות דגימה הטמעה שעוות פרפין או מטריצה מוצקה אחרת4,8,9,10. בשנת 2010, שיטת Matsushima הוצגה כדרך להימנע מהכנת מדגם גרעיני אורז מסובך וגוזל זמן4. שיטה זו כללה החדרת גרעין האורז הקלוף לקצה פיפטה קטוע. הקצה מוחזק נייח על ידי גוזם בלוקים, וחלקים דקים וחלקיים של אנדופרם נקצרים באמצעות סכין גילוח ידני. טכניקה מהירה נוספת שפותחה בשנת 2016 אפשרה חתך שלם דק של מגוון רחב של זרעים יבשים, כולל זניםגיר 10. שיטות אלה הניעה את התפתחות הטכניקה המהירה המוצגת כאן.
טכניקה חדשה זו מתאימה לחוקרים שרוצים להשיג חתך רוחבי שלם של גרעיני אורז עבור פנוטיפינג אנדוספרם וניתוח מורפולוגיה עמילן באמצעות SEM.
פרוטוקול זה מייצג התאמה של שיטת קצה פיפטה חתוכה Matsushima4, עם כמה שינויים בולטים: (1) גרעינים אינם imbibed בכל שלב של הטכניקה; (2) לא גוזם בלוק ולא ultramicrotome נדרשים להכין את המקטעים. סוג פראי 'שקוף' cultivar(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) וקו 'גיר' מוטגני של Nipponbare (ssg1, גרגר עמילן לא תקני1)4 נבדקו במחקר זה. שני הכתות האלה נבחרו לניתוח כאן כדי להדגים את ההבדלים הטכניים והוויזואליים בעיבוד מקטעי אורז שקופים וגיריים.

<table><tbody><tr><td>JMP 15</td><td>SAS</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>לשוניות פחמן דבק Leit 12 מ"מ (חבילה של 100)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3347N</td><td>N / A</td></tr><tr><td>Phenom Pro Desktop SEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHENOM-PRO</td><td>N/</td></tr><tr><td>A טיפים לפיפטה RC UNV 250 ומיקרו; L</td><td>Rainin</td><td>17001116</td><td>N/A</td></tr><tr><td>SEM PIN STUB &OSLASH; 12.7 קוטר עליון, סיכה סטנדרטית, אלומיניום</td><td>מיקרו עד ננו</td><td>10-002012-50</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon microdissecting קצות עדינים מלקחיים לאגודל, טיפים עדינים, 12.7 ס"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120019</td><td>N/A</td></tr><tr><td>להב אזמל שנדון מס' 20, סטרילי, 4.5 ס"מ</td><td>Thermo Scientific</td><td>28618256</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon ידית להב אזמל נירוסטה</td><td>Thermo Scientific</td><td>5334</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zeiss V20 Discovery סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

חתך רוחבי של אורז בוגר (oryza sativa l.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

גרגירי עמילן (SGs) מציגים מורפולוגיות שונות בהתאם למין הצמח, במיוחד באנוספרם של משפחת Poaceae. פנוטיפינג אנדוספרם יכול לשמש לסיווג גנוטיפים המבוססים על מורפוטיפ SG באמצעות סריקת ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (SEM). ניתן לדמיין SGs באמצעות SEM על ידי חיתוך דרך הליבה (pericarp, שכבות אלורון ואנוספרם) וחשיפת התוכן האורגני. השיטות הנוכחיות דורשות את ליבת האורז להיות מוטבעת בשרף פלסטיק ומדורקת באמצעות מיקרוטום או מוטבעת בקצה פיפטה קטועה ומקטעת ביד באמצעות סכין גילוח. השיטה הקודמת דורשת ציוד מיוחד והיא גוזלת זמן רב, בעוד האחרונה מציגה שורה חדשה של בעיות בהתאם לגנוטיפ אורז. זני אורז גיר, במיוחד, מהווים בעיה עבור סוג זה של חתך בשל האופי הפריך של רקמת האנוספרם שלהם. מוצג כאן טכניקה להכנת קטעי גרעיני אורז שקופים וגיריים למיקרוסקופיה, הדורשת רק טיפים פיפטה ולהב אזמל. הכנת החלקים בתוך גבולות טיפ פיפטה מונעת מאנדופרם גרעיני אורז להתנפץ (עבור פנוטיפים שקופים או 'זגועים') ולהתפורר (עבור פנוטיפים גיר). באמצעות טכניקה זו, דפוס תא אנדוספרם ואת המבנה של SGs שלם ניתן לראות.

