Name: ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למד את שיטת Conpokal לדימות תאים חיים באמצעות שילוב מיקרוסקופיית קונפוקל וכוח אטומי. שיטה זו מאפשרת אפיון מכאני ופלואורסצנטי בו-זמני של תאי מוח ומדגימה יחסי מבנה-תפקוד בביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים במימון NIH COBRE תחת מספר P20GM130456. אנו מודים לליבת המיקרוסקופיה הקלה בבריטניה, הנתמכת על ידי סגן הנשיא למחקר, על הסיוע בעבודה זו. זנים של S. mutans ו E. faecalis סופקו על ידי ד"ר נטליה Korotkova. האזכור הראשון של המחזה על מילים, Conpokal, כדי לתאר את השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקאלית מיקרוסקופיה כוח אטומי מיוחס ד"ר בראד ברון, כימיה וחומרים הנדסה, באוניברסיטת קנטאקי, בדיון עם ד"ר מרתה גריידי (המחבר המקביל) לקראת הגעתו של דובר סמינר ד"ר ג'ונתן פאם, שהצטרף הפקולטה להנדסת כימיקלים וחומרים באוניברסיטת קנטאקי

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כלי הערכה מכניים מיקרו או בקנה מידה ננו משמשים לעתים קרובות כדי לחשוף את מאפייני הדפורמציה ברמת התא הבודד או מיקרואורגניזם, בעוד כלי מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה נפרדים משמשים כדי לדמיין תהליכים תת-תאיים ותכונות מבניות. Conpokal, הוא השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקאלית סריקת לייזר מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM) לתוך פלטפורמה אינסטרומנטלית אחת. טכניקת קונפוקל יושמה לראשונה במערכת פולימרים לא ביולוגית, שם המטרה הייתה לקבוע את ההידבקות, הגמישות ומתח פני השטח של משטחים קשים במגע עם משטחים רכים. תמונות קונפוקל סיפקו עיבוד חזותי של האופן שבו הפולימר מעוות, דבק ומשחרר מהגשושהקשה 1,2. מפולימרים לדגימות ביולוגיות, טכניקה זו מספקת את ההזדמנות כמעט בו זמנית תא חי או מיקרואורגניזם הדמיה קונפוקל ו AFM.
שינויים בגמישות התאים היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות אנושיות רבות3 כולל הפרעות בכלי הדם4מלריה5,6אנמיה חרמשית,7דלקת פרקים, דלקת פרקים,8אסטמה9וסרטן,6,10,11,12,13,14,15. טכניקות נפוצות למדידת המכניקה של תאים כוללות שימוש חרוזים מגנטיים16,17פינצטה אופטית,18,19שאיפת מיקרופיגט,8,20,21,22ו- AFM11,23,24,25,26. מאז היישום של AFM לתאים חיים, זה הותאם בקלות כדי לאפיין טופוגרפיה של התא27,28 כמו גם תכונות מכניות11,24,29,30,31 בדיוק ננומטרי. AFM הותאם עוד יותר למיקרו-ארכיאולוגיה32,33אפנון תדרים,34,35וזחל25,36,37 ניסויים לחקר המאפיינים הוויסקואלסטיים של קווי תאים שונים. השימוש במודל ננו-קונטקט מתאים הוא קריטי להפקת ערכי גמישות כמותית ממדידות כניסת כוח המיוצרות על ידי AFM1,2. מחקרי AFM החוקרים את ההשפעה של תרופות ציטוסקלטליות על גמישות התא הראו את מודולוס אלסטי להיות מושפע מאוד38. בהתבסס על מדידות מודולוס אלסטי, חוקרים רבים הראו כי תאים סרטניים הם רכים יותר מאשר עמיתיהם שאינם משתנים11,38,39. עיוות מוגבר ממלא ככל הנראה תפקיד בולט ביכולתם של תאים סרטניים לגרות גרורות ולחדור לרקמות40. התנהגות כזו מוסדרת על ידי שינויים בארגון cytoskeletal של תאים38,41,42. בנוסף לסרטן, סוג אחר של מחלות תלויות מכנית הן מחלות בדרכי הנשימה. לדוגמה, תסמונת מתח נשימתי חריפה משפיעה על יותר ויותר בני אדם בכל שנה. הוכח כי כאשר חולים לשים על אוורור מכני, עם ריכוזים גבוהים של חמצן, מצבם יכול להחמיר43. בסדרה של מחקרים המתבוננים מקרופאגים אפיתל מכתש עם AFM, מדענים מצאו כי תוספת של סביבה עשירה בחמצן גדל הנוקשות של תאים עקב היווצרות actin; דוגמה עיקרית להשפעה שיש ל-AFM על ההבנה המפורטת שלנו את ההשפעה הסביבתית האטמוספרית על תפקוד הנשימה ברמה התאית, ובסופו של דבר על הריפוי והבריאות האנושית.44,45,46. נוקשות תא אפיתל במהלך הנדידה לכיוון פצע ניתן להעריך גם באמצעות AFM, כי וריאציה של מודולוס אלסטי מתרחשת כדי לאותת על התפשטות תאים בעתיד47,48. לכן, יש צורך מעשי למדוד מכניקת תאים כמותית כדי להבין כיצד תאים חיים שונים, ולקיים אינטראקציה עם, בריאים.
