העברת in vitro ו- in vivo של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה שנבנתה בהתאמה אישית
2 ביולי 2020
פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיות הדרושות להעברה מדויקת של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה וניטור מתוחכמת.
שיטה זו משמעותית מכיוון שהיא מספקת את הדרך החזקה והניתנת לשחזור לספק טיפול בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים במודלים פרה-קליניים. טכניקה זו מאפשרת אספקה מדויקת ועקבית של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים על ידי ניטור ובקרה מדויקים של הסביבה המקומית, הפיזיולוגיה של בעלי החיים והמינון התרמי. כאשר מנסים פרוטוקול זה, זכור שחימום ננו-חלקיקים חייב להישאר מוגבל לרקמת המטרה.
חיוני להשתמש בתרמומטריה בשפע ומתאימה כדי להבטיח שחזור ובטיחות. 24 שעות לאחר הציפוי, תאי מלנומה של עכברים B16 F10 מוסיפים ננו-חלקיקים מגנטיים לריכוז סופי של שלושה מיליגרם יון למיליליטר. ודא שהננו-חלקיקים מפוזרים באופן שווה בכל הבאר על ידי יצירת תמיסת מלאי של מדיה וננו-חלקיקים מגנטיים מראש.
48 שעות לאחר הוספת הננו-חלקיקים, הוסף 0.5 מיליליטר טריפסין לכל באר מטופלת וסובב בעדינות את הצלחת. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שהתאים מנותקים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיה לכל באר ואסוף את כל התאים לצינורות של 1.5 מיליליטר באמצעות צינור נפרד מסומן בבירור לכל באר.
סובב את הצינורות ב-60G למשך שתיים-שלוש דקות כדי לגלול את התאים. לאחר מכן הנח צינורות במרווח המלא במים בתוך הסליל. הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים כדי לשמור על המדיה ומשטח התא על 37 מעלות צלזיוס.
הגדר בדיקות טמפרטורת סיבים אופטיים נפרדות כדי לפקח על הטמפרטורה בתוך הצינור ואמבט המים. הפעל את הצ'ילר ובדוק שנוזל הקירור זורם דרך הסליל. לאחר מכן הפעל את מקור הכוח והתאם את אחוז המקסימום לשדה הרצוי.
הפעל את סליל הסולנואיד בן 14 הסיבובים המופעל על ידי גנרטור של 10 קילוואט ב-165 קילו-הרץ ו-23.87 קילו-אמפר למטר. טפל בתאים עד להגעה למינון תרמי שנקבע בעבר. לאחר הטיפול, השעו מחדש את התאים הגלולים במדיה בתוך הצינורות וציפו אותם מחדש לצלחות חדשות עם שש בארות מסומנות בבירור.
לאחר הרדמת העכבר, יש לנקות את הגידול בעזרת מגבון אלכוהול. להזריק את הננו-חלקיקים המגנטיים לגידול שלוש שעות לפני הטיפול ב-AMF. לאחר שלוש שעות יש להרדים שוב את העכבר ולבדוק אם אין תגובה לרפלקסים הנכונים.
הסר את תג האוזן או כל חפץ מתכת אחר על העכבר והנח בעדינות בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים משומנים לתוך פי הטבעת שלו. הכנס את הקטטר לתוך הגידול. הסר את המחט.
לאחר מכן חתוך את הקטטר כך שלא יבלוט מהגידול יותר מדי. הכנס לקטטר בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים עם שלושה חיישנים, שתגן על החיישנים. הדביקו את פי הטבעת והבדיקה התוך-גידולית לזנב החיה.
הנח את העכבר בצינור של 50 מיליליטר שאמור להיות חור ליד הראש שבו ניתן לחבר את ההרדמה ולהעביר אותה. הנח את הצינור בתוך מערך הסליל וחבר מחדש את ההרדמה. הנח בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים באופן רופף לתוך הצינור כדי למדוד את טמפרטורת הסביבה.
לאחר מכן הפעל את הצ'ילר וודא שנוזל הקירור מופץ. ודא שתוכנת המחשב מציגה את הטמפרטורות השונות והתחל להקליט כדי לאפשר הצגת חישוב CEM43 בזמן אמת היכן שהמינון הנדרש של CEM43 היה צריך להיקבע בעבר. הפעל את המגנט באחוז הספק נמוך וודא שבדיקות טמפרטורת הסיבים האופטיים רושמות שינויי טמפרטורה.