חלקים מסוג פראי Nipponbare (איור 2A) ו- ssg1 (איור 2B) נבדקו תחת שלוש הגדלות: 260x, 920x ו- 4200x. טכניקה זו מאפשרת הכנת חלקים באיכות מספקת כדי להתבונן בתא האנוספרם כולו (איור 3A),גרגירי עמילן מורכבים (איור 3B)ותת-granules בודדים (איור 3C). גרעיני קליפה לוקח יותר זמן לעבד מאשר גרעינים מלוטשים כמו קליפות יבשות צריך להיות מוסר על ידי שחיקה לפני החתך. גרעיני גיר גם לקחת יותר זמן לעבד מאשר גרעינים שקופים מלוטשים, כמו יש לנקוט בזהירות לא לנפץ את הקרנל במהלך חתך. קטע אורז מוכן כראוי צריך להיות בעובי של כ-0.9 מ"מ(טבלה 1)עם מינימום עד ללא ניפוץ של האנדוספרם(איור 1N)ושכבות פריקארפ ואלורון שלמות(איור 1O). מיקום לא תקין של האזמל על קצה הפיפטה כאשר החתך יכול להוביל לחלקים 'סדוקים'(איור 1P). באופן דומה, תמונות שדה בהירות של מקטעים רוחביים אופטימליים של ssg1 (איור 1Q) הדגימו שכבות אנדוספרם, פריקרפ ואלורון שלמות וזמינות להדמיה (איור 1R). מקטע ליבה גירית שבור (איור 1S) עדיין עשוי להיות שמיש להדמיה אם המטרה היחידה היא לצפות ב- SGs, אך תבנית תא אנדוספרם לא תהיה גלויה. ייתכן שיהיה קשה לטפל בסעיף מנותק לצורך ניתוח. יותר גיזה של קירות תא אנדוספרם נצפתה בסוג פראי Nipponbare, כמו התאים ארוזים יותר חזק פחות פריך מאשר גרעיני ssg1. לא נצפתה גיזת תאי אנדוספרמה בחלקי ssg1 וגרגרי עמילן מורכבים ללא פגע.
איור S1 מדגים את אמינות התוצאות בטכניקת 'הטלסקופ' לקטע גרעיני אורז. קווי אורז שזוהו כמפיקי ליבה שקופים – סוג פראי עמילן עמיד (RS) קו היברידי Xieyou 7954 (Oryza sativa L. ssp. indica)12,13,14 ( איורS1A) ומוטנט שנוצר קובלט RS11113,15 ( איורS1B) יצרו קטעים שדרכם האור נראה באמצעות סטריאומיקוסקופ. תמונות SEM המתאימות חשפו כי קווים אלה מייצרים את פנוטיפ אנדוספרם האורז 'הרגיל': גרגירי עמילן רב-התדרלי ארוזים היטב. יצרני גרעין גיר, מגוון מסחרי Yi-Tang16 (איור S1C)ו RS413,מוטציה של RS11115 (איור S1D),הציגו קטעי ליבה לבנים ואטום. תמונות ה- SEM המתאימות הציגו מורפולוגיה שונה במידה ניכרת בהשוואה לקו הרקע של RS שקוף סוג הבר: גרגירי עמילן היו עגולים ונארזו באופן רופף. סוג פראי Xiushui 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) (איור S1E)והמוטציה שלו, KMD1 (Kemingdao1), המבטאים את הגן Cry1Ab לעיכוב טרפת חרקים17,18,19 ( איורS1F) הציגו קטעים ומורפוטיפים אנדוספרם הדומים לקווי ה- RS השקוף.
הטכניקה המוצגת כאן היא אופטימלית להכנת דגימות של גרעיני אורז מסוג גיר לניתוח פנוטיפי, אך גם מספקת יתרונות לפיצוח פנוטיפים של גרעיני אורז שקופים20: חיתוך הדגימות באמצעות לחץ מלמעלה מפחית את הסיכון לניפוץ האנדוספרם ונקע. ניתן להכין דוגמאות בקלות תוך שניות(טבלה 2). גנוטיפים מרובים נותחו באמצעות טכניקה זו כדי לבדוק את יעילותה (טבלה 3). כפי שמוצג באיור S2, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על זרעים של מינים אחרים. דגם מונוקוט Brachypodium distachyon מייצר זרעים קשים מאוד המכילים רק עמילן B-גרגר21, אשר חסר puroindoline A, חלבון המעניק רכות גרגרי עמילן22. עדיין ניתן היה להשיג מקטע רוחבי שלם(איור S2A). קבלת קטע רוחבי שלם מחיטה חורפית לבנה רכה (SWWW) הייתה מאתגרת אך ניתן לבצע אותה(איור S2B). זרעי SWWW עשירים בפורואינדולינה A וגדולים בהשוואה לזרעי B. distachyon וגרעיני אורז. זרעים אלה מתפוררים לעתים קרובות בעת חתך באמצעות הרכב הטלסקופ.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>גנוטיפ</td>