AFM משמש גם לחקר תכונות דבק ומבנה פני השטח. מיקרוסקופ כוח אטומי יש מגוון של מצבים כדי לאסוף מידע על מדגם באמצעות מכניקת מגע. עבור דגימות ביולוגיות חיות, שתיים מהמטרות העיקריות הן להשיג ערכי מאפיינים מכניים כמותיים (למשל,מודולי אלסטי, כוחות דבק) כמו גם למפות גובה פני השטח. מצבים אלה כוללים מצב הקשה (הידוע גם בשם מגע לסירוגין), אשר שומר על משרעת קבועה לסירוגין יצירת קשר עם פני השטח לדוגמה ואת מצב מגע, אשר מעלה או מוריד את cantilever כדי לשמור על הסטהמתמדת 49. ניתן לאסוף מפות הידבקות באמצעות מיפוי כוח במערכת AFM. ה- cantilever מהסיט פנימה את המדגם לכוח מסוים ולאחר מכן נסוג. הכוח המתנגד לנסיגה נמדד על ידי הגלאי כדי ליצור גרף עקירת כוח. כוח ההיתוך הוא הכוח המרבי שנמדד במהלך הנסיגה. מורפולוגיה פני השטח מספקת תצוגה מפורטת של המדגם ברמת המיקרו או הננו. ה- cantilever משלים סריקת רסטר על פני המדגם בהתבסס על הכניסה וההטיה שנלכדו על ידי תנועת ה- cantilever בכל פיקסל, וחושף תכונות בגודל מיקרו וננו. עם AFM, ניתן למדוד את גודלם שלתכונות קטנות כגון מבנה פפטידוגליקן 50,יישור שרשרת פולימר 51, פלאגלה52, לאמליפודיה53ו Filipodia54. בעוד שהכוח של AFM טמון בעקומות תזוזה בכוח ובתמונות טופולוגיות לא אופטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית מציעה הדמיה מפורטת של דגימות עם תוויות פלואורסצנטיות.
מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקל (CLSM) היא טכניקה דומיננטית להדמיית תאים חיים, תאיםקבועים ורקמות 55,56,57. CLSM מועסק עבור הדמיה ביולוגית מאז 1955 כלומר, מאזהקמתה 58,59. בעוד עקרון העבודה של מיקרוסקופים קונפוקלים(כלומר,הדחייה של אור מחוץ לפוקוס דרך חור סיכה) נשאר במידה רבה זהה, היישום הטכניהפך מגוון מאוד 56,57,58,60. הדמיה קונפוקל ניתן ליישם באמצעות סריקה רב נקודתית, כמו במערכתדיסק מסתובב 61, סריקת נקודה של קרן לייזר אחת,כמו בסריקת קו 62, או הדמיה של פונקציית התפשטות הנקודה עם הקצאות מחדש פיקסלים הבאים באמצעות גלאימרובה אלמנטים 57. ההתקדמות האחרונה המרחיבה את התועלת של הדמיה קונפוקל כוללים יכולת סריקת לייזר, סריקת תהודה במהירותגבוהה, וגלאי רגישות גבוהה 63,64,65. היתרון שיש לכל מערכות הקונפוקל על פני מיקרוסקופים רחבים הוא היכולת לבצע חתך אופטי בציר z בפירוט רב יותר, במיוחד בדגימות עבות. מיקרוסקופים רחבים