בקיצור, שטמפרטורת הליבה של החיה נשארת על 38 מעלות צלזיוס, ומווסתת אותה עם מעיל האוויר הממוזג. התאם את עוצמת השדה המגנטי על ידי שינוי הכוח השולט ברמת הטמפרטורה בגידול. כבה את ה-AMF לאחר השגת המינון הרצוי.
הסר את הצינור מהסליל והסר את העכבר מהצינור. לאחר מכן, כבה את הצ'ילר. חלץ את הבדיקות והצנתרים ובמידת הצורך, תייג את החיה עם תג אוזן מתכת חדש.
עקוב אחר העכבר במהלך ההתאוששות מההרדמה, וודא שהוא חוזר להתנהגות רגילה ושאין סיבוכים. עבור היפותרמיה in vivo, חיוני להציב כמה שיותר בדיקות טמפרטורת סיבים אופטיים באתרים אסטרטגיים לצורך הערכת יעילות ובטיחות בזמן אמת. בדיקות אלה מאפשרות לתעד טמפרטורה לאורך כל הניסוי, מה שמאפשר דוזימטריה מדויקת והיסטוריה תרמית.
עקומות שנוצרו במהלך ניסוי in vivo מוצגות כאן, המדגישות את היכולת לנטר מקרוב את הטמפרטורה ולהתאים את המערכת כדי לשמור על טמפרטורות הגידול בטווח הרצוי. עלילות הר הגעש מציגות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי בעקבות טיפול בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים במבחנה וב-vivo, ומדגימים כיצד ניתן להשתמש בטכניקות מולקולריות כדי לנטר את השפעות ההיפרתרמיה. ניטור מדויק של טמפרטורות הגידול, טמפרטורת הליבה של בעלי החיים והמינון התרמי נחוצים למתן טיפול עקבי.
בעקבות היפרתרמיה, ניתן לבצע ניתוחים שונים כדי להבין את ההשפעה והמנגנון של הטיפול. וניתן ליישם טיפולים אחרים להשפעה טיפולית גדולה יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג את הטכניקות והמתודולוגיה הדרושות להגשה מדויקת של היפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים, תוך שימוש במערכת הובלה וניטור מתקדמת. שיטה זו היא משמעותית מכיוון שהיא מספקת את הדרך העמידה והניתנת לשחזור ביותר להגשת טיפול בהיפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים במודלים פרה-קליניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוטכנולוגיה
- תרפיה תרמית
רקע
- הגשה מדויקת ועקבית של היפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים.
- ניטור ובקרה מדויקים של הסביבה המקומית והפיזיולוגיה של בעל החיים.
- חשיבותה של התרמומטריה לשם הדירות ובטיחות.
- יישום במודלים פרה-קליניים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להחלת היפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים.
- הבטחת בטיחות ושחזוריות בטיפול.
- הגבלת החימום לרקמת המטרה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ננוחלקיקים מגנטיים בריכוז של שלושה מיליגרם יון למילליליטר.
- פיזור אחיד של ננוחלקיקים בבארות של תרבית תאים.
- שימוש בתמיסת מלאי של מצע וננוחלקיקים.
- ניטור המינון התרמי במהלך הטיפול.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של היפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים.
- חימום עקבי המוגבל לרקמות המטרה.
- שחזוריות של התוצאות בין ניסויים שונים.
- ניטור יעיל של הסביבה המקומית ושל פיזיולוגיית בעל החיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע שיטה חסונה להיפרתרמיה באמצעות ננו-חלקיקים.
- מבטיח בטיחות ויעילות ביישומים פרה-קליניים.