			<td>רוחב מקטע ממוצע (מיקרומטר) באמצעות הרכבה של טלסקופ</td>
			<td>רוחב מקטע ממוצע (מיקרומטר) חתך ביד חופשית</td>
		</tr>
<tr>
<td>ניפונברה (קליפה)</td>
			<td>971.7 ± 152.4ab
</td>
			<td>1059.571 ± 394.2ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td>שיו 7954</td>
			<td>825.1 ± 128.3b
</td>
			<td>1306.187 ± 179.1a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>910.6 ± 165.0ab
</td>
			<td>1126.694 ± 395.3ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">אמצעים ואחריו אותן אותיות אינם שונים באופן משמעותי ב- P &lt; 0.01 באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן טוקי (n = 10). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: עובי מקטע ליבה ממוצע.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>גנוטיפ</td>
			<td>זמן ממוצע (ים)*</td>
		</tr>
<tr>
<td>ניפונברה (קליפה)</td>
			<td>14.7 ± 1.36a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>שיו 7954</td>
			<td>9.81 ± 0.98b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>11.9 ± 1.28c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*באמצעות הרכב הטלסקופ.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">אמצעים ואחריו אותן אותיות אינם שונים באופן משמעותי ב- P &lt; 0.01 באמצעות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ומבחן טוקי (n = 10). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת JMP 15.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: זמן הכנה לדוגמה ממוצע.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>גנוטיפ</td>
			<td>רקע</td>
			<td>איכות</td>
		</tr>
<tr>
<td>ניפונברה</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>שקוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>
גרגר עמילן לא תקני1 (ssg1)</td>
			<td>ניפונברה</td>
			<td>צ'וקי</td>
		</tr>
<tr>
<td>עמילן עמיד (RS) Xieyou 7954</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>שקוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS111</td>
			<td>שיו 7954</td>
			<td>שקוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>RS111</td>
			<td>צ'וקי</td>
		</tr>
<tr>
<td>יי-טאנג, 'חיים חדשים', מותג לוג'ורן</td>
			<td>שיו 7954</td>
			<td>צ'וקי</td>
		</tr>
<tr>
<td>שיושי 11</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>שקוף</td>
		</tr>
<tr>
<td>קמינגדאו1 (KMD1)</td>
			<td>שיושי 11</td>
