הערכת הביטוי של קומפלקס היסטו-תאימות גדול מחלקה I על נוירונים היפוקמפוס מורין ראשי על ידי Cytometry זרימה

פרוטוקול זה משתמש בזרימה ציטומטרית כדי להעריך כמותית ביטוי MHC חוץ-תאי מסוג 1 על נוירונים ראשוניים שגודלו מעכברים. ניתן לבצע צביעה חיסונית NC2 לביטוי MHC1 גם כדי למנוע אובדן אות עקב חלבון, שלישוני, שינויים מבניים, חדירות או דנטורציה. בנוסף להכוונת תגובות חיסוניות לזיהומים, MHC Class 1 מווסת קשרים סינפטיים עצביים.

עם זאת, הגורמים המווסתים את ביטוי MHC Class 1 עדיין אינם ידועים. שלבי דיסקציה של המוח העוברי דורשים תרגול כדי לשלוט בהם. כשאתה לומד את הטכניקה, הקפד לתרגל את הדיסקציה מבלי לדאוג לזמן או לתהליך התרבות שלאחר מכן.

לבידוד ההיפוקמפוס העוברי, הנח את המוח העוברי הראשון של העכבר שנקטף תחת מיקרוסקופ סטריאו-דיסקציה. והשתמש בשני זוגות מלקחיים סטריליים של דומונט מספר 5 כדי לצבוט את נורות הריח ולמשוך היטב את קרומי המוח. לאחר שקרומי המוח הוסרו לחלוטין, הצד העליון של קליפת המוח ייפתח לרוחב כדי לחשוף את ההיפוקמפוס.

השתמש במלקחיים כדי לצבוט את ההיפוקמפוס הרחק מקליפת המוח המחוברת ולהעביר בזהירות את ההיפוקמפוס המבודד לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום Hibernate-E על קרח. כאשר כל ההיפוקמפוס נאסף לתוך צינור יחיד של 15 מיליליטר, משקעים את רקמת המוח על ידי צנטריפוגה. החלף את הסופרנטנט ב-0.5 מיליליטר של דיסוציאציה פפאין טרייה שהוכנה לעובר וערבב את הצינור מספר פעמים על ידי היפוך.

מניחים את הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מערבבים את הדגימות בהיפוך כל 10 דקות לפני איסוף הרקמה שוב על ידי צנטריפוגה. החלף את הסופרנטנט בנפח שווה של Hibernate-E Medium טרי והשתמש בזכוכית פתוחה לחלוטין, פיפטת פסטר מלוטשת אש כדי לשבש את הרקמה 10 פעמים. לאחר שנתנו לרקמה להתייצב במשך שתי דקות, העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.

הוסף נפח שווה של Hibernate-E Medium בחזרה לרקמה והשתמש בפיפטה פסטר מלוטשת באש חצי זכוכית פתוחה כדי לשבש את הרקמה 10 פעמים. לאחר שנתנו לרקמה להתייצב במשך שתי דקות נוספות, אספו את הסופרנטנט בצינור של 50 מיליליטר. הוסף נפח שווה של Hibernate-E Medium לרקמות וטריטור את הרקמה 10 פעמים עם רבע זכוכית פתוחה פיפטה פסטר מלוטשת באש.

לאחר שנתנו לרקמה להתייצב במשך שתי דקות, אספו את הסופרנטנט בצינור של 50 מיליליטר. אסוף את התאים המנותקים בסופרנטנט על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום גידול נוירונים לספירה: לדלל את התאים לצפיפות ציפוי סופית של חמש פעמים 10 לתאים החמישיים הקיימים למיליליטר של מצע גידול נוירונים ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לכל באר של צלחת מצופה פולי-D-ליזין עם 12 בארות.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים, והחליפו מחצית מהמדיום בנפח שווה של מדיום טרי פעמיים בשבוע למשך חיי התרבות. כדי להעריך את יכולתם של הנוירונים המתורבתים לבטא MHC1, ביום התרבית המתאים, החלף 0.5 מיליליטר של סופרנטנט בכל באר ב-0.5 מיליליטר של מדיום גידול נוירונים טרי בתוספת 200 יחידות למיליליטר של אינטרפרון בטא למשך שש עד 72 שעות דגירה בחממת תרבית התאים. בתום הדגירה, יש לשטוף כל באר פעם אחת עם מדיום נוירובזאלי קר ללא תוספים לפני הוספת 0.5 מיליליטר של מדיה נוירובזאלית קרה ללא תוסף בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של בלוק FC ומיקרוגרם אחד למיליליטר של נוגדן אנטי-MHC1 מצומד פלואורסצנטי לכל באר.

לאחר דגירה של 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הגן עליו מפני אור. שוטפים כל באר פעם אחת עם Dulbeccos PBS קר. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר דיסוציאציה של תאים נטולי אנזימים בטמפרטורת החדר לכל באר וערבב כדי לעקור את התאים.

אשר דיסוציאציה תחת מיקרוסקופ תרבית רקמה הפוכה והוסף 0.5 מיליליטר של מאגר FACS לכל באר. יש לשלש את התאים כדי לפזר גושים ולהעביר את כל הנפח מכל באר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.7 מיליליטר. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי לכל צינור.

העבירו כל מתלה לבארות בודדות של צלחת U תחתונה של 96 בארות והוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב קיבוע לכל באר. יש לשלש מספר פעמים כדי למנוע גוש תאים ולדגור על הצלחת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, צנטריפוגה לאיסוף התאים בתחתית הבארות והשעיית הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי לבאר.

לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מגיב חדירה בתוספת נוגדן אנטי-גרעיני עצב מצומד פלואורסצנטי לכל באר. לאחר הערבוב יש לדגור את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה מוגנת מפני אור. בתום הדגירה, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה שלוש פעמים, והשעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של חיץ FACS טרי בין הצנטריפוגות.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של 2% זוג פורמלדהיד במאגר FACS עם ערבוב יסודי. ניתן לזהות נוירונים באמצעות שער רציף של סך האירועים כדי לא לכלול פסולת תאית וכפילים ועל ידי החיוביות של גרעיני העצב שלהם. לאחר מכן ניתן לנתח תאים חיוביים לגרעיני עצב עבור חיובי MHC1 שלהם.

מנתונים אלה ניתן לחשב את אחוז הנוירונים החיוביים לצביעה MHC1 ואת עוצמת הקרינה החציונית, מה שמגלה כי, למשל, טיפול באינטרפרון בטא מווסת משמעותית את האחוז והעוצמה של ביטוי נוירונים MHC1. עם שינויים קלים, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לתרבית אוכלוסיות עצביות אחרות כמו נוירונים בקליפת המוח או לבדיקת סמנים תאיים שונים, מולקולות מגרות או שינויים גנטיים.