Name: קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למדו שיטה יעילה לבידוד מיקרוגליה ראשונית מרקמת מוח אנושית בוגרת שנאספה בניתוח. הפרוטוקול מספק תפוקה גבוהה של כ-80% תאי מיקרוגליה לחקירה נוירו-מmunולוגית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המעבדה של SJ הוקמה עם מענקים מוסדיים מ-IITJ ומומנה על ידי מענקים מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ומשרד האלקטרוניקה וטכנולוגיה של הודו (מס' 4(16)/2019-ITEA). סעיפים רקמת המוח האנושי הושגו מכל הודו המכון למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית. אנו מודים למאיאנק ראתור, סטודנט B.Tech של האגודה לעיצוב ואמנויות IIT ג'ודפור, על תמיכת הווידאוגרפיה.

כל הרקמות נרכשו לאחר אישור אתי מוועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה ג'ודפור וכל המכון ההודי למדעי הרפואה (AIIMS) ג'ודפור.
1.רכישת רקמות ועיבוד (יום 0)
<ol><li>לאסוף את הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של נוזל מוחי מוחי שדרתי קר כקרח (aCSF) (2 מ'מ CaCl2∙2H2O, 10 מ', 3 מ"מ KCl, 26 מ', NaHCO3,2.5 מ', 2.5 מ' נה2ת.ד. 4,1 מ"מ MgCl2∙6H2O, 202 מ'מ סוכרוז)20. ודא כי הצינור נשמר על קרח אם הרקמה צריכה להיות מועברת למיקום אחר. הערה: הכן aCSF במים מזוקקים autoclaved. לסנן אותו עם מסנן מזרק 0.22 μm בשכונה למינאר. ניתן לאחסן זאת למשך חודש אחד ב- 4 °C.</li>
	<li>נגבו את צינור האיסוף בזהירות עם 70% אלכוהול והעבירו לתא זרימת אוויר לאפספטי למינאר.</li>
	<li>השליכו את ה-aCSF בזהירות ושקלו רקמה במצב אספטי. משקל רקמה חיוני כדי לחשב את הנפח של trypsin-EDTA הדרוש עבור השלבים הבאים.</li>
	<li>יש לשמור את הרקמה ב-aCSF חם וטרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. צעד זה הוא קריטי כדי למנוע מוות של תאים.</li>
	<li>השליכו aCSF ושטפו רקמת רקמה פעם אחת עם PBS אחד (תמיסת מלח עם פוספט) ב-37°C. ודא שכל הדם נשטף עם שטיפה חוזרת ונשנית של PBS (לפי הצורך).</li>
	<li>דגירה הרקמה PBS חם, ב 37 ° C, במשך 5 דקות.</li>
	<li>נפטרים מ-PBS בזהירות ומעבירים רקמות לצלחת פטרי עיקור. ניתן להסיר PBS באמצעות פיפטה. זה ימנע כל אובדן של רקמות.</li>
	<li>לקובות את הרקמה לתוך קטן (לפחות1 מ"מ 3)חתיכות באמצעות אזמל סטרילי. רקמה קצומה דק מספק שטח פני השטח רקמות גבוה יותר עבור פירוק רקמות על ידי trypsin-EDTA הבטחת תשואה גבוהה יותר.</li>
	<li>להעביר את הרקמה הקצוצית לצינור 50 מ"ל המכיל רקמת 10 מ"ל/גרם של 0.25% טריפסין-EDTA ולערבב על ידי pipetting דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של טריפסין/EDTA לצלחת פטרי ושוטפים את הצלחת ביסודיות בעזרת פיפטה. הוסף את הנסין הזה בחזרה לצינור הבז. זה ממזער אובדן של רקמות ותאים תוך היתוך היקוביות.</li>
	<li>דגירה הצינור על שייקר במשך 30 דקות ב 37 ° C ב 250 סל"ד. שלב זה מגביר את הדיסוציאציה של תאים מרקמות.</li>