			<td>שקוף</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: גנוטיפי אורז שנבדקו במחקר זה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig01.jpg"> איור 1: הכנת מקטעי אורז רוחביים. (A)גרעין ניפונברה מסוג פראי עם קליפה שלמה. (B). הקרנל מונח על פקק גומי שטוח בקוטר 4 אינץ '. (ג)קליפות הוסרו על ידי שחיקת הקרנל בין שני פקקי גומי מעוררי תיאבון. (ד)קליפה הופרדו מגרעין האורז. (ה)תקריב של גרעיני אורז קליפה. קצה העובר מצוין. (ו)החדרת ליבה לטיפ פיפטה באמצעות מלקחיים עדינים. (G)הקרנל נתקע בקצה הדיסטלי של קצה הפיפטה. (H)החדרת קצה הפיפטה השני כדי לשתק את הקרנל לחתך (הרכבה 'טלסקופית'). (אני)גרעין האורז הותקן בצורה נוחה בקצה הדיסטלי של קצה הפיפטה. (J)חתך של גרעין האורז בתוך המכלול. (K)תקריב של קטע לחתוך. (L)חלק מהגרעין מוקף אנולוס הפלסטיק. (M)תקריב של החלק הרוחב. (N)קטע רוחבי מסוג פראי ניפונברה. (O)תקריב של האנוספרם בתוך קטע ניפונברה מסוג הפראי. (P)חלק מסכן, תת-אופטימלי של גרעין ניפונברה מסוג פראי. (Q)קטע רוחבי של מוטציה ניפונברה ssg14. (R)תקריב של אנדוספרם בתוך מקטע ssg1. (S)חלק מסכן, תת-אופטימלי של ssg1. בר (לוחות A, N-S) = 1 מ"מ. גרעין אורז מלא וחלקים צולמו באמצעות סטריאומיקוסקופ עם מצלמת זום דיגיטלית ואורות עור ברווז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig02.jpg"> איור 2: תמונות SEM של מקטעי ליבה רוחביים. (א)ניפונברה מסוג פראי, כת שקופה. גרגירי העמילן המורכבים התחזקו בחוזקה זה לזה; (B)מוטציה ניפונברה ssg14,פנוטיפ גיר. גרגירי העמילן המורכבים היו ארוזים באופן רופף וחסרים את האופי המצחיני של מורפוטיפ עמילן מסוג בר ניפונברה. הגדלה משמאל לימין: 260x, 920x ו- 4200x. אורך הסרגל מצוין בחלוניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig03.jpg"> איור 3: אנטומיה מיקרוסקופית SEM של מקטע ליבה רוחבי של Xiushui 11. (A)תא אנדוספרם יחיד מסומן באדום. הגדלה פי 260. (B)גרגר עמילן מורכב מתואר באדום. הגדלה פי 920. (C)תת-granules עמילן מרובים מסומנים באדום. הגדלה פי 2250. אורכי פס מסומנים בחלוניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור S1: קטעים רוחביים של גנוטיפי אורז אחרים שהוכנו עבור SEM בטכניקה זו. (A)עמילן עמיד (RS) Xieyou 795412. (B)RS111, מוטציה שקופה ברמה גבוהה של 795413. (C) RS4, מוטציה גירית של RS11115. (D)יי-טאנג, מגוון מסחרי של אורז עמילוז גבוה16. (ה)שיושי 11. (ו) KMD1 (קמינגדאו1)17,18,19. הגדלה פי 10 לתמונות שדה בהירות. פס לבן = הגדלה של 1 מ"מ. 2250x עבור תמונות SEM. אורכי פס מסומנים בחלוניות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
איור S2: טכניקה שימושית לזרעים אחרים. (א)קטע רוחבי של ברום סגול כוזב (ברכיפודיום דיסטכיון ל. גישה Bd21) זרע. (ב)קטע רוחבי של חיטה חורפית לבנה רכה (טריטיקום אסטיבום ל. ג. אוגוסטה) זרעים. שדה בהיר, הגדלה פי 20. בר = 1 מ"מ. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig02.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