באמצעות זיהוי מבוסס מצלמה אוספים אור הנפלט ממישור המוקד ובמקביל, אור הנפלט מכל מקום בנתיב התאורה. על ידי סגירת חור הסיכה, במחיר של הפחתת האות, ניתן להגדיל הן את הרזולוציה האקסיאלית והן את הרזולוציה הצדדית66. ב- CLSM, תמונות נבנות פיקסל אחר פיקסל באמצעות אוסף אותות פליטה כאשר לייזר בעירור נסרק על-פני שדה תצוגה של x-y. לאחר מכן ניתן להשתמש באוסף של מספר מטוסי x-y לאורך ציר z של המדגם כדי לשחזר את הארכיטקטורה התלת מימדיתשל המדגם 57,67. מיקרוסקופ קונפוקל בשילוב עם כניסתה של חלבונים פלואורסצנטיים, יש מהפכה ההבנה שלנו של ביולוגיה של התא68. לדוגמה, זה הפך לכלי חיוני במדעי המוח69. CLSM משמש באופן קבוע כדי לבחון רקמה מנוקה, ולקבל תמונות מקיפות של המוח מוכתם במערכת החיסון וארכיטקטורת רשתעצבית 70. יישום זה הביא תובנות חדשות לתוך מגעים סינפטיים ותקשורת בין נוירונים ותאי גליה במוח71. מתאי מוח לווסיקלים, פרוטוקולי כתמים פלואורסצנטיים תומכים בבדיקה ולכידה של תפקודי תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל להתקדמותבטכניקות טיפוליות 72,73.
למרות שהם כלים מרשימים ורב-תכליתיים בנפרד, השילוב של מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי (Conpokal) מאפשר לחוקרים לתאם באופן ייחודי תכונות תאיות/רקמות מיקרומכניות עם התבוננות של אורגנים תאיים שונים והדינמיקה שלהם בהתאמה. מכשור מזווג מאפשר למשתמשים, בעיקרו של דבר, "לראות" מה הם מחפשים; יתרון עצום על פני טכניקה אחת בפני עצמה. עם קונפוקל, מיפוי כוח באמצעות AFM מכוסה בתמונות קונפוקליות כדי לתאם נוקשות תאים, הידבקות או מורפולוגיה למבנה הציטוסקלאטל בתוך המדגם, למשל. המטרה הכוללת של שיטת Conpokal היא לספק פלטפורמה לחוקרים ללמוד דגימות חיות בצורה תמציתית ויעילה, המספקת הן נתוני מאפיינים של תמונה והן של חומר בפלטפורמה אחת. בעבודה זו, אנו מדגימים את הפעולה של Conpokal כולל בחירה והכנה מדגם נאות, הגדרת מכשיר, כיול cantilever, ולספק קווים מנחים לפתרון בעיות מוצלח. לאחר הפרוטוקול, אנו מספקים תוצאות מייצגות הכוללות מיפוי מוצלח של חיידקים ותאים בגובה AFM, מיפוי מודולוס AFM של חיידקים ותאים, והדמיה קונפוקל של תאים מרובי תוויות, באמצעות אותו תא confocal ו- AFM. אנו מסיימים בדיון על הצעדים הקריטיים של הליך קונפוקל, המלצות לפתרון בעיות, מגבלות טכניקה, משמעות ותחזית עתידית עבור השיטה.