	<li>בסוף הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של ניטרול בינוני (50% DMEM/50% F12 עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% FBS) כדי לנטרל טריפסין. מערבבים עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. כמות נטרול המדיה שנווספת צריכה להיות שווה לכמות השלושה-ניסיון בהם נעשה שימוש.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור ב 2,000 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות.</li>
	<li>להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של תרבות בינונית (50% DMEM/50% F12 עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 20% L929 supernatant, 10% FBS). הערה: תאי L929 הם תרבות DMEM (DMEM עם גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10% FBS). ATCC מומלץ שיטת תרבות יש לעקוב אחר תרבות התא. יש לאסוף את Supernatant מבוקון התרבות שהוא לפחות 75% confluent. ניתן לאסוף אותו בכמויות גדולות ולאחסן ב -80 °C כדי למנוע השפלה של גורמי גדילה. מומלץ להוסיף את L929 supernatant בנפרד במבחנות במקום להוסיף למדיום תרבות המניות.</li>
	<li>לוח התאים במבחנות T-25, מתאים לתאים דבקים, ולהוסיף 4 מ"ל של מדיום תרבות נוסף. דגירה הבקבוקון ב 37 ° C עם 5% CO2. לנער בזהירות את הבקבוקון כדי לפזר הומוגנית את הרקמה. הימנע להביא את התקשורת לצוואר הבקבוקון, תוך כדי טלטול, כמו זה עשוי להגדיל את הסיכויים לזיהום.</li>
</ol>2. תרבות תאים (יום 2)
<ol><li>לאסוף את התקשורת מבקבוק תרבות T-25 מוכן ביום 0 בשלושה צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל על ידי איסוף נפח שווה של מדיה בכל צינור. לשטוף את הבקבוקון פעם אחת עם 1 x PBS. לנער את הבקבוקון בעדינות כדי להסיר את כל שברי רקמת השריד שמאל. הימנע מרעידות קשות של הבקבוקון כמו כל שברי שריד לא ישפיע לרעה על התרבות. להוסיף 5 מ"ל מדיה תרבות טריה לבקבוקון.</li>
	<li>צנטריפוגה את המדיה שנאסף ב 1,466 x g (4000 סל"ד) ב 4 ° C במשך 4 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנט מכל שפופרת והוספו 1 מ"ל של תרבות בינונית לאחד הצינורות. מערבבים היטב עם פיפטה. הוסף באופן סדרתי את המדיה המעורבת עם תאים לצינורות אחרים. מערבבים היטב עם פיפטה ומאגרים את התאים בצינור אחד.</li>
	<li>לוח התאים במבחנון T-25 נפרד, מתאים לתאים דבקים. הוסף 4 מ"ל של תרבות בינונית ותדגירה את הבקבוקון ב-37°C עם 5% CO2.</li>
</ol>3. תרבות תאים (יום 4)
<ol><li>השליכו את אמצעי התקשורת משני הבקבוקונים והוספו 5 מ"ל טריים של מדיה תרבות לבקבוקון.</li>
	<li>דגירה הבקבוקון ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 2 ימים.</li>
</ol>4. תרבות תאים (יום 6)
<ol><li>התאים יהיו מוכנים לניסויים נוספים.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