פרוטוקול זה מאפשר לחתוך זרעים ללא פגע כדי שלא יתפוררו, ומאפשר הדמיה של גרגירי עמילן בכל זרע שיכול להתאים לקצה פיפטה. חרוט הפלסטיק הנגוע תומך במבנה המקורי של הרקמות והאיברים היבשים, כך שסעפת זולה וקלה זו מאפשרת לעבד דגימות רבות תוך זמן קצר. כדי להמשיך מהיתרון המיקרוסקופי המשפטי כאן, עמילן עמיד, משהו שכולנו מחפשים, נגישות של אנזימים לעמילן הגולמין, האמילוליזה, האינדקס הגליקמי, וקוצים גלוקוז, אלה הם פרמטרים מרכזיים לגידול זני אורז טובים יותר להילחם בסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם כיום.ועכשיו זה תענוג גדול להציג בפניכם את ד"ר קיה ברטון. ד"ר ברטון היא מהמעבדה שלנו והיא תשתמש במתקן הדמיית הליבה של הפקולטה כדי להראות לך איך טכניקה זו נפרסת. התחל על ידי דה-husking הגרעינים היבשים.מניחים גרעין יחיד על פקק גומי שטוח על ספסל עבודה, וודאו כי פקק זה נשאר נייח. השתמש פקק גומי שטוח שני כדי לשחט את הקרנל על ידי פיתול אותו נגד פקק הגומי הראשון, ולאחר מכן להסיר קליפות מן הקרנל, דואג לא לנפץ את endosperm ולא לטחון את הזרעים באגרסיביות רבה מדי בין שני bungs גומי. הסר את כל הקליפים הנותרים באמצעות מלקחיים עדינים ולהכניס גרעין קליפה בודדים לתוך קצה פיפטה 250 מיקרוליטר פלסטיק.ודא כי קצה העובר של הקרנל פונה לכיוון הקצה החרוט של קצה הפיפטה. הכנס טיפ פיפטה 250 מיקרוליטר שני כדי לכפות על הקרנל את קצה הפיפטה הראשון ולשמור על חוסר תנועה של הליבה במהלך החתך, תוך שמירה על כך שלא לפגוע בליבה או לכופף את קצה הפיפטה השני. מניחים את הרכבת קצה הפיפטה שטוחה על שולחן עבודה ומחזיקים אותה במקומה ביד.עם היד השנייה, להשתמש להב אזמל חד לפרוס דרך מרכז הליבה, חיתוך את הקצה של קצה פיפטה. פרוס כלפי מטה דרך ההרכבה ולאחר מכן כוון את להב האזמל אנכית כך ששני הפרצופים החשופים החדשים של קטע היד מקבילים. לאחר מכן להשתמש באזמל כדי לחתוך חלקים עבים מילימטר אחד של גרעין האורז.כדי לבצע מיקרוסקופיה קלה משתקפת, מניחים את מקטעי האורז הרוחביים על פיסת נייר שחור מד כבד. השג תמונות קלות של המקטעים הרוחביים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם עור ברווז רכוב לתאורה עקשנית, תוך שימוש בהגדלה של לפחות פי 10. מקטעי ניפונברה ו-ssg1 מסוג פראי נבדקו תחת 260 פעמים, 920 פעמים ופי 4,200.כאשר מוכן כראוי, קטעי האורז היו בעובי של כ -0.9 מילימטרים עם ניפוץ מינימלי של האנוספרם ושכבות pericarp ואלורון שלמות. טכניקה זו מאפשרת הכנת חלקים באיכות מספקת כדי לצפות בתא האנוספרם כולו, גרגירי עמילן מורכבים, ותת-גרגירים בודדים. יצרני גרעין שקופים, כגון הקו ההיברידי עמילן עמיד מסוג בר, Zhehui 7954 וקובלט שנוצר מוטציה RS111, מיוצרים גרגירי עמילן פוליהדרלי ארוז היטב, שהוא פנוטיפ אנדוספרם האורז הרגיל.תמונות ה- SEM של יצרני גרעין גיר, המגוון המסחרי Ye Tang ו- RS4, הציגו גרגירי עמילן שהיו עגולים ונארזים באופן רופף. ל-Xiushiu 11 ולמוטציה שלו KMD1, שבאה לידי ביטוי בגן Cry1Ab כדי לעכב את טרפת החרקים, היו קטעים ומורפוטיפים אנדוספרמים הדומים לקווי העמילן העמידים בשקוף. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על זרעים של מינים אחרים.המונוקוט של הדגם, ברכיפודיום דיסטכיון, מייצר זרעים קשים מאוד, אך עדיין ניתן היה להשיג קטע רוחבי שלם. חלקים רוחביים שלמים הופקו גם מחיטה רכה ולבנה בחורף. שיטת סינון מהירה וזולה זו להסתכל בתוך מבנים ביולוגיים יכולה להיות מיושמת על רגלי חרקים, קוצים של עצי לוקוס, עוזררים, קוצי דגים, או כל תחום של מיקרוסקופיה משפטית שיכול להרוויח ממערך תמיכה מדגם זה.לאחר ביצוע פרוטוקול זה, ציפוי sputter עבור אלקטרומיקרומיקרוסקופיה, כתמים עם צבעים פלואורסצנטיים ספציפיים, ויישום של calcafluor להכתים עבור עובי דופן תא בטא גלוקן בקווי שיבולת שועל שעורה מוטנטיים הם כמה דרכים מהירות להתקרב לגידול צמחים עם הקרנת פנוטיפ מהירה.