<table><tbody><tr><td>מארז אקוסטי</td><td>JPK-Bruker</td> תא <td>מארז אקוסטי</td><td>המשמש להפחתת רעש</td></tr><tr><td>BioTracker 488 ירוק מיקרו-צינוריות שלד צבע</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCT142</td><td>משמש לתיוג מיקרו-צינורות בתאי יונקים</td></tr><tr><td>CP-qp-CONT-BSG AFM טיפים</td><td>NanoAndMore</td><td>CP-qp-CONT-BSG-B</td><td>טיפים ל-AFM קולודיאלי טוב למדידות מודולוס על דגימות ביולוגיות</td></tr><tr><td>Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D282</td><td>משמש לתיוג קרום פלזמה של תאי יונקים</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה VWR</td><td></td><td>VWRL0100-0500</td> של Dulbecco <td>רכיב של אמצעי תרבית תאים</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>המשמש להדמיית סביבה ביולוגית</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Fischer Scientific</td><td>45000-736</td><td>רכיב של אמצעי תרבית תאים</td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטים מיקרוביולוגיה תוספי מדיה: תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1422-500</td><td>רכיב של מדיום תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>פלואורודיש צלחת תרבית תאים</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD35-100</td><td>כלים עם תחתית זכוכית שדפנותיהם הצדדיות פחות מ-10 מ"מ, הכרחיות לתפקוד מלא של חומצת גרעין Nanowizard 4a AFM</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 כתם</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62249</td><td>משמש לתיוג גרעין של תאי יונקים, סמן גרעיני טוב לתאים חיים</td></tr><tr><td>כליה עוברית אנושית 293 תאים</td><td>ATCC Global Bioresource Center</td><td>CRL-1573</td><td>תאי יונקים המשמשים בפרוטוקול</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-716</td><td>ציפוי בצלחת תרבית תאים</td></tr><tr><td>דגם: PFQNM-LC-A-CAL AFM טיפים</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-A-CAL</td><td>טיפים ל-AFM שעובדים היטב עבור דגימות בעלות גבהים גדולים (כגון תאים אוקריוטיים)</td></tr><tr><td>NanoWizard 4a</td><td>JPK-Bruker</td><td>NanoWizard 4a</td><td>AFM</td></tr><tr><td>Nikon A1 סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>A1 HD25</td><td>המשמש להדמיה בהירה, אפי-פלואורסצנטית וקונפוקלית</td></tr><tr><td>PENICILLIN/STREPTOMYCIN</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td>רכיב של מדיית</td></tr> <tr><td>תרבית תאיםPetriDishHeater</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>שומר על טמפרטורת דגימת צלחת פטרי רצויה</td></tr><tr><td>qp-BioAC-Cl קצות AFM</td><td>ננו-חיישנים</td><td>qp-BioAC-Cl-10</td><td>שלושה שלוחותי AFM שונים בעלי קשיחות משתנה</td></tr><tr><td>פינצטה קצה סיבי פחמן להחלפה</td><td>טד פלה בע"מ</td><td>5051</td><td>משמש למיקום והסרה בזהירות של קצות AFM עדינים לתוך בלוק ההרכבה מזכוכית</td></tr><tr><td>מרק טוד יואיט Bacto</td><td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td><td>Bacto-249240</td><td>רכיב של מדיום תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>Vancomycin, BODIPY FL Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V34850</td><td>משמש לתיוג פלואורסצנטי של דופן תא חיידקי</td></tr></tbody></table>

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (conpokal) על תאים חיים

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

טכניקות זמינות לאפיון מכני מיקרו וננו-סולם התפוצצו בעשורים האחרונים. החל מהתפתחות נוספת של מיקרוסקופ האלקטרונים בסריקה והעברה, וכלה בהמצאת מיקרוסקופ כוח אטומי והתקדמות בהדמיה פלואורסצנטית, היו רווחים משמעותיים בטכנולוגיות המאפשרות חקר של חומרים קטנים. קונפוקל הוא פורטמנטאו המשלב מיקרוסקופיה קונפוקאלית עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM), שבה גשוש "דוקר" את פני השטח. למרות שכל טכניקה יעילה ביותר לאוסף התמונה האיכותית ו/או הכמותית בעצמה, Conpokal מספקת את היכולת לבדוק עם הדמיית פלואורסצנטיות מעורבת ואפיון מכני. עוצב עבור הדמיה קונפוקאלית כמעט בו זמנית ו חיקור כוח אטומי, Conpokal מקל על ניסויים על דגימות מיקרוביולוגיות חיות. התובנה הנוסף מכישור מזווג מספקת לוקליזציה הדדית של תכונות מכניות נמדדות (למשל,מודולוס אלסטי, הידבקות, חספוס פני השטח) על ידי AFM עם רכיבים תת-תאיים או פעילות שניתן לצפות בה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקולרית. עבודה זו מספקת פרוטוקול צעד אחר צעד לפעולה של מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי סריקת לייזר, בו זמנית, כדי להשיג את אותו תא, אותו אזור, הדמיה קונפוקל, ואפיון מכני.