- מדגיש את חשיבותה של התרמומטריה בטיפול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
היפרתרמיה באמצעות ננוחלקיקים מגנטיים (mNPH) מאפשרת מינון תרמי מדויק במודלים של אונקולוגיה פרה-קלינית, ותומכת בתיקוף מטרות באמצעות אבלציה מבוקרת של גידולים והשפעות אימונו-מודולטוריות סוב-לסאלות. ניטור הטמפרטורה של המערכת בזמן אמת במספר נקודות, יחד עם דוסימטריה המבוססת על CEM43, מספקים פלטים כמותיים וניתנים לשחזור, שהם קריטיים להפחתת סיכונים מנגנוניים ולביטחון תחזיתי בחלונות טיפוליים. יכולת זו מגשרת בין ממצאים in vitro ליעילות in vivo, ומסייעת בקבלת החלטות go/no-go בקווי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הזרקת מנות תרמיות מוגדרות למודולציה של הסביבה המיקרונית של הגידול ותגובות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מגביל את החימום לרקמת המטרה באמצעות תרמומטריה של סיב אופטי, ובכך מפחית השפעות חוץ-מטרה ומשפר את הספציפיות של הבדיקה.
- ערך ניבוי: מכמת השפעות ביולוגיות על פני מדרגות של טמפרטורה-זמן, ובכך תומך במידול של תגובה למנה לצורך תיעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף (למשל, תאי מלנומה B16 F10) עם ספיגה סטנדרטית של ננו-חלקיקים להשגת תגובת היפרתרמיה עקבית.
- ערך תפעולי: שימוש בתמיסות מלאי ובפרוטוקולי פיזור אחיד להבטחת הדירות בין בארות ופלטות.
- מוכנות לבדיקה: יצירת נתוני מינון תרמי נפחתיים (CEM43) התואמים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) ולניתוחים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במעבר חלק מתרביות תאים in vitro למודלים של גידולים in vivo באמצעות שימוש בניסוחי ננו-חלקיקים וניטור זהים.
- רלוונטיות למחלה: ישיים למודלים של מלנומה בעכברים, ומאפשר הערכה של שינויים בביטוי גנים המושרים על ידי היפרתרמיה (למשל, volcano plots) כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים.
- קידום מותאם סיכונים: מעקב בזמן אמת אחר המינון התרמי מאפשר העלאה מבוקרת של המינון מבחינה בטיחותית והפחתת סיכונים מכניסטיים לפני מחקרים של טיפול משולב.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
ממצב את mNPH כטכנולוגיה מאפשרת בין שלב תיקוף המטרה (target validation) לבין אופטימיזציה של מובילים (lead optimization), כאשר דיוק במינון התרמי מנחה סריקה פנוטיפית ומחקרי מנגנון פעולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור עקה תרמית לביטוי גנים דיפרנציאלי ולוויסות חיסוני.
- סינון: מספקת פלטי תרמיים כמותיים וניתנים לשחזור (למשל, CEM43) להשוואת פורמולציות של ננו-חלקיקים ופרמטרים של שדה.
- אנליטיקה: מספקת עקומות טמפרטורה בזמן אמת ופרופילים מולקולריים לאחר טיפול (למשל, volcano plots) לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: שומרת על עקביות במינוח ננו-חלקיקים ובניטור, מתאים לתאים ועד לבעלי חיים, ובכך תומכת ברצף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב המערכת מאפשר המרה מהירה בין הגדרות ex vivo, in vitro ו-in vivo, ובכך ממקסם את ניצול הפלטפורמה בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתאם מינונים תרמיים מדויקים לתוצאות מולקולריות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מתן היפרתרמיה באמצעות סלילי סולנואיד מכויילים, צ'ילרים וגששים אופטיים בנקודות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הגדרת חלונות תרמיים יעילים המאזנים בין יעילות לבטיחות הרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לננו-תרפיה בהתבסס על פרופילים הדירות של אבלציה תרמית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהכנת ננו-חלקיקים, דוסימטריה תרמית וטיפול בבעלי חיים עבור פרוצדורות in vivo.
- נדרש מיכשור ייעודי הכולל גנרטורים של 10 kW, סלילי סולנואיד בעלי 14 ליפופים, צ'ילרים וניטור טמפרטורה רב-נקודתי באמצעות סיב אופטי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוז הננו-חלקיקים (3 mg ion/mL), פרוטוקולי חלוקה ושיטות חישוב CEM43.
- כולל שיקולי התאמה עבור מודלים שונים של גידולים, מבני ננו-חלקיקים ופרמטרי שדה (165 kHz, 23.87 kA/m).
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בטרמומטריה נרחבת למניעת חימום מחוץ למטרה ולהבטחת ויסות טמפרטורת הליבה של בעל החיים.