transverse-sectioning-mature-rice-oryza-sativa-l-kernels-for-scanning

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך רקמות פשוטה של חיתוך היברידי שימושית עבור רקמות צמחים סרבניות. קטעי רקמה באיכות טובה מאפשרים מחקרים אנטומיים ומחקרים ביולוגיים אחרים כולל הכלאה באתרה (ISH).

-Cut ההיברידי: שיטת חתך משופרת עבור דוגמאות רקמות צמח סרבן

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

טכניקה זו מאפשרת הכנה מהירה ופשוטה של סעיף שרין בגודל זרע כולו לתצפית וניתוח של תאים, גרגרי ענבן, וגופים חלבון באזורים שונים של הזרע.

שיטת מקטע יבש פשוטה לקבלת מקטע שרב בגודל זרע שלם ויישומיו

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקת ניקוי של יורה אורז, שקשה להכין לתצפיות מבניות פנימיות בגלל האופי הקשה, העבה או השכבתי של הרקמות. שיטה זו מאפשרת תצפיות פלואורסצנטיות מתמשכות ועמוקות, אפילו בצמחי אורז בוגרים.

תצפית פלואורסצנטית עמוקה בצילומי אורז באמצעות טכנולוגיית סליקה

זהו פרוטוקול פשוט של בדיקת נדן עלי שעורה באמצעות ריאגנטים מינימליים וציוד מעבדה נפוץ (כולל טלפון חכם בסיסי). המטרה היא לדמיין את תהליך ההדבקה המוקדם של מחלת הפיצוץ במעבדות ללא גישה לציוד מיקרוסקופיה מתקדם.

הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם

חקור הכנת חתכים רוחביים של גרעיני אורז Oryza sativa ללא פגיעה באנדוספרם, תוך שימוש בטיפי פיפטה כתמיכה. שיטה זו מאפשרת הדמיה של גרגירי עמילן במיקרוסקופיה אלקטרונית לסריקה ולשיפור זני אורז.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

גלה סרטונים נוספים