הטכניקה Conpokal מיוצגת באופן סכמטי איור 1A ותמונה של ההתקנה מוצגת איור 1B. על מנת לאתר במדויק מבנים ביולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל עם אותם מבנים ב- AFM, היישור של שתי המערכות במהלך ההתקנה הוא קריטי. בחר יצרני קונפוקל ו- AFM בעלי מוניטין המכירים את הדרישות המרחביות אחד של השני. בנוסף, יישום מוצלח של הטכניקה מסתמך על הליכי הכתמה טובים, קיבוע המבנה הביולוגי, ואת הבחירה המתאימה של קצה AFM. גובה התאים החיים מציב לעתים קרובות אתגר להדמיית AFM. סריקת AFM מעל תא HEK חי מוצגת איור 2A. הגובה עבור תא HEK מסוים זה היה סביב 10 מיקרומטר, הפגינו על ידי סריקת הקו בירוק (איור 2B). קצה AFM עם היסט אפס (קצה נמצא ממש בקצה ה- cantilever) או גובה הקצה הגדול מגובה התא (למשל,גובה קצה ≥ 10 מיקרומטר) יפיק תמונה פתורה מאוד של תאים בודדים. דוגמה לסריקה גרועה עקב בחירת קצה AFM לא נכונה כלולה ב- איור 2C. בתמונה זו, פיקסלים שחורים הופיעו בשיא התא והצביעו על כך שה-AFM piezo נמצא מחוץ לטווח עקב גובה תא גדול. קצה ה- CANTILEVER של AFM הופיע בתמונה (ריבוע מעוגל) עקב היסט קצה בשילוב עם גובה קצה לא מספיק בהשוואה לגובה התא. ממצאים אלה בתדמית AFM מצביעים על כך שיש לבחור עצה אחרת של AFM כדי לדמיין את התא.
תיוג יעיל בכתמי פלואורסצנטיות יחד עם הבדיקה הנכונה להדמיית תאים חיים נדרשים לשיטה זו. ביצענו תמונה קונפוקלית תלת-צבעית המוצגת איור 3A עם כתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם מיקרוטובול (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). בדיקות תאים חיים אלה נבחרו בשל החפיפה הספקטרלית המוגבלת שלהם ותאימותם לקוביות סינון סטנדרטיות. כללנו גם את התמונה האופטית של שדה בהיר ב איור 3B.
מ- AFM, ניתוח חריצי הקצה יחד עם מודל ננו-מכני, מייצר מפת מודולוס של פני השטח. דוגמה למפת מודולוס שנבנתה באמצעות התאמה של דגם הרץ ופרופיל פרבולי (רדיוס של 8 ננומטריות) עבור צורת הקצה מוצגת מכוסה בשחזור תלת-ממד של צורת התא באיזור 4A (שהוא אותם שני תאים המוצגים באיזור 3). ההקרנה התל-מימדית המתאימה של מחסנית ה-z הקונפוקל לייזר מוצגת איור 4B.
השיטה מתאימה גם למבנים ביולוגיים קטנים יותר, כולל חיידקים בודדים שקשה לפתור את תכונותיהם המיקרו וננוסקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור. מחקר מתמשך משתמש בטכניקת קונפוקל כדי לחקור מנגנונים מכניים בתוך דופן התא המשפיעים על עמידות לאנטיביוטיקה בסטרפטוקוקוס מוטאןs.74 מניפולציה של רכיבי דופן התא הביא לשינויים במורפולוגיה ועמידות לאנטיביוטיקה. Conpokal מקל על חיים, בפתרון, איסוף נתונים (למשל,מורפולוגיה פני השטח, מודולוס אלסטי, חוזק הידבקות, וחספוס פני השטח) על דגימות תא זהה לזוג תכונות מכניות עם נוכחות או היעדר רכיבי קיר התא. איור 5A,B כולל סריקת AFM ומפת מודולוס נמדדת של חיידק סטרפטוקוקוס מוטנס. רזולוציה טובה יותר הושגה בקנה מידה זה עם AFM מאשר עם מיקרוסקופ קונפוקל מסורתי.