Microglia להבטיח הומוסטאזיס במוח הרגיל ולשחק תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות שונות4. Microglia הם מרכזיים נוירו-פיתוח היווצרות של סינופסות2. מחקרים Microglial הוכיחו מרכזי בהבנת הפיתוח וההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מגוונות4. מיקרוליה מכרסמים הם המודל הנפוץ של בחירה עבור מחקרים microglial ראשוני, למרות, microglia מכרסמים שונים microglia האנושי העיקרי בהיבטיםמרכזיים 13. פיתוח של עלות יעילה, תשואה גבוהה, פרוט...

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בנויה של רשת מורכבת של נוירונים ותאי גליה1. בין תאי גליה, microglia לתפקד כמו התאים החיסוניים המולדים של CNS2,,3. Microglia אחראים לשמירה על הונואוסטזיס ב CNSבריא 4. Microglia גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות עצבית, על ידי גיזום סינאפסות2. Microglia הם מרכזיים הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות נוירולוגיות כולל אך לא מוגבל; מחלתאלצהיימר 5, מחלת פרקינסון6,שבץ 7, טרשת נפוצה8, פגיעה מוחיתטראומטית 9, כאבנוירופתי 10,פגיעה בחוט השדרה 11 ותגידולים במוח כגון גליומס12.
מחקרים הקשורים הומוסטאזיס CNS ומחלות לנצל microglia מכרסמים בשל דקט של עלות יעילה ויעילה בזמן אנושי ראשי microglia פרוטוקוליםבידוד 13. מיקרוליה מכרסמים דומים microglia האנושי העיקרי בביטוי של גנים כגון Iba-1, PU.1, DAP12 ו M-CSF קולטן היו יעילים בהבנת נורמלי, כמוגם מוח מחלה 13. מעניין, הביטוי של מספר גנים הקשורים למערכת החיסון כגון TLR4, MHC II, Siglec-11 ו Siglec-3 משתנה בין מיקרוליהאדם מכרסמים 13. הביטוי של מספר גנים משתנה גם בביטוי זמני ובמחלות ניווניות בשני המינים14,15. הבדלים משמעותיים אלה הופכים את המיקרוליה האנושית למודל חיוני לחקר תפקוד מיקרוליה בהומטזיס ובמחלות. microglia האנושי העיקרי יכול להיות גם כלי יעיל עבור הקרנה פרה-סרטנית של מועמדים פוטנציאליים לסמים16. הסיבות שהוזכרו לעיל מדגישות את הצורך הגובר בפרוטוקולים חסכוניים לבידוד של מיקרוליה אנושית ראשית.
פיתחנו פרוטוקול לבידוד של microglia אנושי ראשוני מרקמות מוח אנושיות בוגר שנאספו כתוצאה של חלון כירורגי שנוצר עבור ניתוחים או ניתוחים אחרים. השיטה כאן שונה במידה ניכרת מהשיטות הקיימות. הצלחנו לבודד ולתרבות מיקרוליה לאחר זמן מעבר של כ-75 דקות מאתר איסוף הרקמות כדי להתחיל את פרוטוקול הבידוד במעבדה. השתמשנו supernatant של L929 פיברובלסט תאים כדי לקדם את הצמיחה של microglia מבודד. שיטה זו מתמקדת במיוחד בתרבות ופיתוח של מיקרוליה ראשונית בלבד. התרבות שנוצרה מוכנה היא כ 80% microglia. בעוד פרוטוקולים אחרים מספקים תרבות מועשרת של microglia על ידי צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות, ציתום זרימה חרוזים מגנטיים, הפרוטוקול הוא מהיר, פשוט, חזק וחסכוני דרך לתרבות microgliaאדם העיקרי 17,18,19,20. היכולת לנצל בניתוח הוסר רקמת מוח מבוגר חי במקום רקמות מוח קבועות של גופות מוכיח יתרון נוסף של שיטה זו בניגוד הליכיםקיימים 18,21.

<table><tbody><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה (4 &deg; C)</td> <td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממה</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>גלקסי 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מדיום עם גלוטמין</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת פלקון (50 מ"ל)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין Ricinus communis agglutinin-1</td><td>וקטור</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield עם DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>שייקר חממה</td><td>ניו ברונסוויק Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>NCTC שיבוט 929 [תא L, L-929, נגזרת של זן L] (ATCC&nbsp; CCL-1)</td><td></td></tr> <tr><td>זרימת אוויר למינרית</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>מונוסודיום פוספט</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומרים מזינים F-12 בשר חזיר בינוני</td><td></td><td>Himedia Al106S</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>Duran Group</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Himedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק (0.2&mu;, קוטר 25 מ"מ)</td><td>Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 צלוחיות תרבית רקמה המתאימות לתרבית תאים דביקה.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>ברקוד 25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia הם תאים חיסוניים מולדים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS). Microglia לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח, בשמירה על הומוסטאזיס, ובמהלך זיהום או פציעה. מספר קבוצות מחקר עצמאיות הדגישו את התפקיד המרכזי כי microglia לשחק במחלות אוטואימוניות, תסמונות דלקת אוטואיציה וסרטן. ההפעלה של microglia במחלות נוירולוגיות מסוימות עשויה להשתתף ישירות בתהליכים פתוגנים. microglia העיקרי הם כלי רב עוצמה כדי להבין את התגובות החיסוניות במוח, אינטראקציות תא ופנוטיפים microglia dysregulated במחלה. microglia העיקרי לחקות תכונות microglial vivo טוב יותר מאשר קווי תא microglial מונצחים. מיקרוליה למבוגרים אנושיים להפגין תכונות נפרדות לעומת מיקרוליה העובר והכורסמים האנושיים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לבידוד של microglia ראשוני ממוח אנושי בוגר. לימוד microglia אלה יכול לספק תובנות קריטיות על אינטראקציות תא בין microglia ואוכלוסיות תאים תושבים אחרים ב-CNS כולל, oligodendrocytes, נוירונים ואסטרוציטים. בנוסף, microglia ממוחות אנושיים שונים עשוי להיות מתורבת לאפיון של תגובות חיסוניות ייחודיות לרפואה מותאמת אישית ואינספור יישומים טיפוליים.