איור 6 מכיל תמונה קונפוקאלית של מושבה של צואה של Enterococcus מוכתמת בכתם מבנה תא פלואורסצנטי ירוק, המתחבר לקיר התא. איור 5 ואיור 6 מדגימים את הכדאיות של טכניקת קונפוקל למיקרואורגניזמים בנוסף לתאים אוקריוטיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg"> איור 1: מערך קונפוקל. (א)סכמטי של טכניקת קונפוקל. (B)תמונה של התקנת הכלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg"> איור 2: מיקרוסקופ כוח אטומי של תאים חיים. (א)תמונת AFM של שני תאי HEK. (B) פרופיל גובה (קו ירוק ב- A) של תא HEK המציין את גובה התא הוא די גדול ב 10 מיקרומטר. (C)תמונת AFM גרועה של תא אסטרוציטים שבו פיזו AFM הוא מחוץ לטווח על אופן התא ויש ראיות של הדמיה הפוכה של הקצה cantilever. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg"> איור 3: מיקרוסקופיה קונפוקל וברייטפילד של תאים חיים. (A)מיקרוסקופיית לייזר של תאי HEK חיים מוכתמים בכתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם מיקרוטובול (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). (B)תמונה אופטית תואמת של שדה בהיר. סרגלי קנה מידה הם 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg"> איור 4: השוואה של עיבודים תלת-ממדיים של AFM ומיקרוסקופיה קונפוקל של תאי HEK חיים. (A)מפת מודולוס שנבנתה באמצעות התאמה לדגם הרץ ופרופיל פרבולי (רדיוס של 8 ננומטריה) עבור צורת הקצה מכוסה בשחזור תלת-ממד של התא מ- AFM. (B)ההקרנה התלת-מימדית המתאימה של מחסנית ה-z הקונפוקל לייזר עם כתם גרעיני (כחול פלואורסצנטי), כתם microtubule (ירוק פלואורסצנטי) וכתם קרום ליפופילי (אדום פלואורסצנטי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg"> איור 5: דגימת AFM של חיידקים. (A)סריקת AFMו- ( B) נמדדה מפת מודולוס של חיידק מוטנס סטרפטוקוקוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg"> איור 6: מיקרוסקופיה קונפוקל של דגימת חיידקים. תמונה קונפוקאלית של מושבה של צואה Enterococcus עם כתם קרום פלואורסצנטי ירוק. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Conpokal משלב מיקרוסקופיה קונפוקאלית עם מיקרוסקופ כוח אטומי באמצעות בדיקה כדי לתקוע את פני השטח מדגם. למרות ששתי הטכניקות יעילות בנפרד, קונפוקל מקל על לוקליזציה פלואורסצנטית עם אפיון מכני. היתרון העיקרי של טכניקת קונפוקל, הוא מיקרוסקופיה כפולה כמעט בו זמנית.Confocal חוקר cytoskeletal ותהליכים תאיים אחרים לפני ואחרי AFM, אשר מספק תכונות מכניות ספציפיות לאזור. טכניקה זו היא השפעה בתוך השדה mechanobiology כמו למשל, תאי המוח ניתן לחקור בתנאים פיזיולוגיים כדי לבחון דחפים חשמליים עסקת כוח. לפני תחילת הניתוח, בחר CANTILEVER AFM מתאים עבור איסוף הנתונים הרצוי ולהשתמש כפפות, שלב הרכבה שבב AFM, פינצטה, מברג קטן כדי לטעון את השבב לתוך בלוק הזכוכית.מניחים בזהירות את שבב AFM על מרכז בלוק הזכוכית. Cantilever בתוספת חלק קטן מאוד של שבב AFM צריך להיות בחלק גלוי, לא אטום של בלוק הזכוכית. השתמש במברג כדי להדק את הבורג עד השבב נוח נגד בלוק הזכוכית, ולהשתמש בעדשה כדי לבדוק כי השבב מכוון כראוי.כאשר השבב היה מכוון כראוי, למקם את בלוק הזכוכית לתוך ראש AFM בכיוון הנכון ולנעול את בלוק הזכוכית למקומו. לאחר איתור החלק התחתון של צלחת הכיול על ידי מיקרוסקופיה שדה בהיר, להשתמש במערכת AFM מערכת Z צעד מנוע בקרה הלוח כדי להזיז את CANTILEVER AFM 2000 מיקרון מעל המדגם. באמצעות תאורת שדה בהירה ואת לוח הבקרה של מנוע צעד Z, לאט להוריד את שבב AFM לתחתית צלחת הזכוכית בשלבים של 100 עד 200 מיקרון, כדי למנוע קריסה של קצה AFM לתוך צלחת פטרי.אתר את המיקרומטרים הידניים השליטה ב- X Y או בתנועה רגילה של ראש AFM בפלטפורמת המכשיר. ככל שהצל מה- AFM הופך כהה יותר, והצורה הופכת חדה יותר, השתמש במיקרומטרים הידניים כדי לתקן את ראש ה- AFM ולהתאים את מיקום ה- AFM בתוך שדה המבט. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את טבלאות בדיקת המידע.צפה עבור צל להופיע בתצוגת תוכנת מיקרוסקופ, אשר מציין כי קצה AFM מתקרב לתחתית המנה. המשך להשתמש בשלבים קטנים כדי להוריד את קצה ה- AFM עד שהטיפ יהיה בעיקר בפוקוס. כאשר הלייזר נמצא בעמדה, השתמש בחוגות יישור הלייזר כדי למקם את הלייזר בצד האחורי של המקום שבו קצה AFM ממוקם על cantilever.לוח יישור הלייזר אמור להציג אות סכום גדול מאפס וולט. להזיז את הלייזר, מרחק קטן בכל הכיוונים על cantilever AFM, עד אות הסכום המרבי מושגת תוך שמירה על קצה AFM. לאחר הגדרת מיקום הלייזר, השתמש בחוגות ההטיה הנשלטות באופן ידני לאפס את ההטיה האנכית והמאוחרת.השתמשו ב ידיות ההטיה האנכיות והצלביות כדי ליישר את הגלאי כך שהמטרה תהיה מרוכזת ולא נצפתה הסטה אנכית או או רבתית בלוח יישור הלייזר. פתח את חלון הכיול והזן את כל המידע הספציפי של הניסויים. החלף את מסנן אור הלייזר.לפני הכיול, כבה את מקור האור של המיקרוסקופ הקונפוקלי וסגור את מארז AFM כדי לעמעם כל רעש פוטנציאלי המגיע מהאור או התנודות בחדר. לחץ על לחצן כיול כדי לאפשר למערכת לכייל את הקצה באופן אוטומטי. לאחר השלמת הכיול, הנוקשות של ה- cantilever והרגישות שלו יוצגו בלוח הכיול.לאחר מכן השתמשו בלחצן 'פקודת גישה אוטומטית' כדי להנמיך את הקצה לתחתית צלחת הדגימה ולהגדיר את גודל אזור העור, הרזולוציה, נקודת הסט, אורך Z וזמן הפיקסל, לפני שתלחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל בסריקה. להדמיית מיקרוסקופ קונפוקל בתוכנת המיקרוסקופ, אפשר את יכולות הקונפוקל ובחר את קווי הלייזר המתאימים לצבעים ששימשו להכתמת הדגימות. בחר קו לייזר אחד או יותר כדי לרגש ולדמיין תכונות אלה בדגימה והגדר את הרווח לערך הממטב את הפלואורסצנטיות לדוגמה אך מגביל את כמות הרעש.כוונן את עוצמת הלייזר כדי להימנע מפיקסלים רוויים תוך מקסום הטווח הדינמי והגדר את גודל חור הסיכה ליחידת שטח אחת כדי למקסם את הרזולוציה עבור החיתוך האופטי. במידת הצורך, התאימו את הערכים בהתאם לבהירות הדגימה. כדי לקבוע את זמן ההתעכבות של הפיקסלים, התחל עם זמן שהות של כשני מיקרו-שניות והתכוונן כדי לשקף את בהירות הדגימה לפי הצורך.לבחירת גודל הפיקסל עבור המטרה שנבחרה, אפשר לכלי לחשב את גודל הפיקסל באמצעות לחצן האפשרויות Nyquist ומספר הפיקסלים שנבחר בתמונה. לאחר מכן, בחר באפשרות סריקה והתחל את איסוף הנתונים. השתמש בלחצן המוקד כדי לאתר את מישור המוקד המייצג את תכונות הדגימות בצורתו הברורה ביותר, את לחצן סריקה כדי להתחיל באיסוף נתונים ואת לחצן לכידה כדי ללכוד תמונה דו-ממדית.