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל(איור 1),הצלחנו לבודד מיקרוליה אנושית ראשית מרקמות מוח ותוכותות בניתוח. תאים תרבותיים היו מוכתמים עם Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) לקטין עבור microglia (ירוק) ועם חלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP) עבור אסטרוקיטים(אדום)( איור 2 ) כפי שתוארקודם לכן 22,23,24,25,</s...

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא לבודד תאי microglia ראשוניים מרקמות מוח אנושיות בוגרות חיות. במקרה שלנו, זה נאסף כחלון כירורגי במהלך הניתוח. זה מושגת על ידי בתחילה איסוף רקמות המוח בקרח קר PBS, הרקמה לאחר מכן חתוך לקוביה 1 מ"מ חתיכות קטנות, ואני פשוט עשיתי בעזרת טריפסין EDTA.לאחר מכן, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה מצופה בקבוקון מתאים לתרבות תאי אנדרוגן במשך 48 שעות. תאים נקצרים שוב מן הבקבוק ותרבתו עד לשימוש נוסף. תאי מיקרוגליה אנושיים ראשוניים יכולים כעת להיות מאופיינים באמצעות אימונוציטוכימיה ולהשתמש בהם לניסוי נוסף.היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו לבודד תאי microglia מרקמות המוח האנושיות הבוגרות הוא שהוא מספק ביעילות תאי microglia אנושיים בוגרים ראשוניים בצורה חסכונית מאוד. הפרוטוקול חזק ומפחית את אובדן התאים על-ידי הפחתת מספר השלבים המשמשים בפרוטוקולים קיימים. לאסוף את הרקמה בצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של קרח קר aCSF.נגבו את צינור האיסוף בזהירות עם 70% אלכוהול והעברו לתא זרימת אוויר למינארי אספטי. השלך את aCSF בזהירות ולשקול רקמה בצינור פלקון. לחשב את המשקל המשוער של רקמה על ידי הסיק את המשקל של צינור פלקון ריק.ACSF טרי וחם עד 37 מעלות צל"ש. שמור את הרקמה ב- aCSF חם במשך חמש דקות. צעד זה הוא קריטי כדי למנוע מוות תאי.השלך ACSF בזהירות. ולשטוף רקמה פעם אחת עם PBS 1X מחומם ל 37 מעלות צל"ש. ודא שכל הדם נשטף עם שטיפות PBS חוזרות ונשנות לפי הצורך.הדגירה את הרקמה PBS חם במשך 5 דקות. השלך חצי מה-PBS בזהירות. מעבירים רקמה יחד עם PBS שנותר לצלחת פטרי מעקרת.הסר את ה- PBS הנותר בזהירות עם פיפטה של 1 מ"ל. זה ימנע אובדן של רקמה. קוביות המנפיקות לקוביה לפחות 1 מ"מ חתיכות קטנות באמצעות אזמל סטרילי.הוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין EDTA לצלחת פטרי ושטפו את הצלחת ביסודיות בעזרת פיפטה. העבר את הרקמה חצויה לצינור פלקון 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל לגרם רקמה של 0.25% טריפסין EDTA. מערבבים על ידי צינור דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.הדגירה את הצינור על שייקר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלסיגרד ואת המהירות של 250 סל"ד. מוסיפים 10 מ"ל של נטרול בינוני כדי לנטרל טריפסין. מערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.צנטריפוגה הצינור ב 2000G ב 4 מעלות צלחים במשך 10 דקות. להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבות. מניחים את התאים בבקבוק T25 המתאים לתאי אנדרוגן ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום תרבותי נוסף.