באמצעות החלונית השולטת בגודל הפיקסל באמצעות האפשרות Nyquist, הקטן את גודל השטח של הסריקה כדי לתחום תא אחד בלבד. הפעל את כלי האיסוף ושימוש באפשרות מלמטה למעלה, כאשר רק קו הלייזר המאיר תכונה בדגימה בצורה ברורה ביותר, הגדר את מישורי ההתחלה והסיום כדי שהנפח יימדד באמצעות המרווח המוצע בין המישורים. תן שם לקובץ ושמור אותו בתיקיה המשויכת.לחלופין, אם הידע שלנו מראש של עובי הדגימות קיים, בחר את המישור הבהיר, החד ביותר, האמצעי על ידי התאמת המוקד כדי להגדיר את עוצמת הקול ולהגדיר את החלק העליון כדי לקבל את עובי המדגם מעל המישור האמצעי, ואת החלק התחתון יש את העובי מתחת למישור האמצעי, ולאחר מכן בחר את גודל הצעד המתאים. הפעל את הרכישה על-ידי לחיצה על לחצן הפעל כעת. כאשר הרכישה מסתיימת, שמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.בסוף הניסוי, ללבוש כפפות תוך הסרת בלוק הזכוכית למקם אותו לתוך תחנת ההרכבה. השתמש פינצטה עם ידיות גומי כדי להסיר בזהירות את שבב AFM ולמקם את הקצה בשימוש בחזרה לתוך המיקום של תיבת האחסון בכיוון את הגישה כדי לציין כי זה היה בשימוש. לעיון בעתיד, שים לב באיזה טיפ נעשה שימוש בניסוי.כאן, סריקת AFM נציג מעל תא HEK חי מוצג. הגובה של תא HEK המסוים הזה היה סביב 10 מיקרון כפי שהודגם על ידי סריקת הקו. כאן, דוגמה של סריקה גרועה בשל בחירת קצה AFM לא תקין ניתן לראות.בתמונה זו, פיקסלים שחורים הופיעו בשיא התא והצביעו על כך שאזור AFM PA היה מחוץ לטווח עקב גובה תא גדול. סוף ה- AFM cantilever מופיע גם בתמונה עקב היסט הקצה בשילוב עם גובה קצה לא מספיק בהשוואה לגובה התא. ממצאים אלה בתדמית AFM מציינים שהיה צריך לבחור קצה AFM אחר כדי להציג את התא בתמונה.ניתן לבצע דימות קונפוקל בשלושה צבעים. לדוגמה, כדי לדמיין את גרעין התא, צינוריות מיקרו, קרום ליפופילי. ניתוח חריצים קצה בשילוב עם המודל מכני ננו, מאפשר את הדור של מפת מודולוס של פני השטח.כאן, הקרנה תלת-מימדית תואמת של מחסנית ה- Z הקונפוקל לייזר מוצגת. סריקות AFM ומפות מודולוס נמדדות ניתן לרכוש גם עבור חיידקים, כפי שנצפה בניתוח מייצג אלה של חיידק סטרפטוקוקוס מוטנס. כפי שהוכח, רזולוציה טובה יותר ניתן להשיג בקנה מידה זה עם AFM, מאשר עם מיקרוסקופ קונפוקל מסורתי.מיפוי כוח דבק הוא טכניקה המבוצעת באמצעות קונפוקל כדי לדמיין אינטראקציות מולקולריות. לדוגמה, כדי ללמוד את אפנון של מולקולות פני השטח של התא כדי לבחון קינטיקה מחייבת. Conpokal סדרנים במסלול חדש לחקר יחסי תפקוד מבנה במיקרוביולוגיה רפואית.לדוגמה, אירועים פיזיים וכימיים ואת השכבה peptidoglycan, יכול להיות קשור עמידות לאנטיביוטיקה.

near-simultaneous-laser-scanning-confocal-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

ההיבט הנחקר ביותר של ההתאמה הביולוגית של חומרים מרוכבים שיניים הוא ההדמיה שלהם הרעילה 3D CLSM זמן לשגות בשילוב עם כימות אות ניאון מאפשרת הערכה רגישה של גורל התא לאורך זמן. ניצול שיטה זו יכול להיות כלי יעיל להערכת cytocompatibility של חומרים מרוכבים שיניים.

ההדמיה confocal זמן הפקיעה הוא אמצעי יעיל להערכת Cytocompatibility מרוכבי שיניים

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

למד את שיטת Conpokal לדימות תאים חיים באמצעות שילוב מיקרוסקופיית קונפוקל וכוח אטומי. שיטה זו מאפשרת אפיון מכאני ופלואורסצנטי בו-זמני של תאי מוח ומדגימה יחסי מבנה-תפקוד בביולוגיה.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

גלה סרטונים נוספים