מדיום תרבות יכיל 20%L929 על-טבעי ו-1%סטרפטומיצין. מומלץ להוסיף L929 על טבעי בנפרד בבקבוקונים במקום להוסיף למדיום תרבות המניות. סיימנו עם הבקבוק כדי להיפטר הומוגנית את הרקמה.הימנע להביא את התקשורת לצוואר של הבקבוק תוך רועד כמו זה עשוי להגדיל את הסיכויים לזיהום. הדגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלסיאדה עם 5% CO2 במשך 48 שעות. לאסוף את התקשורת מבקבוק תרבות T25 מוכן ביום 0 בצינורות צנטריפוגה.צנטריפוגה התקשורת שנאספה ב 1, 466G ב 4 מעלות צל"ש במשך 4 דקות. בעוד התקשורת שנאספה הוא להיות צנטריפוגה, לשטוף את היום 0 בקבוק פעם אחת עם 1X PBS. לנער את הבקבוק בעדינות כדי להסיר את כל שברי רקמת שאריות שנותרו.הימנע טלטולים קשים של הבקבוק כמו כל שברי קרן לא ישפיע לרעה על התרבות. הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. השלך את העל-טבעי מצינורות צנטריפוגליים.מוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני לאחד הצינורות ומערבבים ביסודיות עם פיפטה. מוסיפים באופן סדרתי את המדיה המעורבת עם תאים לצינורות אחרים ומערבבים היטב. הניחו את התאים בבקבוק T25 נפרד המתאים לתאי אנדרוגן.הוסף 4 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה לבקבוקון. הדגירה שני flasks ב 37 מעלות צל"ש עם 5% CO2 במשך 48 שעות. השלך את המדיה משני הבקבוקים והוסף מדיה טרייה של תרבות 5 מ"ל.דגירה flasks ב 37 מעלות צל"ש ב 5%CO2 במשך 48 שעות. ביום השישי, התאים יהיו מוכנים לניסויים נוספים. בתמונות המיוצגות כאן.החלונית הראשונה של הקטע אסטרוציטים מוכתמים ב- GFAP, בצבע ירוק. בלוח השני, של קטע כתם microglia עם RCA, ירוק בצבע. בחלק B microglia מוכתם RCA, שהוא ירוק בצבע, ואסטרוציטים מוכתמים GFAP, אדום בצבע.שכבת-על של התמונות מציגה מיקרוגליה ואסטרוציטים יחד. ברור מן התמונות כי רוב התאים בתרבות מוכנים הם microglia. התמונות כומתו על ידי שליטה עיוורת והתוצאה מיוצגת בסעיף C.התוצאות הראו כי כ -80% מהתאים בתרבות שהוכנו הם תאי מיקרוגליה.טכניקה זו יכולה להתבצע בערך שעה וחצי. בעקבות הליך זה צריכה להיות הבנה טובה של איך אני בוחר microglia priming מרקמות המוח האנושיות הבוגרות, אשר ניתן להשתמש בהם עוד יותר עבור ניסויים במורד הזרם.

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

מחקר זה מתווה גישה חדשנית להקמת תאים דמויי מיקרוגליה (iMG) שמקורם במונוציטים אנושיים המאפשרים הערכה עקיפה של דלקת במוח. זה מציג מודל תאי שעשוי להועיל למחקר המתמקד בדלקת פוטנציאלית במוח ובהפרעות נוירופסיכיאטריות נלוות.

הנדסה של תאים דמויי מיקרוגליה המושרים על ידי דם אנושי לחקר המוח בתרגום לאחור

למדו שיטה יעילה לבידוד מיקרוגליה ראשונית מרקמת מוח אנושית בוגרת שנאספה בניתוח. הפרוטוקול מספק תפוקה גבוהה של כ-80% תאי מיקרוגליה לחקירה נוירו-מmunולוגית.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

גלה סרטונים נוספים